UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI SASSARI Dipartimento di Scienze Biomediche CORSO DI LAUREA IN BIOLOGIA SPERIMENTALE ED APPLICATA (CLASSE LM-6)

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1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI SASSARI Dipartimento di Scienze Biomediche CORSO DI LAUREA IN BIOLOGIA SPERIMENTALE ED APPLICATA (CLASSE LM-6) Polimorfismo del gene IL-28B alla risposta virologica sostenuta indotta dal trattamento dell'epatite C con nuovi farmaci antivirali (Boceprevir e Telaprevir) Relatore: Prof. Paolo Enrico Correlatore: Dott.ssa Elena Rimini Tesi di Laurea di: Monica Serra Anno Accademico

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3 INDICE 1. Scopo del lavoro 4 2. Introduzione Il virus Trasmissione Patologia Acuta e Cronica Anatomia patologica Diagnosi Trattamento Farmacologico Terapia Standard Nuove Terapie Fattori pre-trattamento Genotipo dell'il-28b Materiale e metodi Estrazione di DNA Estrazione di DNA con metodi semi-automatici Estrazione di DNA con metodi automatici Real Time PCR Risultati Bibliografia 39 ~ 3 ~

4 1. Scopo del lavoro svolto durante l'internato di tesi. Lo scopo del mio lavoro, svolto nel corso dell'internato di tesi nel settore di Biologia Molecolare del laboratorio d'analisi del P.O SS. Annunziata, è stato quello di valutare l'importanza della presenza dei polimorfismi del gene IL-28B nella risposta virologica sostenuta, indotta dal trattamento dell'epatite C con nuovi farmaci antivirali, quali Boceprevir e Telaprevir. Il compito da me svolto in quest'ambito è stato quello di andare a ricercare la presenza di questi polimorfismi in pazienti sottoposti a terapia antivirale con i farmaci standard, in maniera da attestare la presenza di questi polimorfismi, affinché potesse essere prescritta a questi soggetti la terapia antivirale con questi nuovi farmaci, in quanto si ritiene che la presenza di questi polimorfismi sia uno dei fattori pre-trattamento favorevoli per la risposta positiva al trattamento con queste nuove terapie. 2. Introduzione. L Epatite C è un infiammazione cronica del fegato causata da un virus, l'hepatitis C virus, denominato dall'acronimo HCV, che colpisce in primo luogo il fegato e che determina la patologia definita Epatite C. L'infezione è spesso asintomatica, ma la sua cronicizzazione può condurre alla cicatrizzazione del fegato e, infine, alla cirrosi, che risulta generalmente evidente dopo molti anni dall'infezione da parte del virus. In alcuni casi la cirrosi epatica potrà portare a sviluppare insufficienza epatica, cancro al fegato, varici esofagee e gastriche. Il virus dell'epatite C si trasmette principalmente per via ematica, tramite trasfusione, puntura accidentale con ago infetto, scambio di aghi per inoculo di droga, nascita da madre infetta. ~ 4 ~

5 Vi sono terapie consolidate per il trattamento dell'infezione cronica dell'epatite C, che sono quelle che prevedono l'utilizzo di due farmaci, quali Interferone e Ribavirina, la cui efficacia è condizionata sia dalle caratteristiche del virus che dell'ospite. Allo stesso modo questi fattori pretrattamento sono molto importanti per il trattamento di questa patologia con i nuovi farmaci antivirali, che sono il Boceprevir e il Telaprevir. Una delle caratteristiche fondamentali dell'ospite, che può determinare una differente efficacia della terapia, è la presenza o meno di determinati polimorfismi a carico del gene IL-28B. 2.1 Il virus. L'HCV, assieme ai virus delle epatiti A, B, D ed E, fa parte dei "virus epatitici" propriamente detti che si distinguono da quelli "minori", come il virus della mononucleosi infettiva, quelli erpetici e il citomegalovirus, responsabili di un danno epatico generalmente meno importante. L'agente infettivo che causa l'epatite C è il virus HCV, un Hepacivirus che appartiene alla famiglia dei Flaviviridae. Il genoma dell HCV è una molecola di RNA a singolo filamento composto da ~9400 nucleotidi che contiene una singola fase aperta di lettura codificante per una poliproteina precursore di circa 3000 aminoacidi e fiancheggiata da regioni non tradotte alle estremità 5 e 3. Quando penetra nella cellula, il virus rilascia nel citoplasma il proprio genoma. Questo viene tradotto dagli enzimi dell ospite nella poliproteina virale che viene inizialmente processata da proteasi dell ospite e successivamente da parte delle proteasi virali (NS2/3 e NS3). Vengono generate dieci distinte proteine, suddivise in proteine strutturali (core, E1 e E2) e non strutturali (p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B). ~ 5 ~

6 Le proteine NS2 e NS3 formano la proteasi NS2/3, la quale determina il clivaggio della giunzione tra NS2 e NS3. NS3 si lega al suo co-fattore NS4A formando la serin-proteasi, la quale catalizza il clivaggio della poliproteina HCV in corrispondenza delle giunzioni NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A e NS5A/NS5B. La replicazione di HCV avviene dopo il processamento delle proteine virali. Benché il meccanismo non sia stato ancora del tutto chiarito, si ritiene che la replicazione di HCV avvenga in un modo semiconservativo, in due fasi, e sia catalizzata dalla RNA-polimerasi RNA-dipendente NS5B. L RNA genomico a filamento singolo e polarità positiva forma la matrice per la sintesi di RNA intermedi di polarità negativa che a loro volta formano la matrice per altri RNA a polarità positiva. Questi a loro volta vengono utilizzati per la traduzione della poliproteina e per l assemblaggio del virione. Dopo la sintesi delle proteine, delle glicoproteine e dell HCV-RNA genomico virali, questi componenti vengono assemblati in modo da produrre virioni infettivi. L assemblaggio virale è un processo a più fasi che coinvolge la maggior parte dei componenti virali, oltre a numerosi fattori cellulari. Esiste un'enorme variabilità tra i genomi di HCV e la grossa variabilità è imputabile a tutta una serie di eventi molto comuni a tutti i tipi di virus, perché molti virus evolvono rapidamente, in quanto durante la replicazione possono facilmente accumulare errori e hanno cicli di rigenerazione abbastanza brevi: tutto ciò rende la loro terapia più complicata e soprattutto "complica la vita" del sistema immunitario, che con difficoltà riesce a controllare questa infezione. Esistono diversi genotipi differenti, almeno 6, di HCV, e a loro volta esistono per ciascuno di questi genotipi sottotipi differenti. Nelle diverse parti del mondo ci sono virus dell'epatite C con genotipi differenti e la cosa importante da sottolineare è che il genotipo 1 è ~ 6 ~

7 quello più diffuso ed è quello che ha la risposta più bassa alle terapie antivirali normalmente utilizzate. Figura 1) Organizzazione del genoma di HCV. 2.2 Trasmissione. Le vie di trasmissione dell'agente eziologico che determina l'epatite sono diverse, anche se queste variano anche in relazione allo sviluppo della determinata zona che si prende in considerazione, infatti nel mondo sviluppato, la trasmissione principale del virus è legata all'uso e all'abuso di droghe somministrabili per via endovenosa, mentre nei Paesi in via di sviluppo la causa principale che determina la trasmissione del virus HCV è data dalle trasfusioni di sangue non sicuro, il che comporta che la trasmissione sia dovuta in questi paesi a delle procedure mediche non del tutto appropriate. ~ 7 ~

8 Le tipologie di trasmissione, in generale, sono quelle elencate di seguito: consumo di sostanze d'abuso per via endovenosa, esposizione legata a procedure mediche, trasmissione sessuale, piercing e tatuaggi, trasmissione parenterale inapparente, trasmissione verticale. Per quanto riguarda l'uso di sostanze d'abuso per via endovenosa, questa rappresenta la via di trasmissione parenterale più diffusa, soprattutto al giorno d'oggi e nei giovani. L uso dello stesso ago, delle stesse siringhe o di altri strumenti e scarse condizioni igieniche mettono i consumatori di droghe per via parenterale ad alto rischio di contrarre l infezione. In tutti i paesi dell Unione Europea l incidenza dei soggetti positivi l'hcv, che hanno contratto il virus attraverso questa via di trasmissione, è estremamente alta, oscillando tra il 30 % e il 90 % in base alla popolazione presa in esame. Ad esempio, i dati relativi a Dublino, in Irlanda, indicano che il 53% di consumatori di stupefacenti per via parenterale da un periodo non superiore a due anni risultano positivi all infezione da virus dell Epatite C; livelli analogamente elevati sono stati rilevati a Coimbra, Portogallo (62%) e a Glasgow, nel Regno Unito (36%). La trasmissione dell'agente eziologico che determina l'epatite C può essere dovuta anche a procedure mediche. Le trasfusioni di sangue e i trapianti di organo, in assenza di un controllo preventivo sulla presenza di HCV, sono procedure che portano a un alto rischio di infezione. Proprio per questo motivo, sono stati introdotti delle metodiche di screening universali sulle sacche di sangue trasfuse e questo ha portato a una diminuzione del rischio di contrarre tale patologia: si è passati da 1 caso su a 1 caso su Questa via di trasmissione, però, risulta ancora presente in ~ 8 ~

9 paesi in cui le norme igieniche a livello di procedure mediche non vengono applicate e in paesi che non possono sostenere gli alti costi dei dovuti controlli sulle sacche di sangue da trasfondere. Il virus dell'epatite C, sebbene con frequenza di gran lunga inferiore a quella del virus dell'epatite B e dell'hiv, si trasmette anche per via sessuale, anche se tale trasmissione avviene solo se durante il coito vi è anche uno scambio di sangue, quindi non sono infettanti né lo sperma, né le secrezioni vaginali e né la saliva. Il rischio di contrarre il virus mediante questa tipologia di trasmissione è minore in soggetti monogami, rispetto ai soggetti con numerosi partner sessuali. Il rischio della trasmissione per via sessuale è aumentato se sono presenti altre patologie sessualmente trasmissibili, come l'herpes simplex labiale e genitale e la gonorrea. Altra modalità di trasmissione sono i piercing e i tatuaggi, uno studio svolto negli USA ha infatti dimostrato che tra i tatuati il virus è molto più diffuso che non tra la popolazione generale, più precisamente la probabilità che una persona con Epatite C abbia fatto un tatuaggio è quattro volte più elevata di una persona sana. Con oltre un milione di malati, l'italia è il Paese europeo con più casi di infezione da Epatite C e sempre l'italia è un paese in cui i tatuaggi riscuotono moltissimo successo; si stima che circa in milione e mezzo di italiani siano tatuati, di conseguenza vi è una forte relazione tra coloro che presentano tatuaggi sul loro corpo e la presenza dell'infezione dell'hcv. Tutto questo può essere dovuto all'uso di apparecchiature impropriamente sterilizzate o alla contaminazione dei coloranti utilizzati. Infine vi è da precisare che i tatuaggi e i piercing eseguiti nella prima metà degli '80 o in strutture non professionale destano una maggiore preoccupazione, poiché i requisiti di sterilità, in tali contesti possono essere mancati. Anche la trasmissione parenterale inapparente può essere una fonte di contagio, in quanto oggetti per la cura della persona, come rasoi, ~ 9 ~

10 spazzolini da denti e attrezzature per manicure e pedicure possono essere contaminati con il sangue, quindi la loro condivisione può portare all'esposizione al virus HCV. Infine vi è anche la trasmissione verticale, che è quella in cui il virus dell'epatite C viene trasmesso dalla madre infetta al bambino. Questa contaminazione avviene in meno del 10% delle gravidanze. Non è chiaro in quale momento della gravidanza possa avvenire la trasmissione, ma sembra che possa verificarsi sia durante la gestazione, sia al momento del parto. Una cosa molto importante per quanto riguarda questa via di trasmissione è il fatto che si tratta dell'unica modalità in cui non vi sono delle misure preventive per evitare tale contagio, a differenza di tutte le altre vie, in cui la trasmissione è controllabile ed evitabile con accurate misure di sicurezza e di igiene. Vie di Trasmissione dell'epatite C Figura 2) Istogramma riassuntivo delle diverse modalità di trasmissione dell'epatite C in Italia. ~ 10 ~

11 2.3 Patologia Acuta e Cronica. L'Epatite C è caratterizzata da un'elevata percentuale di forme asintomatiche. L'episodio acuto clinicamente evidente non è molto frequente e può essere caratterizzato dalla comparsa di ittero, dolore al fianco destro, sensazione di malessere e stanchezza oltre ad un importante aumento delle transaminasi. I sintomi si possono presentare prevalentemente dopo due o tre mesi dall'infezione, in corrispondenza del picco delle transaminasi e della comparsa dell'hcv-rna. Dopo l'episodio acuto in alcuni casi si verifica la guarigione con la scomparsa di HCV-RNA e la normalizzazione delle transaminasi. In altri casi dopo un'apparente remissione che dura alcuni giorni o alcune settimane si osserva di nuovo un aumento delle transaminasi. Il criterio fondamentale per considerare il soggetto guarito è la persistente negativizzazione di HCV- RNA per almeno 6 mesi-1 anno. Nei soggetti guariti la presenza di anticorpi anti-hcv può persistere per anni o anche per sempre. Negli altri casi, superato l'episodio acuto vi è l'evoluzione verso la fase cronica, il soggetto resta HCV-RNA positivo e le transaminasi possono essere fluttuanti o persistentemente normali. Questi soggetti in cui la patologia cronicizza rappresentano il 60-80% della totalità delle persone infettate dal virus. L'Epatite cronica da HCV molto spesso è accompagnata da una sintomatologia aspecifica comprendente, con elevata frequenza, uno stato di fatica e malessere persistenti indipendenti dalla severità del danno epatico. Un segno molto evidente, che risulta essere una delle caratteristiche peculiari dell'epatite è l'ittero. Molti pazienti con Epatite C lamentano anche dolori muscolari, annebbiamento mentale e turbe della memoria che incidono, in vario grado, sulla quotidianità. L infezione da Epatite C, che si protrae per lunghi anni, può causare complicazioni importanti, quali: ~ 11 ~

12 Cicatrizzazione del tessuto epatico (cirrosi). Solitamente tale processo impiega non meno di anni e la velocità di progressione di malattia è in funzione delle caratteristiche del paziente e favorita da alcuni cofattori quali il sovrappeso, il diabete, la steatosi epatica, il consumo di alcol/droghe, il sovraccarico di ferro o la presenza di altre infezioni virali. In questi particolari gruppi di pazienti la progressione della fibrosi è molto più rapida e può accelerare la comparsa di cirrosi nel giro di pochi anni. Tumore del fegato. Una temibile e assai frequente complicanza della cirrosi è rappresentata inoltre dalla comparsa del tumore epatico altrimenti definito carcinoma epatocellulare o epatocarcinoma. L epatocarcinoma è la complicanza più grave e più frequente della cirrosi da virus C, ed essa avviene con una frequenza del 3-5% per anno. In Italia l'epatocarcinoma costituisce la settima causa di morte per tumore, con circa decessi l'anno. Trapianto di fegato. Quando l'epatite cronica C è arrivata allo stadio avanzato della cirrosi (nella cosiddetta fase dello scompenso) appare opportuno iniziare una valutazione per l eventuale inserimento del paziente in lista d'attesa per trapianto epatico. In Europa e negli Stati Uniti, l'epatite C è la causa principale di ricorso al trapianto di fegato (fino al 40% dei trapianti epatici sono in pazienti con HCV). Tuttavia, dopo un trapianto di fegato per cirrosi causata dall'epatite C, la ricomparsa dell'infezione è universale (cioè avviene nel 100% dei casi), con lo sviluppo di epatite nella quasi totalità dei pazienti. La progressione può essere favorita da alcuni fattori di rischio come l'obesità, l'età, la steatosi epatica, il consumo di alcool e la coinfezione con il virus HIV. ~ 12 ~

13 Progressioni patologiche Infezione da Hepatitis C Virus Risoluzione 15% Cronicizzazione 85% Infezione Stabile 65-80% Cirrosi 20-35% Progessione Lenta 80% Scompenso Epatocarcinoma 25% Figura 3) Schema delle possibili progressioni dell'infezione da virus HCV Anatomia patologica. Nell'Epatite tutti i lobuli epatici presentano un'irregolare scomparsa delle cellule, una necrosi epatocellulare acidofila e un infiltrato infiammatorio di mononucleati. Le zone di rigenerazione si evidenziano istologicamente anche durante le fasi precoci. Poiché, in genere, ~ 13 ~

14 l'impalcatura reticolare del connettivo di sostegno degli epatociti rimane intatta, si verifica quasi sempre una completa riparazione istologica del danno, a eccezione dei casi in cui la necrosi estesa interessa interi lobuli. 2.4 Diagnosi. Il notevole aumento delle aminotransferasi (AST e ALT) è la caratteristica peculiare della malattia. I valori elevati compaiono molto precocemente nella fase prodromica, raggiungono l'acme prima che l'ittero diventi della massima intensità e diminuiscono lentamente durante la fase di guarigione. Le AST e ALT sono generalmente intorno a valori di UI/l, anche se c'è una scarsa correlazione con la gravità clinica. L'ALT è caratteristicamente più elevata dell'ast, ma tale dato è di limitata utilità solo nella differenziazione dall'epatopatia alcolica in cui, di solito, si verifica l'inverso. I pigmenti biliari in genere compaiono nelle urine prima dell'insorgenza dell'ittero: il loro precoce rilievo è un elemento diagnostico importante. La fosfatasi alcalina è solo modicamente elevata a eccezione dei casi con colestasi grave. Un marcato prolungamento del tempo di protrombina è poco frequente ma, se presente, indica una forma grave. La conta dei GB è solitamente bassa o normale e lo striscio del sangue periferico evidenzia spesso alcuni linfociti atipici. Attualmente la diagnosi di Epatite C si basa sull impiego di due esami del sangue: la ricerca degli anticorpi specifici contro l HCV e l individuazione delle particelle virali HCV-RNA. Una volta accertata la presenza del virus si possono eseguire ulteriori indagini volte a definire precisamente il danno al fegato con la biopsia e ad individuare il genotipo dell HCV e la carica virale grazie all HCV-RNA quantitativo. ~ 14 ~

15 2.5 Trattamento Farmacologico Terapia standard. La terapia standard per la cura dell'epatite cronica da HCV si fonda sulla somministrazione contemporanea di Interferone Pegilato (Peg- IFN) e Ribavirina. Per quanto riguarda l'interferone Pegilato, si utilizzano sostanzialmente Peg-Interferone alfa-2b (alla dose di 1.5 µg/kg/settimana) oppure Peg-Interferone alfa-2a (180 µg/settimana in dose fissa). Gli interferoni (IFN) sono molecole proteiche naturali rilasciate dalle cellule in risposta a infezioni virali o a induttori biologici. Appartengono alla famiglia delle citochine e sono specie-specifici. Gli interferoni, scoperti nel 1957, sono stati così chiamati per la loro capacità di "interferire" con la capacità di infettare del virus. Gli interferoni esplicano la loro azione farmacologica legandosi a recettori specifici presenti sulla membrana cellulare. Il legame interferone-recettore attiva una cascata di reazioni biochimiche finalizzata all attivazione/induzione di enzimi. Gli interferoni (IFN alfa e beta) esplicano attività antivirale sia verso virus a DNA che RNA e attività antinfiammatoria. A seconda del tipo di virus gli interferoni possono ostacolare la trascrizione del materiale genetico, l assemblaggio o il rilascio del virus dalla cellula ospite. Tutti gli interferoni mostrano attività immunomodulatrice con effetti dose-dipendenti: attivano linfociti B, macrofagi, cellule NK (cellule natural killer); inducono alcune attività citotossiche dei linfociti T, il rilascio di interleuchina 1 e 2 e fattori di necrosi tumorale; riducono l espressione di antigeni HLA di classe I e II sulla superficie di epatociti. L'Interferone α, utilizzato nella terapia dell'epatite C possiede proprietà antivirali, immunomodulanti e antiproliferative. Per quanto riguarda l'attività antivirale, l interferone-alfa (IFNα) mostra attività terapeutica nel trattamento delle epatiti croniche; la risposta clinica sembra dipendere dall età, dall assenza di cirrosi e di infezione sostenuta da ~ 15 ~

16 sottotipi del virus B o C. In caso di Epatite C, l interferone alfa (IFNα) determina eradicazione completa del virus HCV nel 25-30% dei pazienti; in circa il 30% dei pazienti trattati la patologia si ripresenta con la sospensione del trattamento. L efficacia terapeutica dell interferone aumenta con l aumentare della dose ed è potenziata dall associazione con Ribavirina. La Ribavirina è, invece, un medicinale antivirale che appartiene alla classe degli "analoghi nucleosidici". Questo farmaco interferire con la produzione o l'azione del DNA e dell'rna virali, necessari ai virus per sopravvivere e moltiplicarsi. Quindi questo è un inibitore ad azione diretta che interferisce sulla produzione di RNA virale. Entrambi questi farmaci non devono essere utilizzati in terapia singola, ma devono essere sempre presenti insieme all'interno dello stesso trattamento terapeutico, in modo che si vada ad agire contemporaneamente sui due "attori" coinvolti nell'infezione: virus e organismo umano. Si può affermare quindi che la terapia standard per la cura dell'epatite cronica da HCV sia basata su farmaci che da un lato aumentano l'efficienza del sistema immunitario nel rispondere all'infezione virale e dall'altro vanno a determinare interferenze nella sintesi di proteine virali, impedendo quindi la sopravvivenza e la replicazione del virus all'interno delle cellule. C'è da precisare, però, il fatto che la risposta sostenuta al trattamento, ovvero la negatività dell'hcv-rna 24 settimane dopo la sospensione del trattamento, con questi farmaci è correlata in particolar modo con il genotipo del virus HCV. Nei pazienti con genotipo 1, trattati per 48 settimane, i tassi di risposta sostenuta sono del 45-55%; nei pazienti con genotipi 2 o 3, dopo un trattamento di 24 settimane, la risposta virologica sostenuta varia dal 60% all'85%. Le percentuali di risposta sono leggermente inferiori nei pazienti nei quali l'infezione cronica è già evoluta in cirrosi; in particolare i tassi di risposta sostenuta sono del 33% nei pazienti cirrotici con genotipi 1 e 4 e del 57% nei pazienti con genotipo 2 e 3. ~ 16 ~

17 In questi pazienti cirrotici, in caso di precedente fallimento della terapia antivirale, la probabilità di ottenere una risposta sostenuta si riduce al 10% in tutti i genotipi. Da tutto questo si può dedurre facilmente che il genotipo più difficile da contrastare è il genotipo 1, su cui però si hanno risposta virologica sostenuta con i nuovi farmaci, quali Boceprevir e Telaprevir, che verranno analizzati di seguito. Risposte al trattamento standard Peg Interferone + Ribavirina Figura 4) Rappresentazione grafica della risposta alla terapia standard in base al genotipo Nuove Terapie. In considerazione della deludente risposta contro il genotipo 1, negli ultimi anni si sono concentrati gli studi con nuovi farmaci proprio verso ~ 17 ~

18 questo genotipo. Una nuova classe di farmaci, gli inibitori delle proteasi che agiscono direttamente sulla replicazione del virus, hanno dato negli ultimi anni migliori risultati se aggiunti alla terapia standard. I nuovi farmaci sono disponibili in Europa da circa due anni, mentre in Italia lo sono dal gennaio I farmaci sono il Telaprevir e il Boceprevir e vanno somministrati necessariamente e sempre in associazione con Interferone pegilato e Ribavirina, mai da soli, in modo da andare a costituire quella che viene definita triplice terapia, in quanto ognuno di questi due farmaci viene assunto insieme a quelli presenti nella terapia standard. Quindi si avranno queste due possibilità di triplice terapia: PegIFN + Ribavirina + Telaprevir, PegINF + Ribavirina + Boceprevir. La differenza sostanziale che determina una maggiore efficacia di questi farmaci rispetto alla terapia classica è data dal fatto che il Boceprevir e il Telaprevir vanno ad agire direttamente sul virus, a differenza di quanto accade per l'interferone e la Ribavirina, in quanto il primo determina una maggiore risposta dell'organismo all'infezione, esaltando l'attivazione del sistema immunitario, mentre il secondo dei due farmaci della terapia standard determina un'azione indiretta sul virus. L'azione di questi nuovi farmaci è diretta essenzialmente contro una proteasi del virus, serinproteasi NS3-4A. A questo punto è importante ricordare che l HCV è un piccolo virus contenente un genoma a RNA a singolo filamento, che codifica per un unica poliproteina, precursore di quattro proteine strutturali e di sei proteine non strutturali (NS) con attività di proteasi, elicasi e polimerasi. Le proteine strutturali vengono processate per via proteolitica dagli enzimi NS, tra cui è presente la suddetta serin-proteasi NS3, target per i nuovi farmaci antivirali. Tale enzima è caratterizzato da due attività principali: il dominio ~ 18 ~

19 C-terminale ha un attività elicasica, mentre il dominio N-terminale media la proteolisi alle giunzioni NS3/4A, NS4A/4B, NS4B/5A e NS5A/5B. In altre parole il virus HCV sfrutta l'azione di alcune proteasi, che scindono le poliproteine codificate dal genoma virale, per ottenere le forme mature delle proteine NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B, indispensabili per la replicazione del virus. Di conseguenza, dato che i farmaci Boceprevir e Telaprevir si vanno a legare in maniera covalente ma reversibilmente alla serin-proteas NS3-4A, questo fa si che venga impedita la sintesi della stessa proteasi, in quanto è la serin-proteasi, presente all'interno del virus, che permette la scissione dei polipeptidi, in maniera tale da avere a disposizione proteine di nuova sintesi per la replicazione del virus. Nel corso di terapia con PegIFN + RBV + TVR o BOC gli effetti collaterali più comunemente segnalati sono prurito, rush, anemia, disturbi dell apparato gastrointestinale (nausea e diarrea) e disturbi anorettali (prurito/bruciore anale ed emorroidi). Il counseling prima dell inizio della cura e la gestione precoce di tali effetti collaterali, riducono la probabilità di interruzione del trattamento (che in alcune casistiche, specie nei pazienti cirrotici è superiore al 13%). La probabilità di insorgenza di questi effetti collaterali aumenta nel paziente con cirrosi e/o di età avanzata. Nel paziente cirrotico, particolare attenzione va posta al rischio infettivologico e a quello di scompenso funzionale della cirrosi. Pertanto il paziente cirrotico trattato con triplice terapia deve essere sottoposto a più stretta sorveglianza clinica per il pronto riconoscimento degli effetti collaterali e la loro tempestiva gestione ed in stretta collaborazione con un Centro Trapianti. Nei pazienti sottoposti a trapianto epatico, la prevalenza di leuco e piastrinopenia è nettamente superiore rispetto a quanto riscontrato nei pazienti immunocompetenti e rappresenta la causa principale di riduzione del dosaggio dei farmaci o della loro interruzione. Le manifestazioni cutanee (tipiche ma non esclusive della terapia con TVR), mostrano una frequenza (50%) ed una ~ 19 ~

20 gravità molto elevata. Nei casi di eruzioni cutanee progressive o gravi (<3%), si raccomanda l'interruzione del TVR, che una volta sospeso non può più essere re-introdotto. L anemia nei pazienti trattati con PegINF + RBV è un effetto collaterale abbastanza frequente che però aumenta in maniera significativa nei pazienti trattati con triplice terapia (PegIFN+RBV+TVRoBOC). Nel paziente cirrotico un calo emoglobinico significativo si osserva in una percentuale molto alta di soggetti (>50%) e può essere repentino. Durante il trattamento è necessario pertanto, in tutti i pazienti, un attento e ravvicinato monitoraggio dell emocromo in ragione dell aumentato rischio di anemia severa. Secondo l'aisf, Associazione Italiana per lo Studio del Fegato, il trattamento con la triplice terapia, PegIFN+RBV+TVR o BOC, è da prescrivere esclusivamente ai pazienti che presentano i genotipi virali 1-4, che non si sono mai sottoposti a nessun trattamento antivirale, o che si sono già sottoposti a uno o più trattamenti antivirali con interferone alfa singolarmente o in combinazione con Ribavirina, che hanno avuto una recidiva della malattia, che hanno risposto parzialmente o che non hanno risposto del tutto. Come si può notare dalle rappresentazioni grafiche riportate di seguito, la risposta virologica sostenuta, VSR, nei pazienti con Epatite C cronica trattati con triplice terapia aumenta notevolmente rispetto al trattamento con la terapia standard, Peg Interferone-α - Ribavidina, soprattutto in pazienti che con la terapia standard avevano avuto soltanto una minima risposta al trattamento. Ciò riguarda soprattutto la triplice terapia che comprende l'utilizzo del Boceprevir. ~ 20 ~

21 Pazienti con SVR Pazienti con SVR 80% SVR con PegIFN + RBV + BOC 70% 60% 50% 40% 30% 20% Peg Interferone + Ribavirina Peg Interferone + Ribavirina + Boceprevir 10% 0% Pazienti mai trattati Pazienti trattati con recidiva Pazienti trattati con risposta parziale Figura A SVR con PegINF + RBV + TVR 100% 90% 80% 70% 60% 50% Peg Interferone + Ribavirina 40% 30% 20% Peg Interferone + Ribavirina + Telaprevir 10% 0% Pazienti mai trattati Pazienti trattati con recidiva Pazienti trattati con risposta parziale Figura B Figura 5) Rappresentazione grafica del confrontotra SVR nella terapia standard e nella tiplece terapi: la figura A riporta il paragone con l'utilizzo del farmaco Boveprevir; la figura B riporta il paragone con l'utilizzo del farmaco Telaprevir. ~ 21 ~

22 2.6 Fattori pre-trattamento. La risposta virologica sostenuta si può prevedere grazie alla presenza di quelli che vengono definiti fattori pre-trattamento. I fattori pretrattamento sono quelle caratteristiche a carico del virus e a carico del paziente infettato che determinano una risposta positiva o meno al trattamento, sia nel caso della terapia standard che nel caso della triplice terapia. I fattori predittivi o pre-trattamento relativi al virus sono genotipo virale; discesa della viremia. Mentre i fattori predittivi o pre-trattamento che riguardano l'organismo ospite sono i seguenti elencati di seguito: sesso, età, razza afroamericana, consumo di alcool, coesistenza di sindrome matabolica (obesità, steatosi, diabete, ipertensione, insulino resitenza, ipertrigliceridemia), sovraccarico marziale, fibrosi avanzata o cirrosi, immunodeficienza, coinfezione con altri virus (HIV, HBV), genotipo dell'il-28b. Per quanto riguarda i fattori predittivi che interessano il virus, ciò che risulta essere di fondamentale importanza è il genotipo, infatti in base a questo cambia sia la risposta al trattamento sia il trattamento stesso. È risaputo che il genotipo virale più difficile da debellare è il genotipo 1, ~ 22 ~

23 insieme al genotipo 4. Questo è un fattore di rilievo per impostare la terapia, in quanto oggigiorno le nuove terapie sono indirizzate principalmente al genotipo 1, di conseguenza una volta che si è conosciuto il genotipo del virus HCV che ha infettato il soggetto, si può prescrivere una terapia con i nuovi farmaci maggiormente efficaci per tale genotipo. Oltre a questo c'è anche da dire che il genotipo 1b sembra essere associato ad un evoluzione più grave del processo patologico. Ovviamente, sempre per quanto riguarda il virus, anche la carica virologica è di fondamentale importanza per la terapia, in quanto in base anche a questa viene indicato il dosaggio dei farmaci. In relazione, invece, ai fattori relativi all'organismo ospite, sia il sesso che l'età sono delle caratteristiche del paziente che possono determinare una risposta positiva al trattamento, con una maggiore efficacia di questo o con una minore efficacia: il sesso maschile è associato ad una peggiore evoluzione dell'infezione e l'acquisizione del virus dopo i 40 anni influenza negativamente la progressione del virus. Di conseguenza se questi fattori sono associati ad andamento funesto dell'infezione, ciò fa si che anche il trattamento farmacologico sia più complicato e meno risolutivo. Il consumo di alcool, la coesistenza di sindrome matabolica (obesità, steatosi, diabete, ipertensione, insulino-resistenza, ipertrigliceridemia), il sovraccarico marziale e le patologie a livello epatico come fibrosi avanzata o cirrosi sono tutti fattori che aggravano le condizioni del fegato in condizioni già precarie date dall'epatite. Una delle cose da prendere in considerazione è che in condizioni di fibrosi o di cirrosi il trattamento dell'epatite con Peg- IFN e Ribavidina è altamente tossico e ha una bassissima efficacia, infatti in questi casi, nel momento in cui i pazienti sono in attesa del trapianto di fegato, si passa alla terapia con i nuovi farmaci Boceprevir e Telaprevir, che risultano meno tossici in condizioni di alterata funzionalità epatica. L'immunodeficienza e la coinfezione con altri virus, quali in particolare HBV e HIV sono delle caratteristiche che fanno si che vi sia una ~ 23 ~

24 risposta virale sostenuta molto ridotta, poiché, per quanto riguarda la terapia standard, questa va ad agire in parte nei confronti del sistema immunitario, esaltando la sua efficienza e la sua attività: questo fa dedurre che se il sistema immunitario non è immunocompetente, soprattutto a causa della coinfezione dell'hiv, questo reagirà in maniera molto minore a questo tipo di terapie. Proprio per questo motivo, anche nei casi di immunodeficienza o di coinfezione di altri virus si preferisce attualmente agire con le nuove terapie, in modo da bersagliare direttamente il virus Genotipo dell'il-28b. Come detto in precedenza uno dei fattori predittivi della risposta virologica sostenuta è il genotipo dell'interleuchina 28B. Il gene IL-28B codifica per l'ifn-λ3. Gli interferoni sono glicoproteine prodotte dal sistema immunitario, in particolar modo dai globuli bianchi, e dalle cellule tissutali in risposta alla presenza di agenti esterni. Gli interferoni si legano alla membrana delle cellule e stimolano la produzione di enzimi antivirali; quando il virus attacca una cellula attivata dall'interferone, non riesce a moltiplicarsi e questo determina un arresto o comunque una attenuazione dell'infezione. L'INF-λ3 fa parte del tipo III degli interferoni, di cui fanno parte anche l'inf-λ1 e l'inf-λ2, che vengono anche chiamati rispettivamente IL-29 e IL- 28A, per differenziarsi dall'il-28b, che invece rappresenta l'interferone λ3. Il gene che codifica per IL-28B risulta essere un fattore altamente predittivo per SVR perché una piccola mutazione genetica a carico di questo gene consente di prevedere in che modo i pazienti infettati dal virus HCV reagiscono al trattamento, sia con la terapia standard che con i nuovi farmaci. ~ 24 ~

25 Il gene che codifica per IL-28B è localizzato sul cromosoma 19 e a monte della sequenza che codifica per questo interferone è stata riscontrata la presenza di due polimorfismi, i quali sono alla base proprio della risposta virologica sostenuta associata a questo fattore predittivo. A monte della sequenza dell'il-28b, tra il gene che codifica per questa glicoproteina e quello che codifica per IL-28A sono presenti questi due polimorfismi, denominati rs e rs , che sono appunto dei polimorfismi a singolo nucleotide, denominati per questo SNP, in quanto vi è la variazione di un unico nucleotide. Per quanto riguarda la loro esatta localizzazione, il polimorfismo rs si trova a meno di 3 kb a monte del gene IL-28B, mentre il secondo polimorfismo, rs , è collocato a 37 bp a sempre a monte del codone di inizio dello stesso gene. Il polimorfismo ritenuto di maggiore importanza come fattore predittivo è risultato essere il polimorfismo rs , che può presentare o una citosina o una timina. Di conseguenza a ciò che è stato appena detto in omozigosi si potranno avere le seguenti possibilità, o C/C o T/T, mentre in eterozigosi si può presentare solo la situazione C/T. Per quanto riguarda il polimorfismo rs questo può presentare o una timina o una guanina, quindi in omozigosi si potrà presentare una situazione di T/T o di G/G, mentre in eterozigosi si potrà avere solo la combinazione T/G. Per quanto riguarda la risposta virologica sostenuta, il polimorfismo implicato in una SVR maggiore è rs nella forma C/C in omozigosi, mentre quella meno favorevole è la forma T/T sempre in omozigosi: questo risulta essere la situazione predittiva più favorevole in assoluto, anche rispetto all'altro polimorfismo. Relativamente al secondo polimorfismo, rs , la combinazione che può avere un ruolo positivo nella risposta alla terapia è quella che si ha in omozigosi e che presenta la coppia di basi T/T, mentre la situazione meno favorevole è T/G. ~ 25 ~

26 Quindi, riassumendo, il valore predittivo di SVR associato a rs C/C è più alto rispetto a rs T/T. Figura 6) Rappresentazione grafica del cromosoma 19. I polimorfismi a carico del gene che codifica per l'il-28b sono associati in modo significativo con la capacità dell'organismo di eliminare il virus dell'epatite C; in particolare gli individui portatori dell'allele "protettivo" in questo locus genetico hanno una probabilità di eliminare il virus doppia ai non portatori e rispondono alla terapia in modo molto più efficace. Quindi la presenza di un polimorfismo IL-28B può essere utilizzato come un marcatore prognostico per la gestione del paziente HCV, in quanto consente di prevedere in che modo i pazienti infettati reagiscono al trattamento, essendo in stressa associazione con il corso naturale dell'infezione, e in quanto è cruciale per incrementare il successo della terapia. Il polimorfismo genetico nei soggetti IL-28B C/C è fortemente associato ad una maggiore probabilità di eliminazione virale spontanea a seguito di una infezione acuta da HCV. Una cosa importante da sottolineare per quanto riguarda questi polimorfismi è la loro diffusione nell'intera popolazione mondiale. La frequenza allelica rs varia tra le razze e i gruppi etnici, si ha infatti una maggiore frequenza negli individui provenienti dall'est Asia e inferiore negli afroamericani. Ciò fa si che vi sia anche una differenza nella risposta ~ 26 ~

27 virale sostenuta tra le popolazione, poiché al variare del polimorfismo e della diffusione di quest'ultimo, varia anche in parallelo la risposta alle terapie: ecco perché la razza era stato inserito tra i diversi fattori che vanno a determinare una maggiore o una minore risposta virologica sostenuta. Frequenza del Polimorfismo rs tra Europei e Asiatici 50% 12% 38% C/C T/C T/T A) Frequenza del Polimorfismo rs tra Afroamericani 36 16% 48% C/C T/C T/T B) Frequenza del Polimorfismo rs tra Ispano- Americani 19% 46% 35% C/C T/C T/T C) Figura 7) I seguenti aerogrammi riportano la diffusione dei differenti genotipi legati al polimorfismo rs : A) riporta la diffusione tra Europei e Asiatici; B) riporta la diffusione tra Afroamericani; C) riporta la diffusione tra Ispano-Americani. ~ 27 ~

28 In maniera schematica si può quindi dire che rs rs C/C (Citosina/Citosina) genotipo favorevole (maggiormente presente nelle popolazioni Europee e Asiatiche) C/T (Citosina/Timina) genotipo misto T/T (Timina/Timina) genotipo sfavorevole (maggiormente presente nelle popolazioni Afroamericane) T/T (Timina/Timina) genotipo favorevole T/G (Timina/Guanina) genotipo misto G/G (Guanina/Guanina) genotipo sfavorevole La risposta virologica sostenuta determinata dalla presenza di questi polimorfismi non è da riferire esclusivamente alla terapia standard, ma anche alle nuove terapie con Boceprevir e Telaprevir. Questo dimostra il motivo per cui attualmente la ricerca dei polimorfismi del gene dell'il-28b abbia riguardato anche i pazienti da sottoporre alle nuove terapie, in modo da valutare anticipatamente se la terapia avrà un esito favorevole o meno. 3. Materiale e Metodi. Durante l'internato di tesi svolto nel settore di Biologia Molecolare ho potuto apprendere le metodiche che vengono messe a punto per l'identificazione dei polimorfismi nel gene che codifica per l'il-28b. Innanzi tutto l'esame che permette di identificare tali polimorfismi viene svolto su sangue periferico, quindi per far sì che si possa svolgere le genotipizzazione del polimorfismo è necessario un prelievo di sangue su una normale provetta da emocromo (provetta tappo viola). Si tende in questo caso a sottolineare il fatto che si tratti di sangue periferico, in quanto ~ 28 ~

29 all'interno dello stesso settore vengono svolti anche esami su prelievi di sangue midollare. A questo punto, una volta che si ha il prelievo venoso da analizzare, vengono utilizzate due differenti metodiche, che sono alla base dei due differenti passaggi che vengono svolti prima della refertazione dell'esame. Queste due metodiche sono estrazione di DNA con metodi semi-automatici o automatici; Real Time PCR. 3.1 Estrazione di DNA Estrazione di DNA con metodi semi-automatici. L'estrazione di DNA genomico da sangue intero con metodi semiautomatici prevede diversi passaggi, in cui si ha l'intervento in ogni fase dell'operatore, in quanto si tratta di metodiche semi-automatiche, in cui per la separazione del DNA da tutte le altre componenti del sangue non si utilizza il classico metodo con fenolo e cloroformio, ma delle colonnine Qiagen, che permettono l'estrazione di DNA in tempi relativamente brevi. L'estrazione del DNA è stata eseguita mediante l'utilizzo di colonnine Qiagen (QIAmp DNA Mini and Blood Mini Handbook) secondo il seguente protocollo: prelevare 20 μl di Proteinasi K, per la degradazione delle proteine, tra cui le DNAsi, che potrebbero andare a digerire il DNA, e inserire tale quantità in una provetta eppendorf da 1.5 ml; mescolare i campioni per inversione e prelevare 200 μl di sangue intero; aggiungere i 200 μl di sangue intero alla Proteinasi K; aggiungere 200 μl di Buffer di lisi (AL) e miscelare bene; procedere con il miscelamento attraverso vortex per qualche secondo; centrifugare rapidamente; incubare i campioni a 56 C per 10 minuti; ~ 29 ~

30 centrifugare brevemente i campioni, per eliminare la condensa che si è e aggiungere 200 μl di etanolo assoluto miscelando bene; caricare i campioni sulle colonnine e centrifugare a 8000 rpm per 1'; trasferire le colonnine in un tubo di raccolta pulito, aggiungere 500 μl di Buffer di lavaggio (AW1) e centrifugare a 8000 rpm per 1'; trasferire le colonnine in un tubo di raccolta pulito, aggiungere 500 μl di Buffer di lavaggio (AW2) e centrifugare prima a rpm per 3' e poi, mantenendo sempre lo stesso tubo di raccolta, a rpm per 1'; trasferire le colonnine in un tubo di raccolta pulito, aggiungere 200 μl di Buffer di eluizione (AE) e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti; centrifugare a 8000 rpm per 1', eliminare la colonnina e conservare i campioni a -20 C fino al momento dell'utilizzo Estrazione di DNA con metodi automatici. L'estrazione di DNA genomico da sangue intero con metodi automatici prevede diversi passaggi, in cui si ha l'intervento dell'operatore solo nella preparazione del campione per le procedure automatiche, che verranno svolte autonomamente dallo strumento di estrazione. L'estrazione del DNA è stata eseguita mediante l'utilizzo di colonnine KURABO (QuickGene DNA whole blood kit S - DB-S) secondo il seguente protocollo: prelevare 20 μl di Proteinasi K, (EDB) e inserire tale quantità in una provetta eppendorf da 1.5 ml; mescolare i campioni per inversione e prelevare 200 μl di sangue intero; aggiungere i 200 μl di sangue intero alla Proteinasi K; aggiungere 250 μl di Buffer di lisi (LDB), che ha una consistenza molto densa per cui è necessario risospendere con la pipetta per un numero di ~ 30 ~

31 volte pari a 5 per miscelare bene; procedere con il miscelamento attraverso vortex per 15''; centrifugare rapidamente; incubare i campioni a 56 C per 2 minuti; centrifugare brevemente i campioni, per eliminare la condensa che si è e aggiungere 250 μl di etanolo assoluto miscelando bene; vortexare e centrifugare rapidamente; caricare i campioni sulle colonnine e avviare lo strumento. I passaggi effettuati dallo strumento nella metodica di estrazione di DNA genomico sono relativi al lavaggio del campione e all'eluzione del DNA stesso. Per verificare l'integrità e la purezza dei campioni si è proceduto alla loro visualizzazione su gel d'agarosio. Sono stati caricati 5 μl di campione estratto su un gel di agarosio all'1,5% e fatti migrare per 10 minuti a 110V. Il DNA integro appare come singola banda. Figura 8) Elettroforesi su gel di agarosio per la visualizzazione del DNA estratto da sangue periferico. Per una successiva quantificazione del DNA estratto, viene utilizzato il classico metodo che prevede la lettura allo spettrofotometro alle seguenti lunghezze d'onda 260 nm e 280 nm. Il DNA assorbirà alla lunghezza d'onda di 260 nm, mentre le proteine alla lunghezza di 280 nm. Una volta che lo spettrofotometro ha letto ad entrambi le lunghezze d'onda viene fatto il ~ 31 ~

32 rapporto tra questi due valori (A260/A280) in modo da ottenere sia il grado di purezza del DNA estratto che la quantità di quest'ultimo. 3.2 Real Time PCR. L'amplificazione del DNA estratto viene eseguita attraverso l'utilizzo di un sistema per l'analisi dei polimorfismi rs e rs nel gene dell'interleuchina -28B (IL-28B) in pazienti affetti da infezione cronica da HCV, mediate Real Time PCR. Per questo scopo viene utilizzato l'experteam - CHC 28B Kit 1-RQ, attraverso lo strumento QIAGEN Rotor- Gene Q (corbett Rotor-Gene 6000). Il Rotor-Gene 6000 può essere usato per tutte le applicazioni di biologia molecolare necessarie al laboratorio, come ad esempio per le applicazioni di farmacogenomica oncologica. Lo strumento presenta, a differenza della classica strumentazione per PCR che prevede una piastra riscaldata, un rotore a 36 posizioni, in cui possono essere alloggiate le classiche provette da PCR. Nel Rotor-Gene si ha la possibilità di identificare le provette scrivendo sul tappo poiché la lettura avviene sul fondo delle provette. Il Rotor-Gene è dotato di un sistema di riscaldamento/raffreddamento ad aria con un maggiore trasferimento termico rispetto ai tradizionali sistemi peltier che permette l uniformità della temperatura; il tempo di passaggio da una temperatura all altra è di 2,5 C/secondo per la provetta e di 5,0 C/secondo per l aria. Lo strumento opera attraverso 2 canali ed altrettanti LED (uno per ogni canale) che permettono l analisi contemporanea di più fluorofori, e l utilizzo delle chimiche più comuni, tra cui led verde FAMTM, led giallo VICTM. La tecnologia Real Time combina l'amplificazione del DNA e la rilevazione dei prodotti di amplificazione in una singola provetta mediante ~ 32 ~

33 misurazione della fluorescenza. Il monitoraggio dell'intensità della fluorescenza durante la reazione di PCR, in tempo reale, permette la rilevazione e la quantificazione del prodotto amplificato, che si va via via accumulando. Oltre ai due primer convenzionali specifici per la sequenza target, la Real Time applicata alla discriminazione allelica utilizza due sonde a singolo filamento di cui una complementare alla sequenza wild-type e l'altra complementare alla sequenza mutata. Le due sonde sono marcate all'estremità 5' con due differenti reporter fluorescenti (FAM per la sonda wt e VIC per la sonda mutata), per differenziare l'amplificazione di ciascun allele; ciascuna sonda è inoltre marcata all'estremità 3' con un quencher non fluorescente. Quando la sonda è intatta il fluoroforo reporter eccitato dallo strumento trasferisce la sua energia al quencher che l'assorbe. Durante la fase di elongazione della reazione di PCR, invece, l'attività 5'-3' esonucleasica della Taq polimerasi stacca il reporter dalla sonda; di conseguenza il quencer separato dal reporter non è più in grado di assorbire la fluorescenza, che viene così rilevata dallo strumento. In questo modo, il segnale fluorescente generato durante l'amplificazione indica l'allele che è presente nel campione. Un sostanziale incremento nella fluorescenza associata al reporter FAM indica che si tratta di campione omozigote per l'allele wild-type. Un sostanziale incremento nella fluorescenza associata al reporter VIC indica che si tratta di campione omozigote per l'allele mutato. Un sostanziale incremento nelle fluorescenze associate a entrambi i fluorofori indica che si tratta di un campione eterozigote. Per l'amplificazione devono essere preparate due master mix, una per ogni polimorfismo da ricercare, le quali sono costituite dalla vera e propria master mix che contiene al suo interno la Taq polimerasi, i primer, i quattro ~ 33 ~

34 deossiribonucleoti trifosfati e il buffer. Per la preparazione delle miscele di reazione per la PCR in Real Time si procede come segue. 1. In due tubi da 1.5 ml preparare le master mix con le diverse componenti, considerando che ogni volume indicato rappresenta il volume per ogni singolo campione, di conseguenza le quantità riportate devono essere moltiplicate per il numero dei campioni +1, in quanto le master mix devono essere preparate sempre in eccesso. Master Mix 1 per polimorfismo rs CHC-RQ Master Mix CHC1 Pr C-FAM CHC1 Pr T-VIC H2O bidistillata Volume totale Volume di reazione 12.5 μl 0.5 μl 0.5 μl 9.0 μl 22.5 μl Master Mix 2 per polimorfismo rs CHC-RQ Master Mix CHC1 Pr T-FAM CHC1 Pr G-VIC H2O bidistillata Volume totale Volume di reazione 12.5 μl 0.5 μl 0.5 μl 9.0 μl 22.5 μl 2. Miscelare delicatamente le master mix con la pipetta. ~ 34 ~

35 3. Aliquotare 22.5 μl di ciascuna master mix in ogni pozzetto corrispondente ai campioni da analizzare; assicurarsi che la master mix sia posizionata sul fondo della provetta eppendorf. 4. Aggiungere 2.5 μl di DNA. 5. Caricare le eppendorf con le miscele di reazione nello strumento e avviare l'amplificazione. Nell'analisi, insieme ai campioni in cui si deve determinare il genotipo mutato o wild-type, devono essere inseriti necessariamente i controlli per ciascun allele, anch'essi forniti dal kit, e un controllo negativo, detto bianco, il quale viene preparato inserendo in un'eppendorf 22.5 μl di master mix più 2.5 μl di acqua bidistillata al posto del DNA. Figura 9) Grafico risultante da una Real Time PCR: le curve raffigurate con i pallini rappresentano il DNA amplificato con la sonda per il genotipo mutato, ovvero quello che presenta il polimorfismo che non determina SVR alle terapie; mentre le curve semplici rappresentano il DNA amplificato con la sonda per il genotipo wild-type, ovvero quello che presenta il polimorfismo che determina una SVR alle terapie. ~ 35 ~

36 4. Risultati. Da marzo 2012 a giugno 2013, ossia nel periodo in cui ho svolto il mio tirocinio e l'internato di tesi nel settore di Biologia Molecolare del laboratorio d'analisi del P.O SS. Annunziata, sono stati analizzati 91 campioni di pazienti affetti da Epatite C. Su tutti questi campioni è stato svolto il test di discriminazione allelica dei polimorfismi rs e rs , in modo tale da predire una risposta virologica sostenuta da parte dei pazienti sottoposti alla terapia con nuovi farmaci, Boceprevir e Telaprevir. Tra i 91 campioni che sono stati testati, per il polimorfismo rs si sono ottenuti i seguenti risultati: Genotipo C/T --> 50/91 campioni; Genotipo C/C --> 26/91 campioni; Genotipo T/T --> 15/91 campioni. Per quanto riguarda, invece, il polimorfismo rs , si sono riscontrate le frequenze riportate di seguito: Genotipo T/G --> 44/91 campioni; Genotipo T/T --> 43/91 campioni; Genotipo G/G --> 4/91 campioni. Dai dati si può notare che i dati coincidono perfettamente con la media, in quanto la popolazione analizzata rispecchia quelli che sono le frequenze a livello Europeo, in cui il genotipo maggiormente presente è, per quanto riguarda il polimorfismo rs , è il C/T. Questo sta a significare che la popolazione sarda, almeno per quanto riguarda il Nord - Sardegna risulta essere eterozigote per l'allele in cui è presente il polimorfismo cercato; questo fa si che la popolazione testata non risulti essere predisposta a una risposta virologica sostenuta del virus, in quanto, si ricorda, che il genotipo che rappresenta una maggiore predisposizione a una ~ 36 ~

37 risposta positiva alla terapia con nuovi farmaci è il genotipo C/C, quindi il genotipo omozigote per il polimorfismo che presenta una citosina, anziché la timina. Un altro dato rilevante che è stato ottenuto è quello relativo al fatto che la maggior parte dei campioni analizzati risultano essere eterozigoti per entrambi i polimorfismi, mentre i genotipo maggiormente favorevole per una SVR, ovvero quello che presenta in omozigosi per il polimorfismo rs il genotipo C/C e sempre in omozigosi per il polimorfismo rs il genotipo T/T, rappresenta il 26.37% di tutti i campioni analizzati. In maniera schematica le percentuali ottenute per tutte le combinazioni che si possono ottenere con i vari genotipi dei due polimorfismi sono le seguenti: Genotipo C/T - T/G --> 33/91 campioni; Genotipo C/C - T/T --> 24/91 campioni; Genotipo C/T - T/T --> 17/91 campioni; Genotipo T/T - T/G --> 9/91 campioni; Genotipo T/T - G/G --> 4/91 campioni; Genotipo T/T - T/T --> 2/91 campioni; Genotipo C/C - T/G --> 2/91 campioni; Genotipo C/C - G/G --> 0/91 campioni; Genotipo C/T - G/G --> 0/91 campioni. Da quanto si può chiaramente dedurre dai dati riportati, vi è una discreta percentuale di campioni che presentano il genotipo maggiormente favorevole e soltanto 4 campioni su 91 presentano invece quello assolutamente sfavorevole per una ottimale risposta alla terapia. Questo in termini clinici vuol dire che vi sarà una buona percentuale di persone testate ~ 37 ~

38 a cui può essere prescritta la terapia con nuovi farmaci, con la quale vi è una altissima possibilità di riuscita. Polimorfismo rs Genotipo C/T Genotipo C/C Genotipo T/T 16% 29% 55% Polimorfismo rs Genotipo T/G Genotipo T/T Genotipo G/G 5% 48% 47% A ) B ) Figura 10) Gli aerogrammi A e B riportano la frequenza dei genotipi rispettivamente per il Polimorfismo rs e per il Polimorfismo rs L'istogramma C riassume la frequenza di tutti i genotipi possibili. Frequenza dei Genotipi 40,00% 36,26% 35,00% 30,00% 25,00% 20,00% 15,00% 10,00% 5,00% 0,00% 26,37% 18,68% 9,89% 4,40% 2,20% 2,20% 0% 0% ~ 38 ~ C/T - T/G C/C - T/T C/T - T/T T/T - T/G T/T - G/G T/T - T/T C/C - T/G C/C - G/G C )