La spettrofotometria è una tecnica analitica, qualitativa e quantitativa e permette il riconoscimento e la quantizzazione di una sostanza in base al

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1 SPETTROFOTOMETRIA Tecnica che si basa sulla misura diretta dell intensitàdi colorecioènel potere da parte di una data soluzione di assorbire della luce in una regione specifica dello spettro.

2 La spettrofotometria è una tecnica analitica, qualitativa e quantitativa e permette il riconoscimento e la quantizzazione di una sostanza in base al suo spettro di assorbimento della luce. Molte sostanze naturali ed artificiali sono colorate. Questo fenomeno è dovuto al fatto che gli oggetti sono osservati attraverso una luce policromatica (luce bianca) e assorbono selettivamente alcune lunghezze d onda e la luce trasmessa risulta di un colore complementare a quello assorbito. Così una provetta contenente sangue si presenta rossa al nostro occhio perchè l emoglobina assorbe selettivamente la luce verde.

3 Radiazioni elettromagnetiche I parametri che caratterizzano le radiazioni luminose ( visibile e non) sono: lunghezza d onda λ, frequenza ν e periodo T Frequenza ν: numero di oscillazioni nell unità di tempo. La radiazione si propaga con velocitàcche dipende del mezzo ( km/sec) Lunghezza d onda èlo spazio percorso da una oscillazione completa nella direzione di propagazione x. A è l ampiezza corrisponde all intensità della radiazione λ= c/ ν

4 Dispersione della luce visibile nelle sue radiazioni componenti Le radiazioni non monocromatiche () possono venire disperse (o scomposte) nelle diverse lunghezze d onda componenti, mediante prismi o reticoli.

5 SPETTRO Quando un raggio di luce bianca colpisce obliquamente un prisma di vetro trasparente viene scomposto in tanti raggi di luce di diversi colori detto spettro.

6 Quando un sistema, in stato fondamentale viene colpito da un fotone con una determinata energia passa con una certa probabilitàallo stato eccitato. Il sistema dopo avere acquistato l energia del fotone essendo in uno stato instabile tende a tornare nello stato fondamentale emettendo il fotone di energia

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8 Spettrofotometria: Tecnica usata per determinare l assorbimento delle radiazioni nelle regioni del visibile (spettrofotometria nel visibile ) e nell ultravioletto ( spettrofotometria nell UV) Lo spettro di assorbimento di una molecola determina la lunghezza d onda alla quale si ha il massimo di assorbimento della molecola stessa Molecole colorate (cromoforo) nel visibile. Un cromoforo ha il colore complementare a quello che esso assorbe, cioè una sostanza gialla appare gialla perché assorbe luce blu. Alcuni composti biochimici privi di colore possono essere convertiti in composti colorati da reazioni cromogene ( che formano colore) a produrre composti adatti all analisi colorimetrica.

9 Assorbimento della luce visibile e percezione del colore λ of Max. Absorption Color Absorbed violet violet-blue blue blue-green green yellow-green yellow orange red purple Color Observed green-yellow yellow orange red purple violet violet-blue blue blue-green green

10 PRINCIPI DELL ASSORBIMENTO DELLA LUCE Assorbimento della luce ècorrelato in modo esponenziale al numero di molecole del soluto assorbente che vengono incontrate, cioè alla concentrazione del soluto, c. L assorbimento della luce ècorrelato in modo esponenziale alla lunghezza del percorso della luce attraverso la soluzione assorbente, d ( l ).

11 LEGGE DI LAMBERT-BEER Esprime la relazione tra assorbimento, concentrazione della sostanza e spessore del campione. A=E= ε λ cd A è l assorbanza o estinzione molare (E) ε λ è il coefficiente di estinzione molare c è la concentrazione del campione d è il cammino ottico della radiazione nella soluzione (in cm)

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13 Risposta Concent/ assorbanza lineare!

14 Non tutte le sostanze seguono la legge di Lambert-Beer

15 Strumentazione: spettrofotometro

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17 Sorgenti: 1. Lampada a tungsteno per il visibile 2. Lampade a deuterio per l UV Cuvette: 1. Celle a forma di parallelepipedo di cammino ottico di 1 cm ( vetro o poliestere per il visibile, quarzo per l UV)

18 PNP 50µM