Introduzione alla microscopia

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1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI NAPOLI FEDERICO II Introduzione alla microscopia Novembre 2016 A. Romano 1

2 Microscopi Il microscopio ottico consente l osservazione di oggetti di piccole dimensioni. Dalla sua invenzione, dovuta all olandese van Leeuwenhoeck (1670), esso ha subìto profonde modifiche diventando uno strumento molto complesso. I microscopi ottici consentono ingrandimenti fino a 1400X. 2

3 Microscopio Zeiss (1910) 3

4 Zeiss (1970) 4

5 Leitz

6 6

7 Metodi di illuminazione Luce trasmessa : preparati trasparenti Luce riflessa : preparati opachi (metallografia, cristallografia, litografia,..) 7

8 Sezione di un moderno microscopio 8

9 Struttura di un microscopio Sistema di illuminazione: alimentatore, lampada, collettore, lente di campo, condensatore. Porta preparato: piattino, traslatore, messa a fuoco macrometrica e micrometrica (coassiali). Sistema per la visione: obiettivi con revolver, testata binoculare e fotografica, oculari. Il collettore forma l immagine del filamento nel diaframma di apertura del condensatore mentre quest ultimo fornisce una immagine del diaframma di campo sul preparato (Koehler). 9

10 Metodi di osservazione Campo chiaro: (luce trasmessa e luce riflessa) Campo oscuro: (luce trasmessa e luce riflessa) Contrasto di fase: (luce trasmessa e luce riflessa) Contrasto differenziale: (luce trasmessa e luce riflessa) Luce polarizzata: (luce trasmessa e luce riflessa) Fluorescenza: (luce riflessa) Il campo chiaro si usa per preparati colorati. Gli altri metodi si impiegano per preparati vivi poco contrastati. 10

11 Striscio di sangue in campo chiaro 11

12 Diatomee in campo chiaro 12

13 Parameci in campo chiaro 13

14 Diatomee in campo scuro 14

15 Cellule epiteliali in contrasto di fase 15

16 Cellula epiteliale in contrasto di fase 16

17 Alghe in contrasto di fase 17

18 Alghe in contrasto differenziale 18

19 Microscopio interferenziale DIC

20 Ameba in contr. differenziale (DIC)

21 Cell. epit. in contrasto interferenziale (DIC)

22 Cristalli di zucchero in luce polarizzata 22

23 Cellule endoteliali in fluorescenza 23

24 Apparato per la formazione dell immagine L apparato ottico preposto alla formazione dell immagine è costituito da 1) obiettivo; 2) oculare; 3) Prismi che deviano i raggi nel tubo monoculare o bioculare per consentire una visione più confortevole. Generalmente, un microscopio è dotato di 3-6 obiettivi montati su un revolver, in modo da variare l ingrandimento. Gli obiettivi sono parafocali (ossia non deve perdersi la messa a fuoco nel cambio di obiettivo) e centrati (cioè la parte di preparato che si osserva deve rimanere nel campo visivo cambiando ingrandimento). 24

25 Obiettivi da microscopio Gli obiettivi da microscopio, a seconda del livello di correzione, si dividono in 1) Acromatici; 2) Planacromatici; 3) Apocromatici; 4) Planapocromatici. I primi, forniscono una buona correzione delle aberrazioni ma formano l immagine su una superficie curva. Di conseguenza, nell osservazione, non è possibile mettere a fuoco l intero campo visivo. Non sono adatti alla microfotografia. Gli obiettivi planacromatici hanno la stessa correzione di quelli acromatici ma forniscono un immagine piana. Gli obiettivi apocromatici forniscono immagini con alta correzione ma non piane. Infine, gli obiettivi planapocromatici danno immagini piane con alta correzione. 25

26 Dati degli obiettivi Sul l obiettivo sono incisi diversi numeri che ne dichiarano le caratteristiche 26

27 Obiettivi da microscopio Schema ottico di un acromatico e di un apocromatico 27

28 Obiettivi Pl Leitz Sull obiettivo sono incisi diversi numeri che ne dichiarano le caratteristiche PlApo 100X 1.32 Pl 40X 0.65 Pl 25X 0.5 Pl 10X 0.25 Pl 4X

29 Apertura numerica di un obiettivo Un dato fondamentale di un obiettivo da microscopio è la sua apertura numerica definita dalla formula A = n sen, Dove n è l indice di rifrazione del mezzo tra la superficie superiore del coprioggetto e la prima superficie della lente frontale dell obiettivo e è il semiangolo del cono di luce che entra nell obiettivo. Questo dato è di fondamentale importanza perché sussiste la seguente regola: l ingrandimento massimo utile raggiungibile con un obiettivo è 1000 volte A. Così, ad es., se un obiettivo ha apertura 0.40, il massimo ingrandimento risulta 400. Pertanto, se l ingrandimento dell obiettivo è 20 e quello dell oculare è 20, si raggiunge l ingrandimento massimo. 29

30 Apertura di un obiettivo 2) La distanza minima d tra due punti dell oggetto che l obiettivo consente di distinguere risulta d = /A Sicché d diminuisce riducendo la lunghezza d onda della luce impiegata (ovviamente fino ai limiti del visibile) ed aumentando l apertura numerica dell obiettivo. In altri termini, il potere separatore dell obiettivo migliora riducendo la lunghezza d onda della luce impiegata e aumentando l apertura numerica. Purtroppo l apertura numerica ha un limite superiore dovuto sia al valore dell indice di rifrazione, che non supera 1.6, sia al valore del seno che raggiunge il valore 1 per =90, che è un angolo irrealizzabile per le ragioni che si mostreranno nel seguito. In pratica, l apertura numerica assume valori compresi nell intervallo (0.05, 1.4) e quindi gli ingrandimenti possibili vanno da 50 a

31 Obiettivi a secco Un altra fondamentale classificazione degli obiettivi da microscopio è la seguente: 1) Obiettivi a secco (in aria); 2) Obiettivi a immersione (in olio di cedro o sintetico, glicerina, acqua). Per comprendere alcune caratteristiche fondamentali degli obiettivi da microscopio a secco e a immersione, occorre analizzare l effetto prodotto dal coprioggetto sul cammino dei raggi di luce dal preparato all obiettivo. Si supponga che il mezzo tra la superficie superiore del coprioggetto e la superficie inferiore della lente frontale dell obiettivo sia l aria. E facile convincersi (vedi Fig. seguente) che il coprioggetto, anche se molto sottile (spessore D=0.17 mm), introduce aberrazione sferica perché i raggi provenienti da un punto oggetto sull asse appaiono all obiettivo provenire da punti diversi dell asse ottico. Di conseguenza, l obiettivo a secco viene progettato con un aberrazione sferica residua di segno opposto a quella introdotta dal coprioggetto. Gli obiettivi con apertura numerica tra 0.4 e 0.75 vanno sempre usati con il coprioggetto. 31

32 Effetto del coprioggetto lente frontale obiettivo angolo limite coprioggetto portaoggetto 32

33 Obiettivi a secco Se l apertura numerica dell obiettivo è compresa tra 0.8 e 0.95, ossia se l angolo di semiapertura è compreso tra 53 e 72, la sensibilità dell obiettivo a differenze di spessore del coprioggetto è altissima. E sufficiente una differenza di 1/100 di mm dal valore 0.17 per ottenere un consistente peggioramento dell immagine. Per questo motivo gli obiettivi a secco con aperture molto elevate sono dotate di una montatura di correzione. Questa consiste in una ghiera graduata ruotabile che consente l allontanamento o l avvicinamento delle prime due lenti dell obiettivo in modo da variare l aberrazione sferica residua dell obiettivo e compensare quella introdotta dalla differenza di spessore del coprioggetto. 33

34 Obiettivi a immersione Negli obiettivi ad immersione lo spazio compreso tra la superficie superiore del coprioggetto e la superficie inferiore della lente frontale dell obiettivo è riempito con olio di cedro o olio sintetico, con lo stesso indice di rifrazione del vetro. E fondamentale che l indice di rifrazione del mezzo interposto sia eguale a quello del vetro, altrimenti si genera un aberrazione sferica già con differenze sulla terza cifra decimale dell indice di rifrazione tra vetro e olio. Questi obiettivi consentono di raggiungere aperture fino ad 1.4 (generalmente ) e quindi consentono ingrandimenti fino a 1400X. Essi presentano lo svantaggio di dover inserire l olio impedendo la formazione di bolle d aria ed inoltre richiedono un accurata pulizia dell obiettivo a fine lavoro. 34

35 Obiettivi a immersione lente frontale obiettivo olio coprioggetto portaoggetto 35

36 Testate dei microscopi Uno dei portaoculari della testata deve avere una ghiera ruotando la quale si sposta verso l alto o verso il basso uno dei due oculari. Questa operazione è fondamentale quando si osserva senza occhiali e l osservatore è affetto da miopia o ipermetropia diversa per i due occhi. Infatti, questa operazione serve a compensare la differenza di diottrie tra i due occhi. In presenza di astigmatismo è necessario l uso degli occhiali e quindi occorre impiegare oculari appositi con pupilla di uscita molto esterna. Oltre le testate bioculari vi sono quelle trioculari le quali consentono, nello stesso tempo, di applicare la macchina fotografica e di osservare, attraverso la visione binoculare, ciò che la macchina vede. 36

37 Contrasto di fase Il microscopio a contrasto di fase fu inventato dall olandese Zernike, il quale vinse il premio Nobel per l enorme importanza che questo strumento ha avuto nello sviluppo della biologia. Il contrasto di fase consente l osservazione di oggetti poco contrastati la cui struttura non è riconoscibile con la normale osservazione in campo chiaro. Il preparato è vivo perché non si ricorre ai coloranti per evidenziare la sua struttura. La differenziazione delle sue parti si ottiene intervenendo sul cammino ottico dei raggi luminosi. In tal modo si ottiene un contrasto nei toni del grigio. 37

38 Contrasto di fase Gli obiettivi per contrasto di fase, oltre a riportare sul barilotto le indicazioni degli obiettivi per campo chiaro, riportano la sigla Ph. 38

39 Contrasto di fase Gli obiettivi per contrasto di fase, pur avendo le stesse caratteristiche ottiche degli obiettivi per campo chiaro e gli stessi tipi di correzione (acromatica, planacromatica, ecc), presentano al loro interno un anello di fase, posto nel fuoco posteriore dell obiettivo, che ha il compito di creare lo sfasamento di fase tra i massimi secondari di diffrazione e quello primario. Con obiettivi di fase acromatici è fondamentale l uso di un filtro verde. 39

40 Cond. per contrasto di fase 40

41 Contrasto di fase I diaframmi anulari del condensatore sono tali che le immagini fornite dal sistema condensatore + obiettivo nell anello di fase dell obiettivo sono contenute nel diaframma di fase dell obiettivo. Questo comporta che gli obiettivi a contrasto di fase possono usarsi soltanto con il condensatore per cui sono progettati. Inoltre, i diaframmi anulari del condensatore devono essere centrabili. Alcuni condensatori hanno un dispositivo di centratura singolo. Pertanto, cambiando obiettivo, deve ricentrarsi il nuovo diaframma anulare. In condensatori più raffinati, ogni anello di fase ha il suo sistema di centraggio. In tal modo, la centratura dei diaframmi anulari va fatta una volte per tutte. Per centrare i diaframmi anulari si impiega un oculare telescopico che viene inserito al posto di un oculare del microscopio. 41

42 Contrasto di fase Il contrasto dell immagine si ha soltanto quando l anello di fase dell obiettivo e quello anulare del condensatore sono perfettamente centrati. 42

43 Microscopio in luce polarizzata Il microscopio in luce polarizzata fornisce eccellenti immagini di materiali birifrangenti. Questo microscopio può impiegarsi per analisi sia qualitative che quantitative. Mentre il primo impiego è molto esteso, il secondo, ampiamente impiegato in cristallografia, è più complesso e ristretto ai geologi, mineralogisti e chimici. Recentemente, questo tipo di microscopia è stata impiegato anche in biologia per analizzare alcune proprietà di birifrangenza esibite da cellule. Questo microscopio contiene un filtro polarizzatore, posizionato lungo il cammino ottico prima del campione da osservare, e un filtro analizzatore, posto lungo il cammino ottico tra l obiettivo e il tubo di osservazione o la camera fotografica.

44 Microscopio in luce polarizzata

45 Microscopio interferenziale DIC Un contrasto in preparati trasparenti può prodursi mediante il contrasto interferenziale (DIC) che introduce un contrasto monocromatico legato alle variazioni di indice di rifrazione del campione osservato. Piccolissime differenze di indice rifrazione producono forti contrasti nell immagine. Un microscopio DIC è un microscopio in luce polarizzata a cui si aggiungono due altri componenti ottici: i prismi di Nomarski. In luce trasmessa, la luce proveniente dalla lampada attraversa un filtro polarizzatore localizzato sotto il condensatore, come nel microscopio a luce polarizzata. Nel piano focale del condensatore (diaframma di apertura) è situato un prisma di Nomarski. Questo prisma è composto da due cunei di quarzo con assi cristallografici ortogonali tra loro e a 45 rispetto all asse di polarizzazione. Poiché occorre un prisma per ogni obiettivo, I prismi di Nomarski sono montati in una torretta ruotante del condensatore.

46 Microscopio interferenziale DIC

47 Vi sono diversi vantaggi del DIC rispetto al contrasto di fase. Il DIC usa la piena apertura numerica dell obiettivo consentendo un alta risoluzione. Inoltre, le immagini non presentano il caratteristico alone che contorna le immagini nel contrasto di fase. Lo svantaggio è che il DIC, trasformando differenze di indice di rifrazione del preparato in differenze di rilievo, fornisce un immagine diversa dalla realtà che va opportunamente interpretata.

48 Microscopio a fluorescenza