A Profile of Coenzyme B 12 Interest Slide

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1 A Profile of Coenzyme B 12 Interest Slide Coenzyme B 12 is the enzyme form of vitamin B 12 Deficiency leads to anemia, and CNS impairment Unique since it contains a cobalt ion It helps catalyze an isomerization of hydrogen and another group between carbons Structure was determined in 1956 by X-ray crystallography Dorothy Crowfoot Hodgkin

2 A Profile of Coenzyme B 12 Cobalt Co 3+ chelates to the nitrogens of the corrin ring and catalyzes the reaction The corrin ring resembles the porphyrin ring system that chelates iron and carries O 2 and CO 2 through the blood Dorothy Crowfoot Hodgkin 1956

3 Regulation 1. Fat mobilization is regulated by hormones and is related to blood glucose levels 2. Regulation of Fatty Acid Oxidation - Considerations Tightly regulated fat is a precious fuel Compartmentalization: Fatty acyl-coa used for: 1. Synthesis of Triacylglycerols (cytosol) 2. Oxidation to Acetyl-CoA (mitochondria) The rate-limiting step is transport to the mitochondria Once in the mitochondria, FAs will be oxidized Malonyl CoA (first step in FA anabolism) shuts down transport to the mitochondria, cutting off β-oxidation Two enzymes are regulated by metabolites that signal energy sufficiency ([NADH]/[NAD + ] and acetyl-coa)

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5 METABOLISMO del COLESTEROLO

6 COLESTEROLO MOLECOLA FONDAMENTALE PER IL NOSTRO ORGANISMO Colesterolo. unico sterolo sintetizzato dagli animali Le piante sintetizzano diversi steroli (fitosteroli)

7 ALCOL Gruppo alcolico esterificato con acido grasso es. nelle lipoproteine

8 DIETA Colesterolo deriva dalla presente soltanto in alimenti di origine animale nelle piante: fitosteroli dalla dieta: 50 mg/die vegetariani -> 400 mg/die INRAN, Linee guida USA mg/die (adulti) BIOSINTESI mg/die in tutti i tessuti (fegato, intestino, pelle TURNOVER GIORNALIERO 800 mg/die COLESTEROLO TOTALE 100 g 5 % ematico, 95 % cellulare

9 FUNZIONI strutturale Supporto strutturale e carattere idrofobico alle membrane precursore - acidi biliari (400 mg/die) VIA CATABOLICA - ormoni steroidei (cortisolo, aldosterone, ormoni sessuali) - vitamina D EFFETTI DANNOSI molecola apolare, assolutamente insolubile in acqua - se precipita, non più rimovibile con conseguente danno cellulare - se si accumula in modo errato nelle arterie non può più essere rimosso; i livelli ematici devono rimanere bassi Stretta correlazione fra livelli di colesterolo ematico e rischio di malattia coronarica

10 FEGATO: organo primario nella omeostasi del colesterolo omeostasi epatica studiata da oltre 30 anni biosintesi enzima chiave HMGCoA reduttasi catabolismo enzima chiave colesterolo 7α idrossilasi captazione dal circolo recettori per le lipoproteine Vie coordinate dai livelli di colesterolo ENTEROCITA studiata negli ultimi anni CAPTAZIONE ed EFFLUSSO DAL LUME INTESTINALE Biosintesi Formazione dei chilomicroni

11 J. Biol Chem 1974 Binding and degradation of LDL by cultured human fibroblats: comparison of cells from normal subjects and from patients with homozygous Familial Hypercholesterolemia Michael Brown e Joseph Goldstein Univ Dallas, Texas - Nobel Prize 1985 the decision letter from Associate Editor Eugene Kennedy: -It is my considered opinion that publication of this paper would not serve medical science neither would it earn credit in the long run to its authors In elegant and systematic studies you have discovered a physiological mechanism of great importance: the way in which mammalian cells strive to establish an equilibrium between their own synthesis of cholesterol and the cholesterol they obtain from the circulating blood influenced by diet. You have also demonstrated something else: how successful cooperation can be a principle that should perhaps be more widely applied, both in science and in other areas of human endeavour.

12 acetato CH 3 I 3 HC-C=CH-CH 3 isoprene polimerizzazione terpene

13 acetilcoa ATP, NADPH isoprene (5 atomi di carbonio) polimerizzazione squalene (30 atomi di carbonio) C I C-C=C-C STRATEGIA della VIA BIOSINTETICA RETICOLO ENDOPLASMATICO CH 2 CH 2 O 2 3 HC CH 3 lanosterolo Prodotto di ciclizzazione (30 atomi di carbonio) HO CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 3 HC O 2 NADPH CH 3 CH 3 colesterolo (27 atomi di carbonio) HO

14 1. Condensazione di 3 unità di acetato a dare un intermedio a 6 atomi di C, il mevalonato Tappa regolatoria e limitante: riduzione della HMGCoA a mevalonato 2. Conversione del mevalonato in unità isopreniche attive 3. Polimerizzazione di 6 unità isopreniche a 5 atomi di C a formare un catena lineare a 30 atomi di C (squalene) 4. Ciclizzazione dello squalene per dare la struttura steroidea, seguita da una ulteriore serie di modificazioni che portano al colesterolo

15 LA BIOSINTESI RICHIEDE Acetil CoA mitocondriale - piruvato (da glucosio) - β-ossidazione acidi grassi esportato dal mitocondrio sotto forma di citrato citrato + ATP + CoASH + citrato liasi --> ossalacetato + acetil CoA + ADP + Pi NADPH + H + - via dei pentosi fosfati (glucosio) - enzima malico ossalacetato + NADH malato + NAD + malato + NADP + + H 2 O + enzima malico piruvato + HCO NADPH + H + ATP fosforilazione ossidativa IMPORTANZA DEL GLUCOSIO NELLA SINTESI DEL COLESTEROLO

16 1. Conversione di 3 composti C2 (acetil CoA) in un composto C6 (mevalonato) CoA-SH CO-S-CoA + CH 3 HMG~CoA CH 3 C=O sintasi CH 2 CO -S-CoA * * acetil CoA acetoacetil CoA COO - CH 2 HO-C-CH 3 2NADPH + H + 2NADP + CoA-SH CH 2 CO -S-CoA idrossimetil glutaril ~ CoA (HMG~CoA) HMG ~CoA reduttasi COO - CH 2 HO-C-CH 3 CH 2 CH 2 O H mevalonato HMG~CoA reduttasi PUNTO DI CONTROLLO DEL PROCESSO BIOSINTETICO

17 2. Conversione del composto C6 a C5 (isoprene attivato) Tre tappe di fosforilazione con il consumo di 3 ATP COO - CH 2 HO-C-CH 3 ATP ADP mevalonato chinasi ATP ADP COO - fosfomevalonato COO - CH 2 HO- C-CH 3 chinasi CH 2 HO- C-CH 3 CH 2 CH 2 O H CH 2 CH 2 -O-PO 3 H CH 2 CH 2 -O-P~P mevalonato 5 fosfomevalonato 5 pirofosfomevalonato ATP ADP + Pi CO 2 CH 2 CH 3 II I C - CH C - CH 3 3 pirofosfomevalonato isopentenilpirofosfato CH CH decarbossilasi 2 isomerasi CH 2 -O-P ~P CH 2 -O-P ~P 3 isopentenilpirofosfato dimetilallilpirofosfato isoprene attivato

18 3. Polimerizzazione della molecola isoprenica C5 testa -coda C5 C10 + dimetilallilpirofosfato Isopentenil pirofosfato PPi prenil transferasi geranilpirofosfato 2 X C15 C30 testa-testa PPi prenil transferasi farnesilpirofosfato NADPH + H + NADP + + 2PPi squalene sintasi squalene

19 4. Ciclizzazione dello squalene a lanosterolo e conversione a colesterolo O 2 NADPH + H NADP + + Squalene epossidasi H2 O squalene H + squalene epossido Squalene epossido ciclasi lanosterolo 19 reazioni (NADPH e O 2 ) rimozione 3 metili (due in C4 ed uno in C14) come CO 2 saturazione doppio legame (catena laterale) spostamento doppio legame (8,9 5,6)

20 Altre biosintesi che utilizzano la molecola isoprenica selenoproteine trna Sec trasduzione del segnale Proteine isoprenilate (Ras) farmaci antitumor ali isopenteniladenosina Dolicolo-P unità Eme a citocromo c ossidasi CoQ 10 o ubichinone + Tyr Colesterolo Proteine N- glicosilate (immunoglobuline) Trasporto elettroni mitocondriale Antiossidante lipofilo ormoni vitamina D acidi biliari membrane

21 Il colesterolo importato blocca la sintesi del colesterolo e del recettore per le LDL

22 REGOLAZIONE DELLA ATTIVITA DELLA HMG~CoA REDUTTASI

23 VARIAZIONI d ATTIVITA dell HMGCoAR FINO A 200 VOLTE I. modulazione attività catalitica tramite inibizione da prodotto mevalonato farmaci (statine) II. modificazione covalente tramite fosforilazione/defosforilazione che dipende dallo STATO ENERGETICO DELLA CELLULA forma non fosforilata più attiva forma fosforilata meno attiva - chinasi AMP dipendente (AMPK) ATP/AMP 50 piccole variazioni [ATP] portano grandi variazioni [AMP] calo in [ATP] calo nella sintesi di colesterolo e ac. grassi III. modulazione dei livelli proteici tramite degradazione e biosintesi sotto il controllo dei livelli cellulari di colesterolo via principale

24 STATINE Inibitori competitivi della HMG CoA reduttasi X O HO COO - OH HO COO - OH H 3 C R = CH 3 X= H lovastatina CH 3 O CH 3 R = CH 3 X= CH 3 simvastatina R sono i composti più efficaci per livelli di LDL (~ 50%) sintesi colesterolo sintesi del recettore per le LDL (effetti modesti HDL) effetti positivi o negativi a prescindere dal colesterolo anti-infiammatori anti-aggreganti miopatia (coenzima Q? canali ionici? proossidante e perossidazione lipidica? apoptosi?) neuropatia, disturbi intestinali

25 REGOLAZIONE dei LIVELLI di HMG~COA REDUTTASI controllo feedback da parte del colesterolo DEGRADAZIONE e BIOSINTESI REGOLATE dai LIVELLI CELLULARI DI COLESTEROLO (tramite sensori dei livelli di colesterolo del R.E.) tramite PROTEOLISI CONTROLLATA

26 HMG~CoA reduttasi 2 DOMINI dominio idrofilico citosolico C-terminale -catalitico dominio idrofobico N-terminale ancorato al R.E. che contiene un dominio sensibile agli steroli - importante per la stabilità DEGRADAZIONE accelerata in presenza di alti livelli colesterolo tramite sistema ubiquitina-proteasoma (emivita HMGCoAR ~3,5 h)

27 BIOSINTESI: regolazione trascrizionale tramite i fattori di trascrizione Sterol Regulatory Element - Binding Protein SRE-BP Legano sequenze SRE Sterol Regulatory Element presenti nel promotore di geni coinvolti nella biosintesi di acidi grassi e colesterolo 2 isoforme sintetizzate da due distinti geni SRE-BP1c biosintesi di trigliceridi SRE-BP2 biosintesi di colesterolo e recettori LDL

28 SCAP - SREBP- Cleavage Activating Protein SENSORE DEL COLESTEROLO contiene sterol-sensing domain (omologo a dominio della HMGCoA-R) Alti livelli colesterolo - Interazione Insig - SCAP e blcco di SREBP - nel RE cytosol ER Bassi livelli di colesterolo Complesso SCAP-SREBP N-terminale - forma solubile attiva nucleare cytosol GOL GI S1P = proteasi del sito 1 S2P = proteasi del sito 2

29 SCAP proteina tetramerica che risponde in maniera cooperativa ai livelli di colesterolo: coefficiente di Hill 3,5 (alta cooperatività) e quindi piccole variazioni in colesterolo sufficienti a indurre una risposta aattativa Arun Radhakrishnan1 et al. Cell metabolism 2008

30 REGOLAZIONE GLOBALE ALTI LIVELLI DI COLESTEROLO DEL R.E. PORTANO A 1. Aumento della degradazione di HMG-CoA reduttasi 2. Diminuzione della attivazione di SRE-BP SI ABBASSANO I LIVELLI BASSI LIVELLI DI COLESTEROLO DEL R.E. PORTANO A 1. Più lunga emivita di HMG-CoA reduttasi 2. Aumento della attivazione di SRE-BP SI INNALZANO I LIVELLI

31 Regolazione epatica intermediate-density lipoprotein IDL SATURAZIONE RECETTORE CALORIE TOTALI TRIGLICERIDI COLESTEROLO DIETA IPOCALORICA DIGIUNO

32 CATABOLISMO

33 SALI BILIARI. Prodotti del CATABOLISMO Funzione nell assorbimento dei lipidi acido taurocolico Idrossilato in C3, C7, C12 7α-idrossilasi

34 Regolazione del catabolismo: Acido ascorbico O 2 H 2 O acido deidroascorbico R.E. Colesterolo 7α -idrossicolesterolo 7α-idrossilasi (CYP7A1) CYP7A1 - indotta da colesterolo alimentare - inibita da sali biliari HMG-CoA reduttasi

35 ASSORBIMENTO INTESTINALE del COLESTEROLO BILE -82% H 2 O 5% colesterolo. 15% fosfatidilcolina 80% sali biliari CIRCOLO ENTEROEPATICO Sali biliari: sintetizzati 400 mg/die riciclati g/die Colesterolo nel tratto intestinale: da dieta e bile Vegetariani stretti assunzione con la dieta <55 mg dalla bile 750 mg Dieta occidentale assunzione con la dieta mg dalla bile mg

36 Controllo non farmacologico della colesterolemia Nutrition, Metab & Cardiovascular Disease, vol. 18, 2008: consensus document A PARITA DI INTROITO CALORICO Acidi grassi saturi (e trans insaturi <5% nella carne e latte ruminanti) Saccarosio, fruttosio (generano trigliceridi) Colesterolo (effetto minore di grassi saturi) = Acidi grassi monoinsaturi effetto neutro o positivo (altri componenti) Acidi grassi polinsaturi n-6 ed n-3 Dieta ipocalorica e calo ponderale Attività fisica aerobica ( HDL) Fibra alimentare; Fitosteroli Calo 5-10% di LDL e/o aumento HDL