MODALITA DI REPLICAZIONE

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Aniello Longhi
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MODALITA DI REPLICAZIONE In teoria è ipotizzabile che il DNA possa duplicarsi con modalità: 1) semi-conservativa se alla generazione successiva passano due doppie eliche entrambi costituite da

1 MODALITA DI REPLICAZIONE In teoria è ipotizzabile che il DNA possa duplicarsi con modalità: 1) semi-conservativa se alla generazione successiva passano due doppie eliche entrambi costituite da un'elica vecchia ed una nuova 2) conservativa se alla generazione successiva passano una doppia elica vecchia ed una doppia elica neosintetizzata. 3) dispersiva se alla generazione successiva passano frammenti di elica neosintetizzate interposti casualmente con frammenti delle eliche materne preesistenti.

2 MESELSON & STAHL S EXPERIMENT Meselson e Stahl utilizzarono una colonia di Escherichia coli, in crescita lineare e sincrona. I batteri furono esposti ad un brodo contenente cloruro di ammonio NH 4 Cl, come unica fonte di azoto per l organicazione. In questo sale l'atomo di N era sostituito con l'isotopo 14 N o 15 N.

3 MESELSON & STAHL S EXPERIMENT

6 La sintesi del DNA avviene ad opera della DNA polimerasi in direzione 5 3.

La replicazione semiconservativa del DNA comporta la formazione di legami covalenti tra un deossinucleoside trifosfato entrante ed il terminale 3 del deossiribosio di un

7 La replicazione semiconservativa del DNA comporta la formazione di legami covalenti tra un deossinucleoside trifosfato entrante ed il terminale 3 del deossiribosio di un nucleotide pre-esistente. Da ciò consegue che la direzione di replicazione del DNA procede sempre nella direzione 5 3 (relativamente alla polarità del nucleotide entrante).

DNA replication Replicone è la zona occupata dalle sequenze di inizio della replicazione rispetto alla quale le forcelle divaricano in direzione opposte.

9 DNA replication Replicone è la zona occupata dalle sequenze di inizio della replicazione rispetto alla quale le forcelle divaricano in direzione opposte. Nel cromosoma eucariotico sono presenti più repliconi. Il tempo di replicazione è tanto più ridotto quanto più elevato è il numero dei repliconi attivi.

Problema 1 Perché una sola attività enzimatica della DNApolimerasi possa render conto della unidirezionalità della replicazione su entrambi i filamenti della doppia

10 Problema 1 Perché una sola attività enzimatica della DNApolimerasi possa render conto della unidirezionalità della replicazione su entrambi i filamenti della doppia elica è necessario assumere che la replicazione proceda in modo continuo su un filamento (leading strand), ed in modo discontinuo e a ritroso sull altro (lagging strand)

FRAMMENTI DI OKAZAKI Il terminale 3' del filamento guida (leading strand ) è sintetizzato in modo continuo, mentre il terminale 5' del filamento in ritardo (lagging strand) è sintetizzato in

12 FRAMMENTI DI OKAZAKI Il terminale 3' del filamento guida (leading strand ) è sintetizzato in modo continuo, mentre il terminale 5' del filamento in ritardo (lagging strand) è sintetizzato in modo discontinuo con i frammenti di Okazaki. Nuovi frammenti di Okasaki si inseriscono a mano a mano che la forcella di replicazione si apre, fino ad estendersi a tutta l'elica da replicare.

13 Problema 2

15 La sintesi di DNA necessita di un iniziatore o primer.

16 La DNA polimerasi necessità di un innesco (primer), un breve polinucleotide appaiato al filamento stampo. La DNA polimerasi può soltanto continuare ad addizionare nucleotidi a partire dall'ossidrile libero in 3' di questo primer. L'enzima che è in grado di addizionare nucleotidi di innesco ad un filamento di DNA a singola elica è una RNA polimerasi (primasi). L'innesco è quindi costituito da ribonucleotidi anziché da deossiribonucleotidi, ciò che rende ibridi i frammenti di Okazaki.

18 DNA ligase I frammenti ibridi di Okazaki persistono soltanto per tempi brevi. I ribonucleotidi sono rimossi ancor prima che la DNA ligasi congiunga covalentemente i restanti deossiribonucleotidi per formare un filamento unico. È la stessa DNA polimerasi che è in grado di rimuovere i ribonucleotidi procedendo a ritroso lungo il filamento già sintetizzato.

21 La duplicazione del DNA si esplica attraverso il meccanismo della replicazione. I step: separazione dei filamenti complementari di DNA mediante l intervento della DNA elicasi. II step: l intervento delle proteine destabilizzatrici dell elica. III step: le topoisomerasi operano il taglia e cuci

22 RUOLO DELL ELICASI L'elicasi separa le due eliche cambiando conformazione. Le eliche separate tenderebbero di nuovo ad avvolgersi laddove casualmente complementari. Le proteine, SSBP (single strand binding proteins) si legano al DNA a singola elica mantenendolo disteso.

23 EFFETTO DI PROTEINE CHE LEGANO IL FILAMENTO SINGOLO SULLA STRUTTURA DEL DNA

25 La soluzione per un simile compattamento è il superavvolgimento del DNA La struttura elicoidale e fibrosa del DNA crea problemi topologici. Quando la molecola viene avvolta da una parte o dall altra viene generata una energia torsionale che provoca il superavvolgimento della molecola. Écomeun Cavo telefonico

26 IL PROBLEMA DELL AVVOLGIMENTO DELL ELICA PARENTALE DURANTE LA REPLICAZIONE Una forcella di replicazione batterica Si muove a 500 nt al secondo L elica parentale davanti alla forcella Deve ruotare a 50 giri al secondo

27 Ruolo della topoisomerasi I REAZIONE DI TAGLIO REVERSIBILE CATALIZZATA DA UNA DNA TOPOISOMERASI I EUCARIOTICA L ENZIMA FORMA UN LEGAME COVALENTE TEMPORANEO CON IL DNA IN MODO DA PERMETTERE UNA LIBERA ROTAZIONE INTORNO AI LEGAMI COLAVELNTI DEL FOSFATO

Ruolo della topoisomerasi II REAZIONE DI ATTRAVERSAMENTO DELL ELICA CATALIZZATA DALLA DNA TOPOISOMERASI II -RICHIEDE IDROLISI DI ATP -FORMA

28 Ruolo della topoisomerasi II REAZIONE DI ATTRAVERSAMENTO DELL ELICA CATALIZZATA DALLA DNA TOPOISOMERASI II -RICHIEDE IDROLISI DI ATP -FORMA LEGAME COVALENTE CON ENTRAMBI I FILAMENTI -PERMETTE PASSAGGIO DI UNA DOPPIA ELICA ATTRAVERSO LA ROTTURA -RISALDA LA ROTTURA E SI DISSOCIA DAL DNA

29 Duplicazione del DNA

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