METODI DI ANALISI PER LA RICERCA DI OGM

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1 METODI DI ANALISI PER LA RICERCA DI OGM Mariella Goria ASL TO4 Sicurezza alimentare, Analisi del rischio di alimenti e mangimi geneticamente modificati Ivrea, 7 giugno 2017

2 OGM: chi? Il regolamento (CE) n. 1829/2003 «relativo agli alimenti e ai mangimi geneticamente modificati» riprende la definizione di «organismo geneticamente modificato» o «OGM» dall art. 2, punto 2 della direttiva 2001/18/CE. un organismo, diverso da un essere umano, il cui materiale genetico è stato modificato in modo diverso da quanto avviene in natura con l accoppiamento e/o la ricombinazione genetica naturale. OGM?

3 OGM Le principali modificazioni riguardano la resistenza agli erbicidi e la resistenza ad insetti

4 OGM DETERMINA QUANTO DOVE E QUANTO VIENE ESPRESSO IL GENE CONTROLLA LA TERMINAZIONE DELLA TRASCRIZIONE DEL GENE

5 INCREMENTO OGM Numero di eventi Aree coltivate Specie vegetali Elementi di inserzione Metodi di analisi Tecnologie

6 Legislazione Europea AUTORIZZAZIONE Agenzia Europea per la Sicurezza Alimentare EFSA ETICHETTATURA TRACCIABILITA Capacità di tracciare OGM ed i prodotti derivati in tutte le fasi della commercializzazione Obbligo di etichettatura quando il materiale GM > 0.9% rispetto all ingrediente/componente dell alimento/mangime Etichettatura non obbligatoria quando il materiale GM 0.9%, purché tale presenza sia accidentale o tecnicamente inevitabile

7 OGM AUTORIZZATI Nel circuito convenzionale gli OGM autorizzati possono essere ingredienti di alimenti e mangimi, purché correttamente dichiarati in etichetta, mentre nel circuito biologico vige il divieto di impiego di OGM. Etichettatura per OGM Autorizzati Soglia di etichettatura dello 0.9% per gli alimenti e mangimi del circuito convenzionale: (Regolamenti CE n 1829/2003 e 1830/2003) - Obbligo di etichettatura specifica quando il materiale GM > 0,9% rispetto al singolo ingrediente/componente. - L etichettatura non è obbligatoria quando il materiale GM < 0,9%, purché tale presenza sia accidentale o tecnicamente inevitabile

8 OGM AUTORIZZATI 15 eventi soia > 40 eventi mais 4 eventi colza 10 eventi cotone 1 evento barbabietola da zucchero

9 OGM AUTORIZZATI Nel circuito convenzionale gli OGM autorizzati possono essere ingredienti di alimenti e mangimi, purchécorrettamente dichiarati in etichetta, mentre nel circuito biologico vige il divieto di impiego di OGM. Divieto di impiego di OGM e prodotti derivati o ottenuti da OGM Soglia di TOLLERANZA dello 0.9% Reg. (CE) 834/2007

10 OGM NON-AUTORIZZATI Vige il divieto di immissione sul mercato senza autorizzazione ai sensi della normativa EU Nessuna soglia di tolleranza

11 OGM NON-AUTORIZZATI Nei Piani Nazionali vigenti per la ricerca di OGM non autorizzati a titolo esemplificativo sono ricercati: le linee di riso LL601,BT63, KeFeng6, il lino FP967, i mais Bt176, LY038, DAS il frumento (solo in granella) presso i porti. Nuovi eventi di trasformazione non autorizzati potrebbero circolare Si raccomanda la consultazione del sito RASFF(Rapid Alert System for Food and Feed) Si raccomanda la consultazione del sito web del Laboratorio Europeo di Riferimento (EURL)

12 Piani Nazionali di Controllo Ufficiale sulla presenza di OGM nei Mangimi(PNAA ) e negli Alimenti (PNAOGM )

13 il Controllo Ufficiale: dai Piani Nazionali al PRISA 2017

14 New entry Verbale unico prelevamento campioni alimentari - chimici

15 Verbale unico prelevamento campioni alimentari chimici Allegato C Scheda OGM

16 Contenuti dei Piani Ufficiali Organizzazione delle ispezioni( controlli documentali) Indicazione numero di campioni assegnato per Regione Indicazione della tipologia di matrici da sottoporre a controllo Modalità di campionamento da adottare Indicazione dei laboratori controllo ufficiale e relativi referenti

17 ORGANISMI PREPOSTI AL CONTROLLO UFFICIALE

18 SCOPO del controllo Verificare l ottemperanza alla Normativa Comunitaria e Nazionale su alimenti e mangimi GM nel mercato europeo Ottemperanza ai requisiti in materia di autorizzazione Ottemperanza ai requisiti di etichettatura e di tracciabilità Ottemperanza al divieto di OGM nel biologico

19 DAL 1999 AD OGGI. quasi 20 ANNI DI ATTIVITA PCR END POINT REAL TIME-PCR ddpcr

20 METODI per il CONTROLLO ANALITICO per la presenza di OGM DNA PCR PROTEINE TECNICHE IMMUNOENZIMATICHE ELISA

21 METODI per il CONTROLLO ANALITICO ELISA TECNICHE IMMUNOENZIMATICHE per la presenza di OGM PCR Facile esecuzione Rapidità analisi Poco costosi Bassa sensibilità Non applicabile su prodotti finiti Elevata sensibilità e specificità Applicabile alla maggior parte delle matrici (alimenti, mangimi...) Quantitativa Costosa Necessita attrezzature adeguate

22 ACCETTAZIONE PREPARAZIONE DEL CAMPIONE DI ANALISI MACINAZIONE / ESTRAZIONE DNA FLUSSO DI LAVORO PER LA RICERCA di OGM RILEVAZIONE GENI ENDOGENI NEG CAMPIONE NON ANALIZZABILE POS PER UNA O PIU SPECIE VEGETALI SCREENING OGM POS /NEG PER UNO O PIU ELEMENTI IDENTIFICAZIONE EVENTI TARGET POS NEG GM > 0,9% QUANTIFICAZIONE GM < 0,9% CAMPIONE REGOLAMENTARE POS EVENTO NON AUTORIZZATO CAMPIONE NON REGOLAMENTARE CAMPIONE NON REGOLAMENTARE CAMPIONE REGOLAMENTARE

23 L Attività del Laboratorio Controllo dei verbali Controllo etichettatura per la presenza degli ingredienti (soia, mais, colza, barbabietola, lino, cotone, patata e riso) dichiarazioni in conformità alla normativa Preparazione campione per l analisi Estrazione del DNA dal campione Attivitàanalitica Determinare la presenza dei geni endogeni e controllo amplificabilità Determinare la positivitàper gli elementi di screening Determinare la presenza dell evento GM Quantificare la presenza dell evento GM rilevato

24 Controllo dei verbali Verifica adeguatezza del campionamento Verifica indicazione del circuito (biologico-convenzionale) Verifica della congruità della richiesta Controllo etichettatura Individuare la presenza di soia, mais, riso negli ingredienti e delle diciture di legge

25 VOLUMI ATTIVITA NELL ANNO PLV MONITORAGGIO ASL PIF USMAF TOTALE Frontaliero PIF Frontaliero USMAF Piano nazionale OGM alimenti PNAA extrapiano MONITORAGGIO PNAA MONITORAGGIO PNAA SORVEGLIANZA TOTALE

26 VOLUMI ATTIVITA NELL ANNO PLV MONITORAGGIO ASL PIF USMAF TOTALE Frontaliero PIF Frontaliero USMAF Piano Nazionale OGM alimenti PNAA extrapiano MONITORAGGIO PNAA MONITORAGGIO 45* * PNAA SORVEGLIANZA TOTALE * 1 non conformità(mangime completo)

27 ATTIVITA verifica verbali NON IDONEI 60 (26,4%) 99 (42,3%) Non eseguibili 12 (20%) 15 (15,15%)

28 TIPOLOGIE di ERRORE al campionamento: * più di un errore per verbale

29 Quando le operazioni di campionamento non si concludono presso il sito di prelievo Matrici in granella (soia, mais, riso, lino, patata, ) Omogenizzazione/Macinazione presso centro attrezzato del campione globale allestito presso il sito di prelievo, eventualmente con delega all Autorità Competente più logisticamente vicina alla sede del centro per la macinazione. Verbale per le operazioni di allestimento del campione finale

30 CAMPIONE FINALE IN ALIQUOTE CAMPIONE GLOBALE MACINAZIONE/ OMOGENEIZZAZIONE

31 Estrazione del DNA dal campione analitico: Eterogeneitàdelle matrici METODO CTAB KIT del commercio UNI EN ISO 21571/2005 Il controllo quali-quantitativo del DNA estratto Controllo elettroforetico (qualitativo) Migrazione del Dna in campo elettrico in virtù della sua carica con una velocità inversamente proporzionale al peso molecolare Controllo spettrofotometrico ( quantitativo) [DNA]ng/µL= A 260 * 37 ratio 260/280 : 1,8 <r 260/280 <2.00 SELEZIONE del METODO di ESTRAZIONE in FUNZIONE della MATRICE: buona resa elevata purezza ridotta degradazione

32 IL PERCORSO ANALITICO PCR REAL TIME Uso di sonde di ibridazione (TaqMan) legate a molecole fluorescenti Monitoraggio in tempo reale

33 PCR REAL TIME Permette di visualizzare l incremento del numero di copie di DNA bersaglio in funzione del numero dei cicli Taq R Q R Taq Q R Q Taq

34 PCR REAL TIME PCR REAL TIME

35 IL FLUSSO ANALITICO PER LA RICERCA di OGM i 3 LIVELLI FONDAMENTALI RILEVAMENTO GENI ENDOGENI NEG CAMPIONE NON ANALIZZABILE POS PER UNA O PIU SPECIE VEGETALI IDENTIFICAZIONE EVENTI TARGET POS /NEG PER UNO O PIU ELEMENTI NEG CAMPIONE REGOLAMENTARE POS EVENTO NON AUTORIZZATO CAMPIONE NON REGOLAMENTARE POS QUANTIFICAZIONE GM < 0,9% GM > 0,9% CAMPIONE NON REGOLAMENTARE CAMPIONE REGOLAMENTARE

36 Il percorso analitico 1. Determinare la presenza dei geni endogeni e controllo amplificabilità gene HMG presente sia nella specie geneticamente modificata sia nella specie naturale La monitor PCR specie-specifica, detta anche Inhibition run fornisce evidenza della presenza, nel campione, di DNA amplificabile appartenente alla specie vegetale dichiarata in etichetta o nel documento commerciale. Valutazione del Ct tra le curve a differente concentrazione Pos Presenza DNA di mais Neg DNA della specie assente

37 IL PERCORSO ANALITICO 1. Determinare, per ogni specie vegetale indicata negli ingredienti in etichetta, la presenza dei geni endogeni e controllo amplificabilità MAIS SOIA COTONE COLZA BARBABIETOLA LINO PATATA RISO HMG LECTINA ACP1 CRUA GS SAD UGP-ase PLD

38 2.L ANALISI di SCREENINGper la presenza di OGM Determinare la presenza di marcatori amplificazione DNA bersaglio: PROMOTORE 35S DEL VIRUS DEL MOSAICO DEL CAVOLFIORE (CaMV) TERMINATORE NOS DEL GENE NOPALINA SINTETASI di Agrobacterium tumefaciens GENE cp4-epsps DERIVATO DAL CEPPO CP4 di Agrobacterium tumefaciens COSTRUTTO ctp-cp4epsps(chloroplast TRANSIT PEPTIDE) GENE NPTII, DERIVATO DA Escherichia coli GENE PAT, DERIVATO DA Streptomyces viridochromogenes No marcatori

39 3. Individuare EVENTI SPECIFICI sulla base degli elementi di screening: dal rilevamento generico dei marcatori alla individuazione delle linee GM specifiche

40 4. Determinare la presenza dell evento GM Tipologia di rilevamento specifico (utilizzo primers e sonde per specifico evento GM) SPECIE VEGETALE EVENTO GM MAIS GA21 MAIS BT11 MAIS NK603 MAIS T25 MAIS MON863 MAIS MON810 MAIS DAS59122 MAIS DAS1507 MAIS Bt176 SOIA MON SOIA A SOIA MON87788 SOIA DP SOIA A SOIA MON87701 SOIA DP SOIA CV SOIA FG72 BARBABIETOLA H7 SPECIE VEGETALE EVENTO GM COTONE MON1445 COTONE MON15985 COTONE MON531 COTONE LL25 COTONE GHB614 COTONE X COTONE MON88913 COTONE GHB119 COTONE T EVENTI (ALCUNI IN CORSO DI VALIDAZIONE) COLZA

41 5. nel caso di identificazione di eventi specifici: QUANTIFICAZIONE % OGM= (ng evento GM/ng Endogeno)x100 NEL CASO DI EVENTO AUTORIZZATO SE SUPERA LA SOGLIA DELLO 0,9% CAMPIONE NON REGOLAMENTARE NEL CASO DI EVENTO AUTORIZZATO SE INFERIORE ALLA SOGLIA DELLO 0,9% CAMPIONE REGOLAMENTARE

42 Espressione dei risultati Per i geni endogeni: RILEVATO/NON RILEVATO DNA della SPECIE VEGETALE ingrediente Per le prove qualitative di screening (marcatori) e di evento GM: RILEVATO/NON RILEVATO per ciascun MARCATORE RILEVATO/NON RILEVATO per ciascun EVENTO GM Per le prove quantitative evento-specifiche: x % EVENTO GM(con dichiarazione dell incertezza di misura)

43 RICERCA di OGM Interpretazione dei risultati RILEVAZIONE GENI ENDOGENI NEG CAMPIONE NON ANALIZZABILE / neg x ingrediente POS PER UNA O PIU SPECIE VEGETALI SCREENING OGM IDENTIFICAZIONE EVENTI TARGET POS /NEG PER UNO O PIU ELEMENTI POS NEG POS EVENTO NON AUTORIZZATO CAMPIONE NON REGOLAMENTARE QUANTIFICAZIONE GM > 0,9% GM < 0,9% CAMPIONE REGOLAMENTARE CAMPIONE NON REGOLAMENTARE CAMPIONE REGOLAMENTARE

44 RACCOLTA DATI A LIVELLO NAZIONALE Gestione per conto del Ministero della Salute della Banca Dati relativa al controllo ufficiale degli OGM Rendicontazioni attività nazionale Pianificazione attività future

45 PROSSIMAMENTE Utilizzo piattaforma di PCR digitale (QX100 droplet digital PCR BIORAD) per la quantificazione assoluta del bersaglio analitico Permette la rilevazione e la quantificazione precise della quantità di acidi nucleici formati durante la reazione di amplificazione del target 1. trasformazione e ripartizione del campione in migliaia di gocce 2. amplificazione dell emulsione 3. lettura e analisi attraverso la statistica di Poisson

46 ddpcr Visualizzazione fluorescenza del Canale 1 (FAM-transgene) e Canale 2 (HEX-lectina) Distribuzione del segnale

47 PCR real-time quantitativa Necessaria curva di calibrazione Necessità materiali di riferimento certificati. La concentrazione di acidi nucleici può essere determinata in misura degli standard. vs Digital PCR Altamente sensibile ed accurata Può essere utilizzata efficacemente nella misura assoluta degli acidi nucleici, della rilevazione rara del gene e della quantificazione assoluta di espressione genica Misura il numero delle molecole direttamente contando la fluorescenza positiva in compartimenti. ELEVATE POTENZIALITA

48 OGM 2.0 NUOVE TECNICHE DI MIGLIORAMENTO GENETICO per i VEGETALI NEW BREEDING TECHNIQUES (NBTs) Queste tecniche fanno ricorso a metodi (gene editing) che sfruttano i meccanismi naturali della piante per «correggere» errori nei processi di sintesi del DNA: quindi i prodotti ottenuti non presentano sequenze geniche esogene come nei tradizionali OGM.

49 OGM 2.0 NEW BREEDING TECHNIQUES (NBTs): What are we talking about? Editing genetico Da meccanismo immunitario naturale a potente strumento biotecnologico Sfrutta la capacità della macchina cellulare di riconoscere gli errori nel Dna durante la replicazione e correggerli. N.B: tecnica che non comporta l inserzione di Dna estraneo nella pianta Prodotti del genome editing risultano non distinguibili rispetto al prodotto di una mutazione spontanea o indotta.

50 In ambito vegetale, il sistema CRISPR/Cas permette anche di generare piante con migliori caratteristiche nutrizionali o resistenti a patogeni. Sebbene alcuni risultati siano già in parte possibili con incroci tradizionali, il sistema CRISPR/Cas è molto più specifico e permette di ottenere i risultati in pochi mesi anziché anni. With transgene-free genome-edited plant you can have the genetic change where you want and furthermore every gene conferring bad traits can be selectively knocked-out Prof. Piero Morandini, UNIMI

51 NBTs: OGM oppure no? In ambito agronomico, il metodo CRISPR/Cas scatena meno problemi etici ma sta complicando l aspro dibattito sugli OGM. Le mutazioni introdotte da questa tecnica possono infatti essere così piccole e localizzate da diventare indistinguibili da quelle naturali, dovute cioè a fattori di stress come un eccessivo irraggiamento solare. Queste mutazioni sarebbero sufficienti per classificare tali piante come OGM? Per ora, gli Stati Uniti sembrano propendere per il no, mentre in Europa si va in direzione del sì, in quanto per l Unione Europea un OGM è definito tale non in base alle caratteristiche finali del prodotto ma in base alla tecnologia scelta per generarlo. Nella Direttiva 2001/18/CE del Parlamento europeo e del Consiglio del 12 marzo 2001 si legge infatti che OGM è ogni organismo il cui materiale genetico è stato modificato in modo diverso da quanto avviene in natura con l accoppiamento e/o la ricombinazione genetica naturale. Sarà necessario colmare il vuoto legislativo sia in Europa sia nel resto del mondo, in modo da disciplinare la produzione e l immissione sul mercato di questi prodotti.

52 vs OGM 2.0 Grazie per l attenzione

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