METODO PER LA RICERCA DI VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS

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Carolina Carrara
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1 METODO PER LA RICERCA DI VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS (FDA Modificato Edition 1995) INDICE 1. SCOPO E CAMPO DI APPLICAZIONE 2 2. RIFERIMENTI 2 3. PRINCIPIO DEL METODO 2 4. TERRENI DI COLTURA, REAGENTI E SIERI 2 5. PROCEDIMENTO 6 6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI 8 7. COLLOCAZIONE Errore. Il segnalibro non è definito. 8. DESTINATARI Errore. Il segnalibro non è definito. Pag. 1 di 8

2 1. SCOPO E CAMPO DI APPLICAZIONE Metodo per la ricerca di Vibrio parahaemolyticus negli alimenti. 2. RIFERIMENTI Rapporti Istisan 96/35 "Metodi di analisi per il controllo microbiologico degli alimenti" Istituto Superiore di Sanità. International Standard Organization (ISO) Food Drug Administration (FDA) Bacteriological Analitic Manual 8 th Edition/ PRINCIPIO DEL METODO Il metodo si articola in tre fasi: La prima fase prevede l arricchimento in terreno liquido (Acqua peptonata alcalina salina) a C per ore. La seconda fase consiste nell isolamento in terreno selettivo (TCBS) a C per ore. L ultima fase riguarda l identificazione e la conferma mediante l esecuzione di test specifici sulle colonie selezionate. 4. TERRENI DI COLTURA, REAGENTI E SIERI Acqua Peptonata Alcalina salina (APAs) peptone g 20 ph 8,6 Agar Tiosolfato-citrato-bile-saccarosio (TCBS) peptone g 10 estratto di lievito g 5 citrato di sodio g 10 tiosolfato di sodio g 10 citrato di ferrico g 1 cloruro di sodio g 10 bile g 8 saccarosio g 20 blu di bromotimolo g 0,04 blu di timolo g 0,04 agar g Pag. 2 di 8

3 ph 8,6 Non sterilizzare in autoclave. Trypticase soya agar salino (TSA-S) peptone tripticase g 15 fitone peptone g 5 agar g ph 7.2 Triple sugar iron agar salino (TSI-S) estratto di carne g 3 estratto di lievito g 3 peptone g 20 lattosio g 10 saccarosio g 10 glucosio g 1 citrato ferrico g 0,3 rosso fenolo g 0,024 sodio tiosolfato g 0,3 agar g g ph 7,4 Distribuire 10 ml di terreno per provetta. Sterilizzare per 10 min. a 121 C. Lasciar solidificare il terreno a becco di clarino. Kligler agar salino (KIA-S) estratto di carne g 3 estratto di lievito g 3 peptone idrolizzato di caseina g 20 lattosio g 10 glucosio g 1 solfato ferroso g 0,2 sodio tiosolfato (Na 2 S 2 O 3 5H 2 O) g 0,3 rosso fenolo g 0,025 agar g Pag. 3 di 8

4 ph 7,4 Terreno salino per la decarbossilazione della lisina L-lisina monocloridrato g 5 estratto di lievito g 3 glucosio g 1 bromocresol porpora g 0,015 ph 6,8 Distribuire 2 ml di terreno per provetta. Sterilizzare per 10 min. a 121 C. Reagenti per la determinazione dell'indolo Terreno "Saline tryptone/triptophan" triptone g 10 triptofano (DL) g 1 ph 7,5 Distribuire 5 ml di terreno per provetta. Reattivo di Kovacs (vedi T.12) p-dimetilaminobenzaldeide g 5 Alcool amilico ml 75 Acido cloridrico conc. ml 25 Sciogliere l aldeide in alcool amilico a b.m. a C. Raffreddare ed aggiungere l acido cloridrico. Conservare a 4 C al riparo della luce. Reagenti per la determinazione dell'ossidasi N,N,N ',N ' tetrametil-p-fenilen diamina dicloroidrato g 1 acqua distillata ml 100 Preparare poco prima dell'uso Pag. 4 di 8

5 Reagenti per la ricerca della b -galattosidasi Tampone fosfato biacido di sodio (NaH 2 PO 4 ) g 6,9 idrossido di sodio, 0,1 mol/l ml 3 acqua distillata ml 50 Sciogliere il fosfato biacido di sodio in circa 45 ml di acqua. Aggiustare il ph a 7,0 con la soluzione di idrossido di sodio. Aggiungere acqua per portare ad un volume finale di 50 ml. Soluzione ONPG ortonitrofenil β-d-galattopiranoside (ONPG) g 0,08 acqua distillata ml 15 Sciogliere l'onpg in acqua a 50 C ±1 C. Raffreddare la soluzione. Reagente completo soluzione tampone ml 5 soluzione ONPG ml 15 Reagenti per la determinazione dell indolo Terreno "Saline tryptone/triptophan" triptone g 10 triptofano (DL) g 1 ph 7,5 Distribuire 5 ml di terreno per provetta. Reattivo di Kovacs (vedi T.12) p-dimetilaminobenzaldeide g 5 Alcool amilico ml 75 Acido cloridrico conc. ml 25 Sciogliere l aldeide in alcool amilico a b.m. a C. Raffreddare ed aggiungere l acido cloridrico. Conservare a 4 C al riparo della luce. Pag. 5 di 8

6 5. PROCEDIMENTO Preparazione del campione Nel caso dei molluschi ogni esemplare viene lavato esternamente con acqua distillata, quindi si apre sterilmente il guscio prelevando il corpo ed il liquido intervalvare. Da ogni campione si prelevano 100 g di materiale che vengono sottoposti ad omogeneizzazione (prodotti come pesci e vegetali possono anche essere tagliati in piccoli pezzi). Arricchimento Eseguire le semine in terreno di arricchimento. - 25g di campione sono addizionati a 225 ml di Acqua peptonata alcalina salina (APAs) avendo cura di omogeneizzare la sospensione (mediante Stomacher o agitazione meccanica). Se la quantità di campione non è di 25 g usare la quantità di terreno necessario per ottenere una diluizione Incubare il terreno per ore a C Isolamento Al fine di ottenere colonie isolate, prelevando ansate dall APA, eseguire strisci nel terreno selettivo (TCBS) Incubare le piastre di TCBS a C x ore Le colonie riferibili a V. parahaemolyticus si presentano come segue: TCBS- di pochi mm di diametro (2-3) liscie e di color verde (saccarosio negative) Se lo sviluppo delle colonie è lento, se la colorazione è debole, o in assenza di colonie caratteristiche, continuare l'incubazione fino a 24 ore per il TCBS. Identificazione Prelevare da ogni piastra, ove disponibili, almeno 3 colonie caratteristiche (se sono meno di 5 utilizzarle tutte) ed effettuare subcolture, mediante striscio, in differenti piastre di TSA salino (incubare a C x ore). Le colture pure in TSA salino vengono adoperate per i test microbiologici e biochimici Prove di identificazione preliminari - Ossidasi: prelevare una porzione della colonia isolata e strisciarla su carta da filtro imbevuta del reagente per l'ossidasi (disponibili anche commercialmente). Le colture di V. parahaemolyticus danno una reazione positiva al test. Considerare il test negativo se il colore non cambia a violetto o blu scuro in 10 sec. Pag. 6 di 8

7 - Kliger salino a becco di clarino: seminare mediante infissione e striscio. Incubare a C x ore: le colture di V. parahaemolyticus provocano un viraggio giallo del fondo della provetta mentre la zona a becco di clarino rimane rossa senza produzione di gas né di H 2 S. - TSI agar salino a becco di clarino: seminare mediante infissione e striscio. Incubare a C x ore: le colture di V. parahaemolyticus provocano un viraggio giallo del fondo della provetta (fermentazione del glucosio) mentre la zona a becco di clarino resta rossa (assenza di utilizzo di lattosio e saccarosio) senza produzione di gas né annerimento (H 2 S negativo). Test preliminari Substrato Reazione V. parahaemolyticus Ossidasi positiva Kliger-S fondo giallo, becco rosso TSI-S fondo giallo, becco rosso H 2 S mancanza di annerimento Produzione di gas mancanza di sollev. o rottura Le colonie che presentano le reazioni sopra indicate vengono sottoposte alla prove di identificazione biochimica. Prove di identificazione e conferma - Lisina decarbossilasi Inoculare il terreno liquido per la decarbossilazione della lisina con un'ansata della coltura pura. Aggiungere alcune gocce di olio minerale sterile. Incubare per 24 ore a C. Un colore rosso porpora dopo incubazione indica reazione positiva, un colore giallo indica reazione negativa. - Determinazione del tipo respiratorio Inoculare mediante ago di platino una provetta di "Saline meat-yeast" agar sciolto in precedenza e non ancora solidificato. Raffreddare rapidamente in acqua e ghiaccio. Incubare per 24 ore a C. Osservare la zona di crescita e determinare se il microrganismo è aerobio o anaerobio. - Determinazione dell'indolo. Inoculare una provetta contenente il terreno "Saline tryptone/triptophan". Incubare per 24 ore a C. Dopo l'incubazione aggiungere al terreno 1 ml di Kovacs. La formazione di un anello rosso indica reazione positiva. - Ricerca della β-galattosidasi Sospendere un'ansata della coltura pura in una provetta contenente 0,25 ml di soluzione salina. Aggiungere una goccia di toluene ed agitare. Porre in bagno - maria a 37 C per pochi minuti. Aggiungere 0,25 ml del reagente per la determinazione della β-galattosidasi e mescolare. Porre in bagno - maria a 37 C per 24 ore ed osservare ad intervalli. Il riscontro di una colorazione gialla, Pag. 7 di 8

8 che in genere apparirà dopo meno di 30 minuti, indica reazione positiva. L'assenza di colorazione indica reazione negativa. Interpretazione dei risultati Vibrio parahaemolyticus generalmente mostra le seguenti reazioni: Saccarosio Ossidasi + Motilità + Glucosio + Formazione di gas dal glucosio Lattosio H 2 S Crescita in aerobiosi o anaerobiosi + Decarbossilazione della lisina + Produzione di Indolo + β- galattosidasi 6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI Deve essere indicata la presenza o l'assenza di V.parahaemolyticus nell aliquota di campione esaminata (in genere 25 g). Pag. 8 di 8

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