Dato un individuo eterozigote AaBbCc per tre loci come possono distribuirsi i gameti?

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1 Dato un individuo eterozigote AaBbCc per tre loci come possono distribuirsi i gameti? tre geni indipendenti due geni associati ed uno indipendente ABC 1/4 abc 1/4 ABc 1/4 abc 1/4 Abc 1/4 abc 1/4 AbC 1/4 abc 1/4 tre geni associati A B C A B C A B C a b c a b Tutti i gameti sono equamente rappresentati 1/8 per tutti ABC 1/8 abc 1/8 ABc 1/8 abc 1/8 Abc 1/8 abc 1/8 AbC 1/8 abc 1/8 Saranno distinguibili 2 tipologie di gameti in termini di rappresentatività: - Parentali (P) maggiormente rappresentati con ¼ di rappresentatività tra loro - Ricombinanti (R) meno rappresentati con ¼ di rappresentatività tra loro c a b c P R Saranno distinguibili 4 tipologie di gameti in termini di rappresentatività: - Parentali (P) + rappresentati (1/2 rappresentatività tra loro) - Ricombinanti (R) < P (1/2 rappresentatività tra loro) - Ricombinanti (R) < P (1/2 rappresentatività tra loro) -Doppi ricombinanti (DR) < R (1/2 rappresentatività tra loro) ABC 1/2 P abc 1/2 ABc 1/2 R2 abc 1/2 Abc 1/2 abc 1/2 R1 AbC 1/2 abc 1/2 DR

2 Genetica batterica (Mappe genetiche in batteri) Capitolo 6

3 Terreni di coltura Generalmente i terreni di coltura sono delle soluzioni solide o liquide contenenti sostanze nutritive su cui è possibile crescere cellule eucariote e procariote. I terreni di coltura batterici, cioè quelli su cui è possibile crescere colonie batteriche e altri procarioti, sono più semplici di quelli eucariotici. Un terreno può essere reso solido semplicemente aggiungendo agar agar all 1,5%. L agar è un polisaccaride strutturale, estratto da un alga rossa, che funge da agente solidificante trasformando il terreno in gelatina, e che non viene digerito dai batteri. È molto utile quando occorre coltivare microrganismi in superficie. Se sappiamo quale organismo dobbiamo isolare e conosciamo il suo metabolismo, possiamo allestire il terreno di coltura con tutti i nutrienti di cui il microrganismo ha bisogno. (Non si deve trascurare né il ph né la temperatura) Gli elementi fondamentali per la crescita dei microrganismi sono: C, H, O, N, S, P (contenuti in amminoacidi, zuccheri ed acidi nucleici). Un terreno minimo e un con un minimo di nutrienti e privo di amminoacidi e come fonte di carbonio il glucosio.

4 Studiando procarioti ed eucarioti

5 Replica plating

6 Sistemi di selezione 1. Come si identificano e contano i mutanti? 2. Quali sono i caratteri che si seguono? - biosintesi di aminoacidi - utilizzo di zuccheri - resistenza ad antibiotici I batteri e lieviti si definiscono auxotrofi se sono incapaci di sintetizzare molecole essenziali, ceppi che viceversa sono capaci di sintetizzare tutte le molecole essenziali sono definiti prototrofi

7 Selezione per mutanti della biosintesi di aa si cercano i mutanti aa - (esempio trp - ) Partiamo da wild-type (trp + ) batteri trp - replica plating coltura (10 9 batteri) terreno con trp crescono trp +/- terreno minimo crescono trp + In questo modo dalla coltura di partenza e possibile isolare cloni mutanti per il trp

8 Selezione per mutanti dell utilizzo di zuccheri si cercano i mutanti zucchero + (esempio lac +, lattosio + ) Partiamo da wild-type batteri lac + replica plating coltura (10 9 batteri) terreno minimo crescono lac +/- terreno con lattosio crescono lac + In questo modo dalla coltura di partenza e possibile isolare cloni mutanti per il lattosio

9 Selezione per mutanti della resistenza ad antibiotici si cercano i mutanti antibiotico r (esempio strp r, streptomicina resistente) Partiamo da wild-type batteri strp r replica plating coltura (10 9 batteri) terreno minimo crescono strp r/s terreno con strept. crescono strp r In questo modo dalla coltura di partenza e possibile isolare cloni resistenti alla streptomicina

10 Trasformazione - Trasferimento unidirezionale di DNA extracellulare all interno delle cellule - Osservata per la prima volta nel 1928 da Griffith e 1944 da Avery - Il DNA estratto dal ceppo donatore e frammentato e utilizzato per trasformare le cellule (riceventi) - I trasformanti sono identificati solo quando il donatore ed il ricevente differiscono per alcuni marcatori genetici - Si distinguono trasformazione naturale (Bacillus subtilis) e ingegnerizzata (E. coli)

11 Trasformazione in Bacillus subtilis 1 a+ 2 a a a+ 4 3 a a+ a a+ 5 Trasformante a+

12 MAPPATURA MEDIANTE TRASFORMAZIONE FREQUENZA DI CO-TRASFORMAZIONE (quale e la percentuale di batteri che portano assieme due marcatori: NUMERO DI COTRASFROMANTI (a,b)/totale - MAGGIORE E LA FRAQUENZA DI CO-TRASFORMAZIONE MINORE E LA DISTANZA TRA DUE MARCATORI

13 Trasduzione - Processo nel quale i batteriofagi (virus batterici) trasferiscono l informazione del DNA batterico da un batterio (donatore) ad un altro (ricevente); questi fagi sono chiamati fagi vettori - Il virus puo seguire un ciclo litico (duplica il suo DNA nella cellula batterica e la rompe per propagare se stesso) o un ciclo lisogeno (si integra nel DNA della cellula ospite e li rimane sino all inizio di un ciclo litico). - I fagi che possono dare ciclo litico e lisogenico sono definiti temperati La trasduzione si distingue in specializzata e generalizzata: 1. Specializzata se il DNA fagico integrandosi in un punto specifico del DNA tasferisce solo determinati geni; 2. Generalizzata il fago trasferisce casulamente i geni del batterio

14 Trasduzione Batteriofago

15 Ciclo litico e trasduzione Fago trasducente

16 Ciclo lisogenico CICLO LITICO CICLO LITICO INDUZIONE CICLO LITICO EXCISSIONE 5. Numerose divisioni cellulari INTERGRAZIONE

17 MAPPATURA MEDIANTE TRASDUZIONE FREQUENZA DI CO-TRASDUZIONE (quale e la percentuale di batteri che portano assieme due marcatori: NUMERO DI COTRASDUTTANTI (a,b)/totale - MAGGIORE E LA FRAQUENZA DI CO-TRASDUZIONE MINORE E LA DISTANZA TRA DUE MARCATORI

18 Tubo di Davis Coniugazione nei batteri Saggiato su piatre per la ricerca di prototrofi ASSENZA DI PROTOTROFI Ceppo A Ceppo B Setto poroso Non permette il passaggio dei batteri

19 Università di Bari Coniugazione nei batteri

20 Fattore F (plasmide)

21 Coniugazione nei batteri - Processo di trasferimento unidirezionale attraverso il diretto contatto tra una cellula batterica donatrice (F+) ed una ricevente (F-) - Si forma un pilo a seguito del contatto cellulare attraverso il quale passa il plasmide batterico, plasmide F F+ F- F+ F- F+ F+ I due batteri (F+ ed F-) diventano entrambi F+

22 Coniugazione nei batteri

23 Ceppi Hfr Per ottenere da coniugazione la ricombinazione dei geni cromosomici sono necessari particolari ceppi derivati da ceppi F +, chiamati Hfr (High frequency of recombination)

24 Coniugazione nei batteri - Il ceppo Hfr puo ricombinare con ceppi F- e trasferire a questi il DNA del plasmide F con parte del DNA del batterio - Il DNA entrato puo ricombinare con il DNA del batterio F- ed in questo modo trasferire geni del batterio Hfr al batterio F-, che comunque rimarra F-

25 Coniugazione nei batteri Hfr F- Hfr F- Hfr F- Hfr F- 1. L origine di trasferimento si replica sull Hfr 2. Il doppio crossing over in F- incorpora in DNA dell Hfr nel DNA cromosomico del batterio F-

26 Costruzione delle mappe orarie

27 E possibile definire le mappe orarie

28 Diversi siti di inserzione definiscono diversi Hfr

29 Genesi dei ceppi F -Il plasmide puo excidere dall Hfr ed in tal modo puo riportare al batterio F+ di partenza (da cui si e originato) oppure l episoma F (portante geni del cromosoma batterico) ad alta capacita di trasferimento genico

30 I ceppi F sono a rapido trasferimento F puo congiugare con un F - e permettere il trasferimento rapido dei geni ad esso e la creazione di un diploide parziale, con possibilita di recupero di fenotipi mutanti