STRUTTURE DEGLI ACIDI NUCLEICI, CODICE GENETICO E REPLICAZIONE DEL DNA

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1 IL LABORATORIO DI BIOLOGIA MOLECOLARE: Introduzione alle tecniche e alle loro applicazioni STRUTTURE DEGLI ACIDI NUCLEICI, Il DNA nell arte: Susan Rankaitis 2002, DNA2 CODICE GENETICO E REPLICAZIONE DEL DNA Relatore: Lorenzo Zeni 26 Novembre 2011 Auditorium Presidio Ospedaliero S.Chiara, Trento

2 Il corso ha l obbiettivo di dare le conoscenze di base sulla struttura e sulle funzioni degli acidi nucleici

3 Introduzione

4 La struttura primaria: i componenti degli acidi nucleici

5 Nucleotide Nucleoside

6 DNA deossiribosio / RNA ribosio DNA: Acido desossiribonucleico RNA: Acido ribonucleico DEOSSIRIBOSIO RIBOSIO

7 Basi Azotate Purine Pirimidine Adenina e Guanina definite purine con struttura a doppio anello di carbonio-azoto Citosina e Timina, che nel RNA è sostituita dall Uracile, dette pirimidine con struttura a singolo anello

8 Gruppo funzionale Fosfato

9 Il Significato di 5 e di Le estremità di una catena di DNA e RNA sono distinte e hanno proprietà chimiche diverse e vengono denominate con 5 e 3. Il 5 si riferisce al carbonio dello zucchero legato al gruppo fosfato e 3 a quello legato al gruppo funzionale ossidrile OH. 3 5

10 La struttura secondaria del DNA

11 La struttura secondaria RNA singola catena polinucleotidica. DNA struttura a doppio filamento.

12 Legami Idrogeno Nel DNA, fra le basi azotate dei filamenti si formano legami idrogeno termodinamicamente stabili. I legami idrogeno sono legami deboli ma conferiscono stabilità alla doppia elica poiché sono numerosi. In questi legami sono condivisi gli atomi di idrogeno tra due atomi elettronegativi come quelli di ossigeno e di azoto.

13 Legami Idrogeno Le basi azotate formano coppie in modo specifico Adenina - Timina 2 legami idrogeno Guanina Citosina 3 legami idrogeno

14 Legami Idrogeno Watson e Crick, coloro che definirono il primo modello accurato della struttura del DNA a doppia elica nel 1953, stabilirono che la formazione di legami idrogeno possono verificarsi soltanto se la polarità dei due filamenti è opposta. 5 1 nm 3 3 5

15 L impilamento delle basi stabilizza chimicamente la doppia elica di DNA Una molecola di DNA a doppio filamento ha un nucleo idrofobico composto dalle basi impilate, che contribuisce alla stabilità chimica della struttura, con una torsione elicoidale. Questa conformazione permette di escludere la massima quantità di acqua dall interno della doppia elica. All esterno della molecola di DNA protrudono gli zuccheri e i gruppi fosfato che sono idrofilici.

16 Strutture secondarie insolite del DNA

17 La struttura terziaria del DNA

18 Struttura terziaria del DNA Immagini al microscopio elettronico di un DNA circolare rilassato (destra) e superavvolto (sinistra).

19 Struttura terziaria del DNA TOPOISOMERI: forme di DNA con stessa sequenza nucleotidica ma con diverso grado di superavvolgimento. TOPOISOMERASI: enzimi che convertono un topoisomero di DNA in un altro modificandone il suo superavvolgimento

20 L organizzazione del DNA negli eucarioti

21 Il genoma eucariotico Le cellule eucariotiche presentano nel loro nucleo le molecole di DNA compattate sottoforma di cromosoma.

22 Il genoma eucariotico Nucleosoma Il DNA eucariotico si combina con proteine basiche chiamate istoni per formare strutture note come nucleosomi. (8 istoni coppie di nucleotidi di DNA)

23 Il genoma eucariotico Istone Linker o H1, uno degli istoni più variabili, non partecipa direttamente alla formazione del nucleosoma ma si posiziona fra due ottameri adiacenti.

24 Il genoma eucariotico Cromatina decondensata (eucromatina) Fotografia al microscopio elettronico di cromatina decondensata che mostra i nucleosomi con la morfologia a collana di perle Cromatina condensata (eterocromatina) Fotografia al microscopio elettronico della fibra di cromatina di 30nm

25 Il genoma eucariotico

26 Il codice genetico

27 Il codice genetico Trascrizione di una sequenza di DNA in m-rna che verrà tradotta in una sequenza amminoacidica corrispondente ad una proteina.

28 Il codice genetico

29 Il codone è la più piccola unità del codice genetico che controlla la sintesi di un solo aminoacido. Il codice genetico si definisce degenerato in quanto più codoni possono codificare per uno stesso aminoacido. Le triplette che codificano lo stesso aminoacido presentano solitamente le prime due posizioni conservate, mentre la terza varia. Il codice genetico

30 La replicazione del DNA negli eucarioti

31 La replicazione del DNA La sintesi del DNA è limitata ad una fase specifica del ciclo cellulare nota come fase S.

32 Replicazione semiconservativa FILAMENTI PARENTALI FORCELLA DI REPLICAZIONE Modello di replicazione proposto da Watson & Crick Il filamento parentale diviene il filamento stampo La nuova doppia elica ha un filamento stampo + un filamento neoformato Forcella di replicazione: punto in cui i due filamenti di DNA parentale si separano per permettere la replicazione

33 Il meccanismo della replicazione del DNA nucleare eucariotico Inizialmente abbiamo la rimozione degli istoni a livello delle origini di replicazione.

34 Il meccanismo della replicazione del DNA nucleare eucariotico Le origini della replicazione sono siti sul DNA cromosomico in cui inizia una coppia bidirezionale di forcelle di replicazione Generalmente si trovano separate da circa 50kb, gli esseri umani ne hanno origini. Se il punto di origine fosse uno solo (come nei procarioti) la duplicazione del DNA umano richiederebbe circa un anno.

35 Il meccanismo della replicazione del DNA nucleare eucariotico Formazione del complesso di pre-replicazione (pre-rc) in corrispondenza delle origini di replicazione: - associazione del complesso di riconoscimento dell origine (ORC) all origine - richiamo di altre due proteine (Cdc6 Cdt1) - accorpamento del complesso elicasico Mcm-2-7. ORC Cdt 1 Cdc6 complesso elicasico Mcm-2-7

36 Il meccanismo della replicazione del DNA nucleare eucariotico Le due proteine del complesso di pre-replicazione vengono rilasciate per essere sostituite da altri fattori di replicazione (es: proteina di replicazione A (RPA)) L elicasi svolge il doppio filamento di DNA scindendo i legami idrogeno La topoisomerasi I e/o la topoisomerasi II risolvono i superavvolgimenti positivi davanti alla forcella di replicazione ORC Cdt 1 Cdc6 complesso elicasico Mcm-2-7 topoisomerasi I e/o topoisomerasi II

37 Il meccanismo della replicazione del DNA nucleare eucariotico

38 Il meccanismo della replicazione del DNA nucleare eucariotico RNA primer Complesso polimerasi alfa/primasi Filamento ritardato Filamento leader Complesso polimerasi alfa/primasi RNA primer Complesso Inizialmente polimerasi avrà la alfa/primasi sintesi degli : RNAprimer necessari subunità per dare inizio con attività alla formazione DNA polimerasica del filamento leader e di subunità ciascun frammento necessaria di per Okazaki l assemblaggio sul filamento del ritardato. primer due piccole proteine che assieme forniscono l attività primasica

39 Il meccanismo della replicazione del DNA nucleare eucariotico Filamento leader DNA polimerasi δ DNA polimerasi δ Complesso pol alfa/primasi Il complesso pollimerasi alfa/primasi viene sostituito dalla DNA polimerasi che estenderà la catena, nel caso del filamento leader è coinvolta la polimerasi delta

40 Il meccanismo della replicazione del DNA nucleare eucariotico DNA polimerasi ε Filamento ritardato Filamento ritardato RNA primer Complesso polimerasi alfa/primasi Filamento leader DNA polimerasi DNA polimerasi δ mentre in quello ritardato la polimerasi epsilon la quale aggiunge nuovi nucleotidi fino al raggiungimento del RNA primer del frammento precedente. Frammenti di Okazaki

41 DNA polimerasi La DNA polimerasi ha la frequenza di un errore ogni bp per ciclo di replicazione.

42 Il meccanismo della replicazione del DNA nucleare eucariotico La sintesi del filamento leader è continua Il filamento ritardato viene sintetizzato sottoforma di frammenti di Okazaki Nel frattempo la forcella di replicazione cresce Frammenti di Okazaki e cresce

43 Il meccanismo della replicazione del DNA nucleare eucariotico rimozione dell RNA primer DNA Polimerasi ε Ligasi I riempimento delle interruzioni unione dei frammenti di Okazaki sul filamento ritardato. Maturazione del DNA di nuova sintesi:

44 Il meccanismo della replicazione del DNA nucleare eucariotico Negli eucarioti la replicazione continua probabilmente fino a che una forcella non incontra un altra forcella di un replicone adiacente. Sono state anche identificate alcune sequenze in siti specifici che possono arrestare il progresso delle forcelle di replicazione. Infine, ultimo passaggio, abbiamo la deposizione degli istoni che avviene non appena c è abbastanza DNA disponibile per formare un nucleosoma.

45 I telomeri e le telomerasi Al completamento della sintesi del filamento ritardato e della rimozione dei primer su un cromosoma lineare, si ha un filamento 5 accorciato e una sporgenza di basi sul filamento 3. L estensione delle estremità 3 dei cromosomi avviene ad opera delle telomerasi. I telomeri sono strutture specializzate che incapucciano le estremità dei cromosomi, sono costituiti da ripetizioni in tandem di una semplice sequenza ricca di guanina, quelli umani contengono parecchie migliaia di ripetizioni della sequenza TTAGGG

46 I telomeri e le telomerasi L assenza dei telomeri comporta: fusione delle estremità dei cromosomi facilita la ricombinazione genetica scatena la morte cellulare per apoptosi.

47 Grazie per l attenzione