SIEROPROTEINE ELETTROFORESI

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1 SIEROPROTEINE ELETTROFORESI Le proteine del siero ammontano in totale a 6-8 g/dl; nel neonato 5 g/dl. Aumento delle proteine totali: Diminuzione delle proteine totali: - disidratazione - cambiamenti posturali - epatopatie (accumulo di γglobuline) - tumore delle plasmacellule - infezione cronica (aumento Ig) - anemia (aumento transferrina) - iperidratazione (ad es. nella gravidanza) - malnutrizione - dieta non equilibrata - malattie renali - epatopatie - enteropatie protido-disperdenti - malassorbimento - ustioni - eccessivo catabolismo L elettroforesi viene eseguito sul siero (ciò che rimane del plasma dopo l evento coagulativo); non sul plasma il quale è ricco di fibrinogeno che si annida tra le γglobuline e C3 (posizione occupata di solito dalla componente monoclonale) A ph 7,4 prevale la dissociazione tra gli amminoacidi (gruppi COO ). Le cariche si spostano verso il polo positivo (anodo) di elettroforesi. 1

2 L elettroforesi permette di evidenziare 5 bande. 1) Banda A corrispondente all albumina (ALB) 2) Banda α1 corrispondente ad α1antitripsina (AAT) ; α1antichimotripsina (AAC); α1glicoproteina acida (AAG); α-fetoproteina 3) Banda α2 corrispondente ad aptoglobina (HPT); α2macroglobulina (AMG); ceruloplasmina (CER) 4) Banda β corrispondente a transferrina (TRF) (nella parte anodica) e C3 (nella parte catodica) 5) Banda γ corrispondente alla maggior parte delle immunoglobuline 1) - Prealbumina - La prealbumina è un ottimo indicatore di nutrizione perché ha una emivita t 1/2 =48 h - La prealbumina trasporta gli ormoni tiroidei e partecipa all equilibrio tra frazione libera e frazione legata; trasporta RBP (retinol binding protein), indicatore nutrizionale e nelle urine di sofferenza renale - PROTEINE DI FASE ACUTA La diminuzione di prealbumina (proteina che occupa la parte più anodica della banda A) può indicare uno squilibrio nutrizionale o la presenza di una malattia infettiva o un infiammazione acuta. Bisogna fare gli indicatori di fase acuta (FASE RATTIVA ACUTA: risposta aspecifica con aumento della sintesi di alcune siero proteine). - proteina C reattiva (CRP) - velocità di eritrosedimentazione (VES) - In fase acuta VES riflette [FIB] - In fase cronica VES riflette [FIB]; [Ig](indicano il passaggio a infiammazione cronica); anemia (se non c è microcitosi) - La VES aumenta alla fine della prima settimana di malattia e nelle gammopatie monoclonali da IgM, IgA, IgG. Intervalli di riferimento VES Età <60 anni Età >60 anni MASCHI 2-13 mm/h 2-24 mm/h Età <40 anni Età >40 anni FEMMMINE 2-16 mm/h 2-35 mm/h FEGATO (sintesi di proteine di fase acuta) IL-1 IL-1 IL-6 IL-6 CERVELLO (febbre, sonno) FAGOCITI TESSUTI (stimolazione di proteolisi 2

3 muscolare, fibtoblasti, calore) - CRP è la più precoce e sensibile proteina di fase acuta - A volte è associato SAA (infiammazione acuta) - Cascata delle proteine di fase acuta - PRECOCI:.CRP e AAC - INTERMEDIE:..HPT, AAG, AAT, C4, FIB - TARDIVE:.C3, CER RISPOSTA di FASE ACUTA CRP PFAN INTERMEDIE TARDIVE Figura 1: PCR = proteina C reattiva (precoce); PFAN = proteine di fase acuta negativa Nell epatopatico e parzialmente nel nefropatico la reazione di fase acuta è soppressa. 3

4 - ALB (albumina) Figura 2: rappresentazione di una molecola di albumina con siti di legame per molecole e ioni trasportati -Proteina di 580 aa; sintetizzata dal fegato (ne basta il 25%) -Livello ematico normale: 3,5-5,0 g/dl -Indicatore di stato nutrizionale (ma t 1/2 =15-19gg) -Carrier di anioni, soprattutto bilirubina (che nei neonati può ledere i nuclei della base); acidi grassi liberi; ormoni steroidei; cationi (Ca2+; Cu+/2+) -Sorgente di aa per i tessuti periferici -Agisce come tampone -Proteina di fase acuta negativa (diminuisce nella flogosi) Acidi grassi liberi si formano nel digiuno. l albumina li porta al fegato che sintetizza nuovi trigliceridi e li lega alle VLDL (utili per il miocardio). Ci sono analbuminemie congenite senza edema (la sintesi di altre globuline plasmatiche mantiene la pressione oncotica) ma con alterazione del metabolismo dei grassi. Ca2+: 10 mg/% o 5 meq/l legati per metà all albumina. Questa metà è in effettiva; importante è la componente libera. Il rapporto tra Ca2+ libero e legato dipende dal ph. Alterazioni dell equilibrio acido-base possono far associare Ca2+ e albumina portando ipocalcemia. Cu+: 80 mg/l legato per il 10% all albumina e per il 90% alla cerulo plasmina. Si lega a residui di istidina (Hys). Dalla velocità di legame e dall affinità dipende la biodisponibilità. Iperalbuminemia, rara, dovuta a disidratazione Ipoalbuminemia: (<3,2 g/dl) -epatopatie croniche -malnutrizione -edema (<2,5g/dl), ascite -perdite intestinali -malattie renali -malattie cutanee secernenti -ustioni Bisalbuminemia: banda dell albumina sdoppiata. -Il paziente può averla parchè il fegato produce il 50% dell albumina con 1aa diverso (alloalbuminemia) 4

5 -Può essere indotta da farmaci in caso di superdosaggio o da patologie quali ipotiroidismo e pseudo cisti pancreatica. 2) zona elettroforicamente poco rilevante - AAT (α1antitripsina) - Responsabile del picco delle α1. - E un inibitore delle proteasi seriche: - collagenasi ed elastasi nei processi infiammatori del polmone (si può arrivare anche all enfisema); funzione primaria - fattori della coagulazione; funzione secondaria - Se il picco delle α1 è basso si richiede l esame per sapere se c è una mancanza congenita di AAT (omozigosi per allele Z); α1antitripsina inferiore a 15% del normale. - Livello ematico normale: 0,8-2 g/l - in situazioni di flogosi causate da infezioni e necrosi dei tessuti. - AAG (α1glicoproteina acida) - Costituita per il 50% da glucidi e per il 50% da aa; particolarissima - Non si conosce la sua esatta funzione. - E un indicatore di fase acuta: - nei processi infiammatori, pare a causa della proliferazione cellulare - anche in gravidanza e nei tumori, non è un indice molto sensibile - è dai glucocorticoidi, nelle neoplasie, nelle flogosi, nello stress chirurgico - nelle epatopatie, nelle malattie renali, estrogeni - AAC (α1antichimotripsina) - Proteina che aumenta precocemente nelle reazioni di fase acuta - α-fetoproteina - Presente nel feto, diminuisce notevolmente dopo la nascita - Aumenta - in gravidanza, nell epatocarcinoma e nel teratoma testicolare - nel liquido amniotico e nel siero materno in caso di anencefalia e spina bifida - Diminuisce - nel siero della madre se c è trisomia 21 (Down) 5

6 3) - HPT (aptoglobina) - E una proteina di fase acuta - nelle infiammazioni acute e croniche, nelle neoplasie e nelle nefrosi (per aumentata sintesi del genotipo di HPT z-z che non passa il filtro renale) - La sua principale funzione è però legare l emoglobina libera a seguito di emolisi intravasale (processo patologico) formando un complesso che non viene filtrato a livello glomerulare (in corrispondenza del tubulo contorto distale e dotto collettore dove il ph si abbassa precipiterebbe formando dei cilindri che possono danneggiare il rene). Il complesso HPT-Hb viene captato dal fegato. se l emolisi è eccessiva intervengono nell ordine l emopessina (si lega all eme) e l albumina (metalbumina). - in crisi emolitica, anemia, avvelenamento, valvole cardiache che lisano i globuli rossi. - AMG (α2macroglobulina) - E una proteina ad alto peso molecolare (fino a Da) - E un inibitore delle proteasi e controlla il C - Importante ad es. nella gestosi gravidica = ipertensione arteriosa in gravidanza. Renina- proteasi: se non c è più un inibitore la pressione arteriosa sale. - nella sindrome nefrosica - nella risposta di fase acuta, nelle pancreatiti, nel carcinoma della prostata. - CER (ceruloplasmina) - Proteina azzurra, se purificata, perché trasportatore di rame e responsabile della cupremia. Una molecola lega 8 atomi di Cu (4Cu2+ o 4 Cu+). - Ossida il ferro ferroso Fe2+ a ferro ferrico Fe3+ e altre molecole come ad es. neurotrasmettitori (amine biologiche); è uno scavenger dell O 2. - in gravidanza (bersaglio di estrogeni); nelle infiammazioni; neoplasie e leucemie come linfoma di Hodgkin - nel morbo di Wilson (alterazione del metabolismo del Cu con suo accumulo in rene, fegato, cervello e degenerazione epatolenticolare) e in cirrosi giovanile. - Se la cupremia è 30 mg/l (e CER è quindi nei limiti della norma) richiedere la cupruria (ricerca di Cu nelle urine) 6

7 4) - TRF (transferrina) - METABOLISMO DEL FERRO: Il ferro è introdotto con la dieta sotto forma di Fe alimentare. Si lega a una FERRITINA intestinale (1 apoferritina lega 8 atomi di Fe) che lo trasporta nell eritrocita. Sulla membrana basolaterale dell eritrocita si trova la TRANSFERRINA, una proteina abbondante ( mg/dl). Il Fe3+ lega la transferrina saturandola; essa lo trasporta nel torrente ematico. In questi passaggi il ferro cambia valenza da Fe2+ a Fe3+. - La ceruloplasmina ossida il ferro e permette che venga legato alla transferrina. TRF + 2 atomi di Fe3+ TRF diferrica (1/3 delle molecole) TRF + 1 atomo di Fe3+ TRF monoferrica (2/3 delle molecole) TRF diferrica ha maggior attività nei confronti dei recettori periferici. Tramite la circolazione sanguigna il ferro giunge al fegato. - Nel fegato c è lo scambio di Fe tra transferrina e ferritina epatica (di deposito); essa è responsabile del mantenimento del 30% di saturazione della TRF, perché cede o acquista Fe a seconda che il livello di saturazione sia minore o maggiore del 30%. - Il midollo osseo è il principale bersaglio del ferro - Tutte le cellule necessitano ferro per la sintesi di DNA e RNA (enzima ributile reduttasi riduce il ribosio a desossiribosio) - I recettori della TRF, presenti su tutte le cellule, captano il Fe ed entrano nella cellula dove liberano il Fe per poi tornare al loro posto sulla membrana. - Esiste a questo livello un meccanismo a feedback: - Se nella cellula c è poco ferro viene sintetizzato più recettore; i componenti del recettore vanno in circolo e con gli esami si dimostra carenza di ferro - se c è troppo ferro il recettore è più lento nel trasportarlo all interno della cellula. - Sideremia normale: μg/dl - Eritrociti anomali, diminuzione della sideremia, aumento della transferrina (con saturazione <30%); verificare la ferritina circolante che rispecchia il livello di ferritina di deposito - La ferritina si alza quando c è un infezione (come proteina di fase acuta); perciò si procede al dosaggio dei recettori solubili della transferrina. - Nelle malattie infettive la transferrina tende a diminuire ANEMIA: condizione che si verifica quando: - sideremia < μg/dl - [Hb] di un globulo rosso piccolo con volume < 80 MCV (volume corpuscolare medio) - [Hb] totale del sangue La situazione opposta è l emosiderosi e si verifica se la sideremia è > 150 μg/dl. La principale causa di anemia è la carenza di ferro; in questo caso si ha: - sideremia - TRF - saturazione TRF % Non è però l unica causa, anche infezioni croniche e neoplasia possono dare anemia, senza che ci sia carenza di ferro: - sideremia - TRF - saturazione di TRF % 7

8 Per verificare se ci sia un anemia ci sono 3 livelli di indagine: -1- Valutare TRF - TFR aumenta in stati ferrocarenziali, in gravidanza, nella terapia estroprogestinica, anemia metaemorragica - TFR diminuisce nelle sindromi protido-disperdenti, nelle anemie delle malattie croniche (processi infiammatori e neoplastici), nelle epatopatie (per diminuita sintesi epatica), malnutrizione, atransferrinemia congenita -2- Valutare la [C] della ferritina circolante che rispecchia la [C] della ferritina di deposito. Se è diminuita c è anemia. Tuttavia essendo una proteina di fase acuta essa sarà aumentata se c è un infiammazione, anche questa è accompagnata da anemia -3- Ricercare i recettori solubili della TRF. Essi consentono di valutare il deficit di ferro a livello cellulare. Riflettono il numero dei recettori cellulari. E un indice precoce dello sviluppo di deficit funzionale di ferro rispetto ad altri indici quali la ferritina. A differenza di quest ultima si mantiene normale (3-9 μg/l) nei pazienti con infiammazioni, neoplasie e epatopatie ed è quindi un buon indice di discriminazione tra anemia sideropenia e anemia delle condizioni croniche. ANEMIA EMOLITICA: abnorme distruzione dei globuli rossi con: - sideremia, - TFR, - % saturazione di TRF (tutta la TRF si satura) C è un sovraccarico di ferro e emosiderosi SATURAZIONE TRF Saturazione % = (ferro μg/dl / max[fe] trasportabile dalle proteine) x mg di transferrina lega 1,26 μg di ferro (total iron binding capacity) mg TFR lega 375 μg di Fe (bisogna vedere la percentuale di saturazione) - Valori di riferimento: 2-3,5 g/l - Hb: definisce il grado di anemia e esprime a posteriori una misura quantitativa della gravità della sideropenia. da solo è un dato poco specifico - Sideremia: rappresenta il Fe3+ legato alla TRF. Indice sensibile negli stati di lieve sideropenia 8deplezione totale delle riserve senza però ancora anemia). Ha però ritmo circadiano e alta variabilità individuale (maschi: μg/dl; femmine: μg/dl) sideremia: condizioni iperemolitiche, epatopatie con citolisi, anemia sideroblastica, siderocromatosi ereditaria sideremia: aumentata perdita (es. mestruazioni), diminuito apporto o assorbimento. 8

9 - C (complemento) - Il complemento è un sistema di diverse proteine di cui 9 sono le principali - La frazione più abbondante è C3 - Il complemento si attiva per 2 vie: - classica: Ag+Ab+C1 C4+C2 C3(amplificazione) C5C6C7(MAC) C9(lisi cellulare) - alternativa: parte dal C3b (con partecipazione di fattori B e D) - Esami: - diminuzione di C3 e diminuzione di C4 via classica - diminuzione di C3 ma C4 normale via alternativa - Per attivare il C ci vogliono 2 IgG o 1 IgM; CASCATA del COMPLEMENTO: C1 si lega al complesso immune e si attiva (C1s) ad esterasi; scinde C4 in C4a (inattivo) e C4b che lega C2 facendolo diventare substrato di C1s che lo scinde in C2b (inattivo) e C2a. Il complesso C4b2a è l enzima C3 convertasi (esterasi) che scinde C3 in C3a (talvolta dosato come espressione di scissione di C3) e C3b che unito alle precedenti frazioni dà vita all enzima C5- convertasi della via classica (C4b2a3b). La C5-convertasi scinde C5 in C5a (inattiva) e C5b. Il complesso C4b2a3b5b per via non enzimatica lega in successione C6, C7 con passaggio del complesso da stato idrofilo a idrofobo rendendolo adatto a inserirsi nel doppio strato lipidico della membrana cellulare. L ingresso di C8 e C9 permette la formazione del poro sulla membrana e successiva lisi cellulare. - La concentrazione del terzo componente del complemento (C3), determinata nel siero, è considerata un indicatore di rischio dell infarto del miocardio; infatti, esso si correla positivamente con il colesterolo-ldl ed è prodotto dai macrofagi probabilmente durante la captazione di lipoproteine LDL ossidate. - C3 aumenta per blocco del suo catabolismo (blocco C3 e C3b); nella cirrosi biliare primitiva e nelle colestasi gravi; in reazione di fase acuta - C3 e C4 diminuisce (per attivazione del C per via classica) in lupus eritematoso sistemico; poliartrite cronica primaria; anemie emolitiche autoimmuni; gastrite atrofica; glomerulonefrite membranosa - C3 diminuisce e C4 normale (C attivato per via alternativa) indice di malattie infettive - Valori di riferimento: C3: 0,90-1,80g/l C4: 0,10-0,40g/l - Nell elettroforesi su plasma tra β e γ si forma la banda del fibrinogeno; nell elettroforesi su siero no. - FIB (fibrinogeno) - molecola complessa costituita da 2 coppie di 3 catene α, β, γ. 9

10 - implicata nell emostasi 5) - Ig (immunoglobuline) - Le immunoglobuline sono un gruppo di proteine eterogenee, che migrano principalmente nella zona γ, ma anche nella zona β e più raramente nella zona α; costituiscono gli anticorpi umorali, prodotti dalle plasmacellule che derivano dai linfociti B attivati. - Esistono 5 classi di immunoglobuline (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD) con struttura molecolare simile: 2 catene pesanti (γ,α,μ,ε,δ) e 2 catene leggere (κ,λ). - Le IgG sono quelle a maggiore concentrazione nel siero - IgG: 0,6 1,8 g/dl - IgA: 0,08 1,9 g/dl - IgM: 0,09 0,4 g/dl - Se sono aumentate le IgM l infezione è in atto o recente - Se sono aumentate le IgG l infezione è pregressa (cicatrice sierologica) - Le IgM sono pentameri; le IgA dimeri (uniche Ig secretorie, presenti nel latte, nella saliva, nel muco, nelle secrezioni intestinali); le IgG sono le uniche Ig che passano dalla madre al feto attraverso la placenta (il bambino nasce con le IgG materne e assume le IgA del latte); le IgE sono usate per quantizzare le allergie di I tipo (ipersensibilità di tipo I): il frammento Fc delle IgE si lega alle mastcellule piene di granuli di istamina. Esistono 3 principali tipi di allergia: - allergie alimentari - allergie da contatto (polline, via cutanea) - allergie ai farmaci (es. alla lidocaina - anestetico non prevedibile) - Test che identificano prima le IgE generali, poi le IgE specifiche. - Dalla ventesima settimana c è un brusco aumento delle IgG materne che passano la barriera placentare. Comincia la sintesi da parte del feto delle IgM. Al momento del parto le IgG materne diminuiscono e scompaiono all ottavo mese. Aumentano le IgM, IgG e IgA del bambino, ma fondamentali sono le IgA materne trasmesse con il latte. Se c è infezione intrauterina le IgM alla nascita sono elevate. 10

11 IgG materne IgM fetali IgG fetali IgAs meterne Figura 3: sviluppo sistema immunitario dal concepimento a 6 mesi di vita In condizioni normali la proporzione nella produzione di catena pesante e leggera è 1:1. - Nel mieloma la plasmacellula sintetizza più catene leggere di quelle pesanti; catene leggere libere in forma dimerica proteinuria dio Bence-Jones (catene leggere-140aa-di IgG precipita a ) - γ-patie policlonali: l aumento delle proteine della zona γ si estende a tutto il tratto della zona - epatopatie - malattie del collageno - infezioni - γ-patie monoclonali: si osserva un picco ristretto nella zona γ QUADRI CLINICI TIPICI: - LES (Lupus Eritematoso Sistemico), malattia autoimmune - C3,C4; PCR; γ-patia policlonale - IMMUNODEFICIENZA -alta la banda α1 e α2 basse o in tracce IgG, IgA, IgM - SINDROME NEFROSICA -alta la α-macroglobulina La terapia sostitutiva con estrogeni (sia terapeutica che anticoncezionale) simula una reazione di fase acuta: - TFR, HPT, α1, α2, AAT, CER. -MIELOMA MULTIPLO -es. IgG e soppressione di IgM e IgA γ-patia monoclonale - Il siero del neonato ha elevati livelli di PCR, α-macroglobulina, α-antitripsina; se sono elevate anche IgM e IgA è in corso un infezione. 11

12 INDICAZIONI allo STUDIO delle PLASMAPROTEINE 1- Presenza componenti monoclonali 2- Presenza e severità di un processo flogistico (se PCR) 3- Aumento turnover eritrocitario (vedere TRF, saturazione, HPT- anemia emolitica) 4- Attivazione del complemento (dosare C3 e C4 malattie autoimmuni) 5- Perché la VES è aumentata (associata a FIB o proteine di fase acuta) 6- Stato nutrizionale (se l albumina scende c è un grave carente stato nutrizionale, doso ALB, pre-alb, RBP, TRF)) 7- Patologie da deficit di proteine specifiche (AAT enfisema, CER morbo di Wilson) 8- Follow-up e controllo dell efficacia della terapia Capitolo 1.1 COMPONENTE MONOCLONALE 12

13 COMPONENTE MONOCLONALE Picco γ causato da: - iperproliferazione di un clone di plasmacellule - sintesi di Ig omogenee per struttura e specificità - deficit a carico delle altre Ig Più del 95% dei soggetti ha una componente monoclonale <15 g/l Il 92% dei soggetti ha una componente monoclonale <10 g/l Il rischio di progressione è strettamente associato con la componente monoclonale. CONDIZIONI ANOMALE ASSOCIAT E alle Ig - MGUS: gammopatia monoclonale di incerto significato Benigno. Si ha nel 99% dei casi (IgM, IgG, IgA o IgD) - MIELOMA MULTIPLO: riguarda IgA e IgG. Nel MM il rapporto tra catene H e L è >1:1. Ci sono catene L singole o dimeriche libere nel sangue. Nelle urine si ritrovano le proteine di Bence-Jones. Il clone invade il midollo osseo provocando anemia, leucopenia e difficoltà alla coagulazione. - MACROGLOBULINEMIA di WALDENSTRÖM: linfoma che riguarda le IgM MALATTIE CAUSATE da Ig - CRIOGLOBULINEMIA I e II: sono Ig che precipitano ad una temperatura compresa tra 4 e 37 C. Possono essere costituite da Ig singole monoclonali, Ig monoclonali con attività anticorpale verso Ig policlonali, Ig policlonali miste. causa della precipitabilità: forse contenuto ridotto in carboidrati. - AMILOIDOSI: deposizione IMMUNODEFICIENZE - AIDS è la più comune 13

14 STIMOLAZIONE CRONICA - Malattie autoimmuni (LES, artrite reumatoide) - Infezioni croniche TRANSIENTI - Infezioni pediatriche - Passaggi neonatali dalla madre - Infezioni virali - A seguito di un trapianto di midollo - Ipersensibilità ai farmaci (soprattutto sulfamidici) - MGUS è l unica condizione benigna; come differenziarla dalle altre e specialmente dal MM (mieloma multiplo)? 3 parametri: - % di plasmacellule nel midollo - proteine circolanti nel siero - manifestazioni cliniche MGUS MIELOMA MULTIPLO MACROGLOB. di WALDENSTRÖM % plasmacellule < <10 % proteine <3 3 3 <3 sintomatico NO SI SI SI AMILOIDOSI PRIMARIA Secondo uno studio americano i soggetti con MGUS sono a rischio per lo sviluppo del mieloma. Qual è il rischio reale? L unico fattore di rischio accertato per la progressione di MGUS a MM è la [C] di CM: CM rischio Sospetto di MGUS; TEST RACCOMANDATI: - Visita - Emocromo - Siero, calcio, creatinina - Elettroforesi del siero proteine totali - Elettroforesi delle urine secrezione proteine nelle urine delle 24h - Immunofissazione del siero e delle urine per discriminare CM - Catene L (κ e λ); non è un esame standard - Esame del midollo osseo Non si eseguono se CM<1,5 g/dl perché troppo invasivi - Biopsia dello scheletro Se la componente monoclonale è >15 g/l si proceda con: biopsia ossea radiografia dello scheletro PATOLOGIA INCIDENZA MGUS (> o = 50 anni) 3,2% Mieloma multiplo 40 /(milione di persone per anno) AL amiloidosi 8,9 /(milione di persone per anno) Waldenström (maschi) 3,4 /(milione di persone per anno) Waldenström (femmine) 1,7 /(milione di persone per anno) Per diagnosticare mieloma: - CM in siero e/o urine + plasmacellule nel midollo 14

15 e uno dei seguenti: - Calcium elevation - Renal insufficiency - Anemia - Bone desease - MIELOMA MULTIPLO (MM) Massa clonale Citochine Componente M - anemia - anemia - rene da mieloma - citopenia - distruzione osso - iperviscosità - plasmocitoma - reazione di fase acuta - immunodeficienza - immunodeficienza - immunodeficienza Il soggetto con mieloma deve essere trattato solo se sintomatico AMILOIDOSI - Clone molto piccolo che produce una proteina molto tossica. - Amiloidosi: deposito extracellulare di proteine autologhe che si riuniscono in fibrille con struttura a foglietto β causando un danno funzionale e strutturale dell organo coinvolto. Le proteine tendono ad aggregare perché nella struttura β sono termodinamicamente meno stabili rispetto alle proteine normali. Stimoli principali: T C, ph, ioni metallici, ossidazione. - Amiloidosi più diffusa è l Alzheimer - L amiloidosi deriva dall azione proteolitica su un precursore che nel caso delle gammopatie sono le catene L prodotte dalle plasmacellule CAUSA BASILARE: - La amiloidosi si basa sul fatto che una proteina può assumere 2 conformazioni diverse: una ad α elica (non tossica) e una a β foglietto ripiegato (tossica); la quale provoca una malattia simile a quella dei prioni (PrP) per eziologia. - Birifrangenza verde mela con luce polarizzata dopo colorazione rosso congo; fibre non ramificate con diametro di 10 nm - Alcune forme di amiloidosi sono localizzate, altre sistemiche. si classificano sulla base della proteina coinvolta: - Proteine amiloidi: - β Alzheimer - PrP encefalopatie spongiformi - L (catene leggere immunoglobuline monoclonali) sistemica - Nell 80% dei casi catene libere leggere λ che si depositano nei tessuti tranne il cervello - Macroglossia (12% dei pazienti con amiloidosi) - Porpora periorbitaria (6%); aspetto tipo procione (lesione periorbitaria, rottura di piccoli vasi) - Pseudoipertrofia muscolare (<1%) - Lesioni alle unghie (2-3%) - Shoulder pad 15

16 DIAGNOSI - Aspirato in regione periombelicale con ago sottile e colorazione. - Identificare e caratterizzare CM con elettroforesi ad alta definizione su agarosio o capillare associata a immunofissazione. Nel 56% dei pazienti con AL non si vede niente sul tracciato elettroforetico. L immunofissazione aumenta di 10 volte la sensibilità dell elettroforesi PROTEINA di BENCE-JONES (BJ) Proteina costituita da catene leggere libere monoclonali secrete da cellule B. E stato il primo marcatore di neoplasia scoperto. Il clone può essere sia maligno (solitamente associato a MM) che benigno (associato a MGUS) Cenni storici. La proteina di BJ fu osservata per la prima volta da un medico inglese (Watson) in urine riscaldate. Il calore denatura le proteine le quali precipitano. L ALB forma un precipitato che non si scioglie mai; la proteina di BJ ha, invece, un comportamento particolare: verso la temperatura di 60 C sii forma il precipitato, che però si scioglie se continuiamo a riscaldare (T 90 C) per poi riformarsi nuovamente durante il raffreddamento. Il dottore parlò di questa sua scoperta al dr Bence-Jones che se ne attribuì il merito in una pubblicazione. Le catene leggere possono essere di tipo κ o λ. si ritrovano entrambe in queste proporzioni 2/3 di catene κ e 1/3 di catene λ. Le catene λ formano dei dimeri che filtrano meno facilmente dei cloni κ nelle urine. Come risultato si avrà - una % maggiore di cloni λ nel siero - una % maggiore di cloni κ nelle urine Tutti gli individui producono catene leggere in eccesso. Si ha quindi una perdita giornaliera fisiologica di catene libere policlonali (PELC) di circa 5-10 mg/die. Esse formano piccole bande oligoclonali sul tracciato elettroforetico delle urine. Si parla anche di tracciato a scala. MALATTIE ASSOCIATE a BJ-P - Comuni: - mieloma multiplo - amiloidosi AL - morbo di Waldenström - malattia da deposito - Rare - linfoma - leucemia linfatica cronica 16

17 - idiopatie (benigne o di incerto significato) Le proteine di BJ vanno ricercate nelle seconde urine del mattino tramite un elettroforesi seguita da immunofissazione. Gli antisieri utilizzati sono anti-κ, anti-λ totali con l aggiunta dell antisiero anti- CH della CM. Da 3 anni esiste un test, chiamato FREELITE, che consente di valutare il rapporto κ/λ delle catene leggere libere nel siero. E un test di routine per pazienti con gammopatie monoclonali. TEST da SCORAGGIARE (inadatti per la ricerca di proteine di BJ) - proteine totali nelle urine (precipitazione, legame col colorante [dye binding]; test poco sensibile) - stick delle urine (sostanza che cambia colore in presenza di proteine acide come l ALB e non vede le proteine di BJ) - test al calore (heat test); poco sensibile e poco specifico. Sensibilità dei diversi metodi - IFE: 1 proteina su STANDARD - citogenetica e southern blot: 1 su FISH in interfase: 1-5 su citofluorimetria: 1-5 su PCR: 1 su Capitolo

18 TECNICHE ELETTROFORETICHE ELETTROFORESI L elettroforesi consiste nella migrazione di particelle elettricamente cariche in un campo elettrico E. Nel plasma a ph 7,4 le proteine che hanno punto isoelettrico minore del ph fisiologico si dissociano come anioni. Poste in E migrano verso il polo + con velocità che dipende: - dalla carica elettrica direttamente proporzionali alla v di - dalla forza di E migrazione - dimensione e forma della molecola - proprietà del mezzo di supporto inversamente proporzionali alla v di migrazione TIPI di SUPPORTO: sono vari; i principali sono agarosio, gel di poliacrilamide o soluzioni. Permettono la separazione in base a carica e dimensione. Spesso si aggiunge un detergente carico negativamente (sodio dodecilsolfato) che eguaglia le cariche di superficie e consente la separazione solo sulla base della dimensione molecolare. Dopo la separazione le proteine vengono evidenziate con opportune colorazioni. Un particolare tipo di elettroforesi è l ELETTROFORESI CAPILLARE. In essa la separazione elettroforetica avviene in un tubo di silice fusa lungo cm e diametro compreso tra 10 e 75 μm. 18

19 Il tubo è riempito con una soluzione tampone. Le due estremità del capillare sono immerse in due provette contenenti lo stesso tampone. la separazione avviene in seguito all applicazione di una differenza di potenziale tra le due estremità. La v delle particelle è in funzione del rapporto carica/massa. Le proteine cariche negativamente sono attratte dall anodo (+). Tuttavia all interno del capillare si sviluppa anche un flusso del tampone in direzione del catodo ( ). Tale fenomeno è chiamato ELETTROENDOSMOSI. Esso è dovuto alla presenza di gruppi carichi negativamente sulla superficie del capillare (neutralizzati da una nuvola di cariche positive. Quando si applica una d.d.p. ioni positivi sono attratti dal catodo e, migrando, trascinano con sé la soluzione in cui sono immersi. - il capillare è in silice e ha cariche negative che vengono neutralizzate da ioni positivi - applicando una differenza di potenziale (V) gli ioni vanno verso il catodo (flusso osmotico, trasporto di acqua) e le proteine verso l anodo - Il flusso endosmotico vince sulla forza elettroforetica perciò tutte le proteine vanno verso il catodo (negativo) - Ig carica + migrano verso il catodo - ALB carica trascinata dal flusso endosmotico verso il catodo VANTAGGI: è un metodo automatizzabile; limite CM>0,5 g/l; utile nel monitoraggio dopo una terapia. SVANTAGGI: non consente l immunofissazione; la CM può scomparire perché interagisce col capillare. E un eventualità rara, ma possibile, che può portare a una diagnosi totalmente errata. Ricordare che CM può migrare fino a zona α2 (IgA) Al posto dell immunofissazione, dopo elettroforesi capillare è possibile applicare il metodo dell immunosottrazione (IF-ES) che permette di valutare il contributo di ciascuna Ig al picco γ: classi e tipi di Ig sono rimossi dal campione usando Ab anti-ig specifici per IgG, IgA, IgM, λ e κ. Dopo l aggiunta di ogni Ab si ripete l elettroforesi per valutare come si è modificato il tracciato IgG IgM IgA Figura 4: immunosottrazione (IF-ES) Campione da testare aggiungo Ab-anti-IgG 19

20 1,5 1 0, IgM IgA Campione senza IgG + precipitato IgG-anti-IgG IMMUNOFISSAZIONE (IFE): rende 10 volte più sensibile l elettroforesi (perché aumenta la quantità di proteina presente). tecnica usata per caratterizzare e quantificare una proteina. Procedimento: - elettroforesi - aggiunta di un Ab specifico per un CM, incubazione - eseguire ripetuti lavaggi delle proteine che non hanno reagito - evidenziare la banda di immunoprecipitazione con opportuna colorazione La quantificazione della banda è eseguita con tecniche di densiometria Capitolo 2 20

21 LIPIDI SIERICI LIPIDI SIERICI E RISCHIO ATEROSCLEROSI Attualmente la principale causa di mortalità nei paesi sviluppati sono le malattie cardiovascolari. Esse sono un disordine generalizzato delle arterie caratterizzato dalla formazione e progressivo accrescimento di placche ateromasiche culminanti con l occlusione parziale o totale del lume vasale. A seguito dell occlusione si forma un danno ischemico la cui gravità è proporzionale alla natura dell arteria coinvolta. I distretti più frequentemente coinvolti sono: - le coronarie - le carotidi e il circolo cerebrale - arterie degli arti inferiori L aterosclerosi interessa l intima e la media delle arterie e consiste in accumulo vascolare di lipidi, danno e attivazione endoteliale, attivazione e adesione piastrinica, infiltrazione infiammatoria, proliferazione di cellule muscolari lisce e loro degenerazione in cellule schiumose (cappello fibroso + core lipido-necrotico) e sovrapposizione di complicanze trombotico-occlusive. C è una 21

22 correlazione tra il fenomeno infiammatorio (quantificato dosando la CRP) e l infarto. La placca da sola è asintomatica. I lipidi sierici - aumentano nelle patologie degenerative (neoplasie e aterosclerosi) - sono diminuiti ma stanno riaumentando nelle patologie infettive ATEROSCLEROSI: - angina pectoris - morte cardiaca acuta - infarto del miocardio FATTORI di RISCHIO: - MAGGIORI- -PREDISPONENTI- -CONDIZIONALI- - iperlipidemia - sovrappeso - ipertrigliceridemia - fumo di sigaretta - inattività fisica - elevati livelli di Lp(a) - ipertensione - storia familiare - elevati livelli di - diabete omocisteina -età avanzata - elevati livelli di - gotta e iperuricemia fibrinogeno - marcatori infiammatori LIPIDI di INTERESSE CLINICO --COLESTEROLO TOTALE 200 mg/dl ; se colesterolo >240 mg/dl rischio elevato se colesterolo <150 mg/dl è basso; > 350 mg/dl è aterogeno per valori compresi tra 150 e 350 il rischio è determinato dalla quantità di HDL disponibile (importante per sequestrare il colesterolo trasportato dalle LDL) --HDL La [HDL] plasmatica è inversamente correlata all insorgenza di malattie cardiovascolari. HDL ha un ruolo nel trasporto retrogrado del colesterolo, forse ha proprietà antiossidanti e antiinfiammatorie. VALORI di HDL basso medio alto maschi < >55 22

23 femmine < >65 Nelle donne la stimolazione da parte degli estrogeni promuove un aumento delle lipoproteine HDL; effetto analogo è dato dall assunzione di livelli moderati di vino rosso (paradosso francese) --LDL Elevate concentrazioni di colesterolo LDL producono un aggravamento del rischio cardiovascolare. - LDL > 130 mg/dl valore di ALLARME - LDL < 100 mg/dl se ci sono già stati problemi coronarici Valori molto elevati di LDL si riscontrano nelle varie forme di iperlipidemia, ipercolesterolemia familiare, ipotiroidismo, sindrome nefrosica, ostruzione biliare, gravidanza. Esistono due differenti forme di LDL che hanno potenzialità aterogene diverse. - Fenotipo A: lipoproteine grandi e poco dense - Fenotipo B: lipoproteine piccole e dense Il fenotipo B ha un rischio aterogeno 3 volte superiore al fenotipo A. la predominanza del fenotipo B è ereditaria ed è una condizione denominata PROFILO LIPOPROTEICO ATEROGENO (PLA); è un quadro caratterizzato da: - LDL a fenotipo B che si accumulano più facilmente delle A nell intima delle arterie - LDL più ricche in fosfolipasi AL e più suscettibili all ossidazione - ridotta concentrazione di HDL soprattutto fenotipo 2b, che sono le più efficienti nel trasporto inverso del colesterolo - ridotto potenziale fibrinolitico - maggiore incidenza di diabete di tipo 2 - ipertrigliceridemia Questo quadro è presente almeno nel 50% dei soggetti con malattie cardiovascolari. La valutazione del fenotipo LDL non è un esame esteso a tutta la popolazione e non è eseguibile in tutti i laboratori, ma solo in centri altamente specializzati. --TRIGLICERIDI Tra ipertrigliceridemia e rischio di malattie cardiovascolari esiste un associazione; tuttavia non è chiaro se essa è imputabile ai trigliceridi stessi e alle lipoproteine che li trasportano o ai disordini metabolici associati all ipertrigliceridemia. - trigliceridi > 150 mg/dl soglia di rischio (spia di altre alterazioni metaboliche potenzialmente aterogene come LDL - trigliceridi > 200 mg/dl rischio indipendente Esiste un dimorfismo sessuale nella concentrazione dei trigliceridi: - fino ai 20 anni uguale nei 2 sessi - nella vita adulta è superiore nell uomo - dopo la menopausa uomo e donna tornano ad avere gli stessi valori L ipertrigliceridemia è presente più facilmente in obesi, sedentari, iperlipidemie familiari, pancreatiti, diabete di tipo 2, insufficienza renale cronica, abuso di alcool, fumo di sigaretta, gravidanza. 23

24 Capitolo

25 LIPOPROTEINE e DISLIPIDEMIE METABOLISMO e STRUTTURA delle LIPOPROTEINE I lipidi sono sostanze apolari, non solubili nel plasma. Vengono trasportati dalle lipoproteine, molecole sferiche che presentano un involucro esterno composto da fosfolipidi (bipolari), apoproteine e colesterolo libero (dà stabilità alla struttura). La struttura delle lipoproteine ricorda quella della membrana cellulare. Il core della molecola è costituito da colesterolo esterificato e trigliceridi. Esistono differenti classi di lipoproteine suddivise in base alla composizione chemica e alla densità. 25

26 - CHILOMICRONI: lipoproteine sintetizzate nella mucosa intestinale costituite da una piccola frazione proteica di apob48, apoai, apoaiv, apoci, apocii, apociii. trasporta trigliceridi alimentari e vitamine liposolubili. la proteina ApoB (proteina principale del metabolismo lipidico) consta di due isoforme: - ApoB48: di origine intestinale per trasporto di lipidi di provenienza alimentare - ApoB100: sintetizzata nel fegato, si trova nelle LDL per trasporto dei lipidi endogeni Derivano dalla trascrizione di un singolo gene, per modificazione post-trascrizionale si differenziano. dal lume intestinale i chilomicroni passano nel sistema linfatico e da qui nella circolazione sanguigna tramite il dotto toracico. Così facendo assicurano la disponibilità di grassi ai tessuti periferici. in circolo subiscono due modificazioni principali: -1-IDROLISI dei trigliceridi ad acidi grassi e glicerolo (gli ac. grassi sono la forma in cui i lipidi sono ceduti ai tessuti) ad opera della lipoproteinlipasi (LPL) endoteliale. -2-SCAMBIO di alcune apolipoproteine: rilasciano apoai e apoaiv e si arricchiscono di apoc e apoe Il complessivo impoverimento di trigliceridi dei chilomicroni si associa a una serie di trasformazioni biochimiche che portano a due prodotti di degradazione: -1-RENMANTS: molecole con core centrale di natura lipidica captati e distrutti dal fegato (recettore per le LDL legato ad apoe del chilomicrone) -2-HDL NASCENTI: precursori delle HDL plasmatiche - VLDL, IDL, LDL: le VLDL sono precursori di tutte le lipoproteine a bassa densità circolanti. Sono sintetizzate dal fegato e costituite principalmente da trigliceridi e colesterolo endogeno. il dominio proteico è quasi esclusivamente rappresentato da ApoB100. Se si squilibra il processo di idrolisi dei chilomicroni e sintesi delle VLDL si ha la steatosi. le VLDL sono secrete nel torrente ematico dove subiscono due modifiche: -1-azione dell enzima CEPT (proteina di trasporto specifica per il colesterolo esterificato) che catalizza il trasferimento dei trigliceridi alle HDL in scambio con colesterolo esterificato. VLDL si trasformano in particelle più piccole e dense. -2-scambio di apolipoproteine: ApoE e ApoC sono trasferite alle VLDL dalle HDL. ApoCII attiva la LPL che idrolizza i trigliceridi ancora presenti trasformando le VLDL in molecole più dense, le IDL (intermediate density lipoproteins) Le IDL sono molecole molto instabili; per questo motivo devono essere presenti in quantità molto bassa e rapidamente convertite in LDL. Il processo di conversione in LDL coinvolge CEPT o in 26

27 alternativa l enzima LIPASI EPATCA, che eliminano i trigliceridi rimasti e la cessione di ApoE e ApoC alle HDL 2. Le LDL sono quindi lipoproteine contenenti colesterolo esterificato e con un dominio proteico costituito prevalentemente da ApoB100. Le LDL hanno un recettore periferico che al legame con LDL la interna lizza e prende il colesterolo in essa contenuto (che viene esterificato; contemporaneamente si blocca la sintesi di colesterolo endogeno e dei recettori per le LDL). Se le LDL sono troppe esse si legano anche a recettori non specifici (scavenger) e nella cellula si accumula colesterolo (cellula schiumosa) - LPL: la sua attività è dipendente da ApoCII (fegato, endotelio, muscolo, tessuto adiposo) - LIPASI EPATICA: la sua attività è indipendente da ApoCII (fegato, surrene, ovaie) - HDL: complesso costituito da un eterogeneo gruppo di particelle adibite al trasporto di colesterolo libero, esteri del colesterolo e trigliceridi. Presentano apolipoproteine interscambiabili (tipi A, C, D, E). Ci sono due classi principali suddivise sulla base della componente apolipoproteica: - HDL 2 : contengono ApoAI e ApoAII - HDL 3 : contengono ApoAI Sono sintetizzate prevalentemente nel fegato e nell intestino. La loro funzione fondamentale è opposta a quella delle LDL: trasportano lipidi dalla periferia al fegato. Esse si legano alla superficie cellulare tramite un recettore scavenger (non specifico) che interagisce con ApoAI e assumono il colesterolo in eccesso nella cellula. Ci sono due enzimi fondamentali nel metabolismo delle HDL: - LCAT (lecitina-colesterolo-acil-transferasi): trasferisce un gruppo acilico (ac.grasso) dalla lecitina sierica al colesterolo con formazione di lisolecitina e esteri del colesterolo - CEPT: trasferisce esteri del colesterolo da HDL 2 a VLDL in cambio di trigliceridi, con contemporanea cessione di ApoC e ApoE alle VLDL L azione di questi due enzimi è responsabile di un metabolismo delle HDL che assume una forma ciclica: pre-β-hdl (proteina nascente) CEPT LCAT HDL2 HDL3 27

28 LCAT L HDL nascente è sottoforma di pre-β-hdl di forma discoidale; LCAT, favorendo l ingresso di colesterolo esterificato nella molecola, ne permette l accrescimento (abbandono della struttura discoidale per quella sferica) con trasformazione in HDL 3 e HDL 2. CEPT, invece, rimuovendo colesterolo fa assumere a HDL 2 una struttura più simile a quella delle pre-β-hdl. Il fegato capta il colesterolo delle HDL in tre modi: - capta le VLDL; è il colesterolo che esse hanno assunto dalle HDL 2 - capta le HDL tramite recettori specifici - capta le HDL che contengono ApoE per la stessa via dei chilomicroni E importante studiare il rapporto HDL/LDL e in particolare ApoAI/ApoB100 per quantizzare il flusso di colesterolo in ingresso e in uscita dalla cellula -ApoAI = 20 mg persona normale -ApoB100 = 80 mg persona a rischio Tabella riassuntiva PROTEINA DOVE SI TROVA FUNZIONE ApoAI HDL Attiva LCAT ApoAII HDL ApoB48 Chilomicroni ApoB100 VLDL, IDL, LDL ApoCI Chilomicroni, VLDL, HDL Attiva LPL ApoCII Chilomicroni, VLDL, HDL Attiva LPL ApoCIII Chilomicroni, VLDL Attiva LPL ApoD ApoE HDL, VLDL Chilomicroni, VLDL, LDL, HDL - Lipoproteina (a) [Lp(a)]: variante genetica delle LDL da cui differisce per la presenza di una molecola denomina apolipoproteina(a) (apo-a) legata mediante un ponte disolfuro al dominio proteico della ApoB100. E prodotta dal fegato e immessa nel circolo ematico. A causa di apo-a la sua affinità per il recettore delle LDL è pari al 25% e quindi rimane in circolo più a lungo rispetto alle LDL con maggiore probabilità di: - essere ossidata - essere captata da recettori scavenger (i più pericolosi nella patogenesi dell aterosclerosi perché non regolati) La Lp(a) può indurre danno endoteliale, favorisce l accumulo di colesterolo, promuove complicanze trombotiche nella placca poichè ha un azione anti-fibrinolitica in quanto è un analogo strutturale del plasminogeno e compete con quast ultimo per i recettori sulla fibrina. -Lp(a) = mg/dl -Lp(a) > 30 mg/dl soggetto normale soggetto a rischio 28

29 Pare che la [Lp(a)] sia geneticamente determinata e poco modificabile con interventi dietetici e farmacologici. Non consigliato lo screening di massa, ma il dosaggio è raccomandato per i pazienti ad alto rischio, in modo tale da impostare una terapia più aggressiva nei confronti di altri fattori di rischio modificabili con un trattamento. OSSIDAZIONE LDL Le LDL in circolo possono subire una reazione di ossidazione da parte di MIELOOSSIDASI circolanti o CERULOPLASMINA. La LDL ossidata ha un elevatissimo potenziale aterosclerotico in quanto si lega unicamente ai recettori scavenger (che non hanno il meccanismo a feedback di regolazione). E un meccanismo privo di controllo, che non può essere arginato dalle HDL. Il laboratorio ancora non dosa le LDL ossidate. - OMOCISTEINA: è un amminoacido contenente zolfo derivante dal metabolismo della metionina. Elevati livelli di omocisteina nel sangue sono correlati positivamente con un incidenza maggiore di eventi cardiovascolari precoci. Essa infatti è in grado di promuovere danno endoteliale, proliferazione della componente cellulare del vaso, innalzamento del potere aterogeno delle lipoproteine (specialmente Lp(a)). I principali determinanti della [omocisteina] nel sangue sono la VITAMINA B e i FOLATI, enzimi indispensabili nel suo metabolismo. Particolare attenzione meritano quindi gli stati di carenza. -[omocisteina] < 10 μmol/l soggetto normale -[omocisteina] tra 16 e 30 μmol/l moderata iperomocisteinemia -[omocisteina] tra 31 e 100 μmol/l intermedia iperomocisteinemia -[omocisteina] > 100 μmol/l severa iperomocisteinemia - FIBRIONGENO: Elevati livelli di fibrinogeno nel sangue sono correlati positivamente con un aumento di rischio di malattie cardiovascolari. Molteplici le cause: maggiore è il fibrinogeno presente, maggiori le dimensioni del trombo; il fibrinogeno inoltre promuove la proliferazione della componente cellulare dei vasi, l accumulo di lipoproteine nella sede del danno endoteliale, l aggregazione piastrinica. Ci sono perplessità nell uso del fibrinogeno quale indicatore di danno cardiovascolare. -fibrinogeno compreso tra 150 e 400 mg/dl normale DISLIPIDEMIE Le dislipidemie possono essere di 5 tipi: 29

30 - I tipo: caratterizzato da trigliceridi, colesterolo normale perché i chilomicroni non sono idrolizzati. I pazienti si questo tipo non sono ad alto rischio. - II tipo: dislipoproteinemia - tipo 2a: colesterolo; trigliceridi normali - tipo 2b: colesterolo; trigliceridi Sono pazienti ad alto rischio - III tipo: colesterolo; trigliceridi; mancanza o malfunzionamento dei recettori per le ApoE. Parziale demolizione delle VLDL con formazione delle IDL. Pazienti ad alto rischio - IV tipo: colesterolo normale; trigliceridi; accumulo di trigliceridi dovuto alle VLDL. Sono pazienti che solitamente diventano diabetici. Nella terapia togliere i carboidrati Importante distinguere tra tipo I e tipo IV -V tipo: o normalità colesterolo; trigliceridi; somma dei difetti I e IV = accumulo di chilomicroni e VLDL. La dieta deve coinvolgere sia i lipidi che i carboidrati. ELETTROFORESI delle LIPOPROTEINE E possibile avere un tracciato elettroforetico delle lipoproteine che permette di distinguere le dislipidemie di tipo I, IV e V. Capitolo 3 30

31 ENZIMI nella DIAGNOSTICA ENZIMI NELLA DIAGNOSTICA Alcuni enzimi sono importanti segnali di malattia. Essi hanno, in condizioni normali, una precisa ubicazione all interno della cellula: - enzimi mitocondriali (es. GLDH) - enzimi citoplasmatici (es. GPT, LDH) - enzimi ubiquitari (es. GOT, MDH) La perdita di enzimi dalla cellula e il loro riversamento nel torrente circolatorio possono essere causate da due situazioni: - lisi cellulare conseguente a necrosi (ad es. in epatiti e pancreatiti e infarti del miocardio) - epatite: transaminasi - pancreatite: amilasi - infarto: creatina fosfochinasi 31

32 - forme lievi e reversibili di danno cellulare (ipossia, alterazione del ph) che alterano la permeabilità della membrana. Ogni enzima ha una propria vita media e un certo andamento in circolo. Solitamente più è severo il processo patologico, più i livelli enzimatici sono elevati. Ciò però non vale per tutti gli enzimi: - enzimi tipo A: sono gli enzimi della coagulazione, la pseudo colinesterasi e altri; essi diminuiscono la loro attività in caso di patologia. Li troveremo quindi che nella norma. - enzimi tipo B: sono lipasi, amilasi e gli altri enzimi del tratto digestivo. Essi aumentano in caso di patologia. Altre situazioni importanti da verificare sono: - escrezione urinaria di enzimi: è un processo che riguarda solo alcuni enzimi, come l amilasi, che passano attraverso la barriera renale per le loro caratteristiche molecolari - carenze congenite di enzimi. - GPT = glutammico-piruvico-transaminasi o ALT = alanina-transaminasi ASPETTO ENZIMATICO DEI VARI TESSUTI ORGANO ENZIMA (unita/grammo d organo) fegato 35 muscolo 3,5 Enzima specifico per il fegato. E il miglior indice di citolisi epatica. E più alto nell uomo e varia con l età. GPT: epatite virale acuta, necrosi epatica su base tossica, epatite autoimmune 32

33 GPT di minore entità: cirrosi epatica, ittero colestatico, stasi epatica da insufficienza cardiaca, mononucleosi infettiva - GOT = glutammico-ossalacetico-transaminasi o AST = aspartato-transaminasi ORGANO ENZIMA (U/gr. organo) fegato 59 cuore 52 muscolo 36 cervello 15 rene 10 pancreas 3 polmone 1 Enzima di citolisi aspecifico. Enzima presente in molti tessuti sia a livello citoplasmatico che mitocondriale. GOT marcato: fisiologico nel neonato, epatite virale acuta, necrosi epatica su base tossica, infarto del miocardio, traumi muscolari, ipossia tissutale, epatite autoimmune GOT moderato: cirrosi epatica, ittero colestatico, carcinoma epatico, insufficienza cardiaca, mononucleosi infettiva, malattie muscolari, emolisi - GLDH = glutammato-deidrogenasi ORGANO ENZIMA (U/gr. organo) fegato 38 rene 4,4 cervello 3,2 polmone 2,5 Enzima specifico per il fegato. Enzima di citolisi specifico come il GPT. Il rapporto ALT/AST è importante per la diagnosi di alcune malattie: Danno lieve del fegato (lesa la membrana) GPT>GOT>GLDH epatiti acute e quasi tutte le patologie epatiche 33

34 Danno severo del fegato (lesi i mitocondri) GOT>GPT>GLDH epatite alcolica, sindrome di Reye Solitamente GPT>GOT perché GOT è inattivata più rapidamente (t 1/2 minore) e GPT (contenuto nel citoplasma diffonde più velocemente di GOT. - LDH = lattico-deidrogenasi ORGANO ENZIMA (U/gr. organo) muscolo scheletrico 147 fegato 145 cuore 124 rene 106 linfonodi 83 pancreas 50 globuli rossi 36 polmone 27 Enzima della glicolisi che si libera dopo necrosi cellulare. Enzima aspecifico di citolisi. LDH: anemie emolitiche, epatopatie, infarto del miocardio (tardivamente), neoplasie, distrofie muscolari. L enzima è costituito da quattro catene polipeptidi che di due tipi: - H (heart) la loro combinazione dà origine a 5 isoenzimi (LD-1 LD-5) - M (muscle) H4 M4 LD1 e LD2 isoenzimi cardiaci non totalmente specifici però LD4 e LD5 isoenzimi epatici Nell infarto LDH serve per monitorarne il decorso: se LDH l infarto sta guarendo ciò ha oggi perso molta importanza clinica perché si usano le troponine Nelle neoplasie aumentano tutti gli isoenzimi con extrabande 34