Susanna Vichi Dip. Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria Rep. Meccanismi di Tossicità ISS

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1 Corso teorico-pratico per la sorveglianza delle fioriture dei cianobatteri negli ambienti acquatici Istituto Superiore di Sanità, gennaio 2011 Susanna Vichi Dip. Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria Rep. Meccanismi di Tossicità ISS

2 APPROCCIO MOLECOLARE nel monitoraggio ambientale Identificazione di cianobatteri sin dalle fasi più precoci della colonizzazione attraverso identificazione tassonomica delle specie Rilevazione e quantificazione del potenziale tossico (eventuale) delle specie presenti Elevato Polimorfismo fenotipico nell ambito di uno stesso phylum Nell ambito della stessa specie coesistono individui tossici e non tossici Gli individui in grado di produrre tossina sono morfologicamente indistinguibili da quelli che non ne sono capaci casi di fioriture non tossiche La capacità di produrre cianotossine: - dipende dal make up genetico di un individuo - è un processo dinamico

3 Approcci molecolari comuni nella determinazione di cianobatteri Analisi quali/quantitativa: Bioinformatica: PCR PCR-RFLP DGGE PNA assay qpcr - SYBR Green chemistry - TNA assay, Sequenziamento, Allineamento

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5 CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DI CIANOBATTERI: 1. Definizione TASSONOMICA degli individui attraverso la ricerca di specifiche sequenze marker diagnostiche Determinazione del phylum di appartenenza (genere, specie, ceppo) 2. Definizione di specifiche sonde molecolari per l identificazione di SPECIE TOSSICHE attraverso la ricerca di geni che codificano per la produzione delle tossine Determinazione e quantificazione del potenziale tossico (eventuale) di una popolazione

6 1. Definizione TASSONOMICA e analisi filogenetica di campioni ambientali (a livello di genere, specie, ceppo): Geni housekeeping come marker filogenetici: Amplificazione dell INTERGENIC SPACER nell operone FICOCIANINA PC-IGS cpcb cpca cpcc cpcd cpce 2 biline α e β 3 peptidi linker

7 Amplificazione all interno del gene per l rrna 16S: Ottima stabilità, affidabilità Primers universali PCR Analisi RFLP disegnati in regioni ben conservate Rischio: L analisi della sequenza 16S rrna può essere non sufficientemente sensibile nella discriminazione di specie strettamente correlate Amplificazione di altri marcatori (geni nif, rpoc1, gyrb)

8 Es: saggio qualitativo. Identificazione di comunità cianobatteriche in campioni ambientali Campione ambientale Estrazione acidi nucleici (DNA-RNA) PCR Amplificazione della regione rdna 16S come marcatore genere-specfico (es. Planktothrix) ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO Lane 1 = assenza di Planktothrix Lane 2,3,4 = Planktothrix Lane 5 = bianco Lane 6 = ladder

9 J. F. Humbert et al., Definizione di specifiche sonde molecolari per la ricerca di genotipi tossici Produttori di MCs Ricerca di specifici geni marker (mcy), raggruppati in cluster, che codificano per grandi complessi multienzimatici (NRPS o Peptide Sintetasi Non Ribosomali) coinvolti nella biosintesi delle Microcistine. Cluster mcy per la biosintesi delle microcistine Microcystis, Planktothrix e Anabaena: raggruppa i geni che codificano per diversi domini del complesso multienzimatico della MICROCISTINA SINTETASI

10 Attenzione alla presenza di polimorfismi genetici nella scelta del marcatore! Verificare presenza di delezioni/inserzioni nel cluster mcy in grado di alterare la funzionalità del prodotto proteico Es: Ricerca di microcistine in relazione alla presenza di marcatori mcy in colture di P. agardhii e P. rubescens (S. Mbedi et al., 2005). Ceppo cianotossina mcyt mcytd mcya mcyb mcye P. agardhii HUB076/A P. agardhii LAN2 P. agardhii Max01 P. agardhii Max02 P. agardhii Max08 P. rubescens BL1 P. rubescens BL P. rubescens HUB = falsi positivi - = falsi negativi

11 Produttori di CYN Depiction of the aoaa, aoab and aoac genes from Aphanizomenon ovalisporum (da Rasmussen et al. 2008). Identificate 2 sequenze coinvolte nella produzione di CYN, con funzione ps e pks, all interno dei geni aoaa, aoab, e aoac. Indicatori di tossicità in ceppi di Cylindrospermopsis raciborskii, Anabaena bergii e Aphanizomenon ovalisporum. - Fergusson and Saint 2003, Multiplex PCR Assay specie-specifico per cianobatteri produttori di CYN appartenenti a C. raciborskii (colture isolate e campioni ambientali)

12 J.P. Rasmussen et al, 2008

13 Es. Approccio quantitativo. Ricerca e quantificazione di genotipi tossici appartenenti a P. rubescens in campioni ambientali mediante qpcr. Campione ambientale Cellule concentrate su filtro e congelate a -20 C Risospensione cellule Centrifugazione - pellet Estrazione DNA totale Determinazione concentrazione e purezza Taq Nuclease Assay

14 Taq Nuclease Assay (TNA) Il TaqMan probe si lega alla sequenza target nella fase di annealing e viene idrolizzato dall attività 5 3 esonucleasica della Taq polimerasi. Il rilascio del segnale reporter ad ogni ciclo di amplificazione permette la rilevazione/quantificazione del DNA target. 16S mcyb Amplificazione selettiva DNA regione rdna 16S: total-p. rubescens Amplificazione selettiva DNA mcyb: only toxic-p. rubescens Quantificazione dei risultati: metodo della standard curve basata su diluizioni seriali di DNA a concentrazione nota (equivalenti di cell.) n copie mcyb / n copie 16S = frazione cell tossiche

15 Consultazione database di sequenze: supporto indispensabile nella identificazione di comunità microbiche BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) BLAST è un algoritmo ottimizzato per ricercare regioni di locale omologia tra sequenze presenti nel database. * Target gene PC-IGS mcya mcye PC-IGS (Real time PCR) mcyb (Real time PCR) Designation Sequences to Amplicon size (bp) Ref. PC_F TGCTGTCGCCTAATTTTTCA PC_R CCACTGATCAGGCTGTCAGA mcya_f ATCAAACAGATGTACTGACAGGT mcya_r AGGCCAGACTATCCCGTT mcye_f TTACCTAATTATCCCTTTCAAAG mcye_r CAATGGGTAAGGTTTGCTT PlPc_F GCAGGAATTACTCCTGGAGATTGT PlPc_R GCCGCAGCGAGATCAAAG PlPc_probe FAM-CGCTCTGGCTTCTGAAGTCGCCG-TAMRA Pl-mcyB_F Pl-mcyB_R mcyb_prob e ATTGCCGTTATCTCAAGCGAG TGCTGAAAAAACTGCTGCATTAA FAM-TCAGAGGAAAGAGCTTCACCTCCACAAAAA-TAMRA 76 10

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19 Manganelli et al., Water research 2010;44(5): Rapporto ISTISAN 08/6