I GENI COINVOLTI NELLO SVILUPPO EMBRIONALE

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1 APPROFONDIMENTI DI EMBRIOLOGIA MOLECOLARE All inizio i processi dello sviluppo (divisioni cellulari, riprogrammazione genetica, approvvigionamento energetico) sono possibili grazie a proteine ed RNA accumulati nell oocito Allo stadio di 4-8 cellule (nell uomo) i processi di sviluppo passano sotto il controllo del genoma proprio dell embrione Si tratta di processi molecolari intrinseci alle cellule embrionali attivati durante la fecondazione o dovuti ad interazioni tra le cellule Le prime cellule ( blastomeri della morula) sono caratterizzate da un ampio numero di geni accessibili alla trascrizione à TOTIPOTENZA Quando l embrione giunge a contatto con l endometrio le esigenze nutrizionali innescano meccanismi di differenziazione di cellule specializzate per l adesione, invasione e trasporto (trofoblasto) Le cellule della ICM iniziano a dare origine ai primi foglietti embrionali (ipoblasto ed epiblasto) Dall epiblasto si verifica poi la formazione dei tre foglietti embrionali, ectoderma, mesoderma endoderma grazie al processo di gastrulazione La linea primitiva e il nodo di Hensen organizzano il processo di gastrulazione e la formazione dell asse antero-posteriore dell embrione e della simmetria dx-sx del corpo Questi processi sono indotti inizialmente da segnali che provengono dall esterno dell embrione Rapidamente i tessuti embrionali in formazione diventano a loro volta fonte di segnali che determinano influenze reciproche tra le cellule Tali segnali attivano o inibiscono l espressione di geni che dirigono: Istogenesi (formazione dei tessuti) e Organogenesi (formazione degli organi)

2 I GENI COINVOLTI NELLO SVILUPPO EMBRIONALE Ø La maggior parte degli studi sono affrontati su modelli animali (moscerino=drosofila, verme=c.elegans, rospo=xenopus, pollo, topo ) Ø Il numero complessivo di geni che codificano proteine segnale non differisce molto nelle diverse specie Ø La complessità delle strutture di organismi diversi deriva da schemi diversi di organizzazione dei meccanismi di regolazione Ø Il genoma umano esercita il controllo dei processi vitali mediante un numero complessivo di circa geni Ø Si stima che in una cellula siano attivi in ogni momento geni Ø Nello sviluppo embrionale avviene che un gene o gruppi di geni viene attivato o represso in una cellula o in un gruppo di cellule in un dato momento in una zona dell embrione Ø Questa attivazione o repressione modifica il fenotipo e la funzione delle cellule Ø I geni che controllano lo sviluppo embrionale sono circa (10-20% del totale dei geni)

3 CLASSI DEI GENI DELLO SVILUPPO EMBRIONALE 1. Geni degli effetti materni (bicoid, nanos, caudal ecc): geni che favoriscono l immissione nella cellula uovo di proteine con gradienti di concentrazione (bicoid >> estremità anteriore partecipa a determinare strutture della testa; nanos e caudal >>estremità caudale) 2. Geni gap (Kruppel, Knirps, hunchback ecc) le loro mutazioni provocano perdita di segmenti corporei (gap) e quindi sono necessari per costruire un determinato segmento 3. Geni pair-rule (hairy, even-skipped, fushi tarazu ecc) agiscono su coppie di segmenti 4. Geni segment polarity (engrailed, wingless, hedgehog ecc) agiscono all interno di un segmento 5. Geni omeotici (antennapedia, ultrabithorax, abdominal A ecc) determinano l identità di un segmento ossia l appartenenza alla testa, torace addome ecc 6. Geni organo-iniziatori (eyless, distalless, tinman ecc) hanno la funzione di dare inizio alla formazione di organi (occhi, arti, cuore)

4 I GENI DELLO SVILUPPO EMBRIONALE: GENI OMEOTICI E I GENI HOX q I primi geni coinvolti nello sviluppo embrionale che furono scoperti sono i geni omeotici q I geni omeotici regolano lo sviluppo anatomico in vari organismi (insetti=drosofila----mammiferi) mediante l espressione programmata di vari fattori di trascrizione q Mutazioni di tali geni comportano posizioni anomale di organi e parti anatomiche q Regolano la posizione spaziale degli organi q Contengono una sequenza di 180 nucleotidi detta homeobox che codifica per una catena di 60 aminoacidi detta omeodominio q Formano sui cromosomi degli insiemi detti complessi omeotici o complessi HOM q Si è scoperto che geni che contengono l homeobox sono presenti in tutti gli animali q I geni omeotici che contengono l homeoboxsono stati denominati geni Hox, q Sono responsabili della organizzazione spaziale degli organi lungo l asse anteroposteriore (segmentazione corporea = segmenti ripetitivi lungo l asse del corpo) q Determinano l identità della organizzazione di ogni segmento ovvero indicano quali strutture si devono formare in ciascun segmento

5 Negli insetti si forma un unico complesso HOM che si trova su un solo cromosoma Nei vertebrati il complesso HOM è stato duplicato 4 volte durante l evoluzione e si trova su 4 cromosomi diversi Nel topo I complessi sono chiamati Hoxa, Hoxb, Hoxc, Hoxd e si trovano sui cromosomi 6,11,15 e 2 Nell uomo sono chiamati HOXA HOXB HOXC HOXD e sono localizzati sui cromosomi e 2

6 I GENI COINVOLTI NELLO SVILUPPO EMBRIONALE La maggior parte dei geni coinvolti nello sviluppo embrionale codifica per: vfattori di trascrizione vfattori di crescita vrecettori per i fattori di crescita vproteine adesive I geni che controllano lo sviluppo embrionale sono espressi anche nell adulto nell adulto controllano processi di rigenerazione, riparazione tessutale in condizioni normali e patologiche

7 FATTORI DI TRASCRIZIONE (TF) ü Sono proteine che si legano a sequenze specifiche di DNA ü modulano l attività della RNAPolimerasi II (ENZIMA DELLA TRASCRIZIONE) ü Controllano l espressione di uno o più geni ü Il 10% del genoma umano codifica per TF ü In genere il controllo dell espressione avviene all inizio della trascrizione ü A monte della sede di inizio della trascrizione si trovano i promotori del gene= Box TATA che contengono sequenze regolatrici: Enhancers

8 FATTORI DI TRASCRIZIONE (TF) üesistono due categorie di fattori di trascrizione: Generali =intervengono nella trascrizione di tutti i promotori legano RNAPolimerasi II di tutti i promotori formano il COMPLESSO di INIZIAZIONE --> TRASCRIZIONE Geni-specifici=legano sequenze di DNA che controllano geni specifici maggiormente implicati nello sviluppo embrionale)

9 REGOLAZIONE DELL ESPRESSIONE DEI GENI La regolazione dell espressione (come per tutti i geni) può avvenire a livello: trascrizionale, prima e durante la trascrizione Post-trascrizionale Sugli RNA trascritti Sulla traduzione degli RNA in proteine

10 REGOLAZIONE DELL ESPRESSIONE DEI GENI DELLO SVILUPPO EMBRIONALE I geni dello sviluppo embrionale hanno alcune peculiarità che aumentano la possibilità di regolazione dell espressione: >>> numero di enhancer (intensificatori) Lunghe regioni di DNA intergenico Lunghe regioni introniche Localizzati in regioni a conformazione aperta =facile accesso RNAPolimerasi II (ENZIMA della TRASCRIZIONE) al PROMOTORE = avvio trascrizione

11 FATTORI DI CRESCITA (GF) Ø Un fattore di crescita è una molecola in grado di regolare attività cellulari come: v Proliferazione v Migrazione v Sopravvivenza/morte v Attivazione/Repressione geni = Differenziamento v Lo stesso fattore può avere più azioni nella stessa cellula v Lo stesso fattore può avere azioni opposte in cellule diverse Ø In base a struttura molecolare e funzione i GF vengono suddivisi in 10 famiglie o superfamiglie Ø Sono indicati con acronimi o sigle che di solito si riferisce a prima loro funzione scoperta Ø Nello sviluppo embrionale sono coinvolti GF formati da polipeptidi a basso peso molecolare (poche decine AA)

12 RECETTORI PER I FATTORI DI CRESCITA NELLO SVILUPPO EMBRIONALE v Per ogni GF (ligando) esiste un recettore specifico v Polipeptide/proteine in grado di legare il GF (ligando) in modo specifico v Il recettore è espresso sulla membrana delle cellule che rispondono al GF v Una cellula può avere recettori per più GF v i recettori regolano l attività di proteine intracellulari dando luogo a trasduzione del segnale intracellulare v Il segnale intracellulare raggiunge vari bersagli, spesso TF v Esistono fattori di crescita non proteici che agiscono su processi dello sviluppo embrionale =ormoni steroidei e acido retinoico (RA)

13 PROTEINE ADESIVE NELLO SVILUPPO EMBRIONALE o o Proteine intrinseche della membrana che generano forze di attrazione molecolare più o meno stabili (legami non covalenti): q Adesione omofilica: contatto tra proteine identiche tra loro q Adesione eterofilica: contatto tra proteine di tipo diverso Possono mediare l adesione tra: q Cellula-cellula q Cellula-matrice

14 DIFFERENZIAMENTO INIZIALE DELLE CELLULE EMBRIONALI Il microambiente delle tube influenza l espressione di alcuni geni nelle prime cellule embrionali o blastomeri OCT4 (Octamer-binding Transcription Factor 4): NANOG SOX2 (Sry related HGM-box 2) Questi geni codificano per enzimi capaci di mantenere le cellule nello stato indifferenziato (cellule staminali embrionali dotate di totipotenza differenziativa) E probabile che oltre all ambiente esterno, tali geni siano influenzati ed espressi grazie a proteine di segnale endogene WNT (Winglessand Integrated) Attivina e Nodal appartenenti alla famiglia di TGFbeta (Transforming Growth Factor beta)

15 COMPATTAZIONE in seguito all espressione di queste molecole i blastomeri assumono la forma poliedrica e adattano le proprie superfici le une con le altre tale modificazione viene definita compattazione Il cambiamento di forma delle cellule è dovuto a ridistribuzione delle molecole di adesione (E-Caderine) Le E-caderine mediano interazioni omofiliche tra cellula e cellula con la costituzione di giunzioni tra le superfici cellulari le E-caderine si legano al citoscheletro interno di actina dei blastomeri mediante catenine nelle cellule più periferiche della morula le E-caderine sono espresse prima su tutte le superfici e in seguito solo sulle superfici baso-laterali ciò determina riorganizzazione dell architettura cellulare e cambiamento della forma cellulare (da sferica a poliedrica)

16 MORULA in questa fase è possibile distinguere uno strato di cellule periferiche che appaiono più chiare e un gruppo di cellule più scure all interno questo è ancora più evidente in sezioni della morula colorate con metodi istochimici le cellule periferiche sono unite da giunzioni strette (occludens FORMATE DA OCCLUDINE E CLAUDINE) le cellule più scure interne costituiscono la massa cellulare interna (ICM) le cellule interne più scure stabiliscono contatti tra le loro superfici laterali mediante specializzazioni del tipo nexus la presenza delle giunzioni nexus determina una integrazione funzionale tra le cellule della massa cellulare interna

17 ULTERIORE DIFFERENZIAZIONE DELLE CELLULE DELLA MORULA Le cellule periferiche si differenziano ulteriormente e diventano le cellule del trofoblasto Ciò avviene mediante l espressione di altre molecole di adesione intercellulare come: I-CAM (Inter Cellular Adhesion Molecule) Selettine Integrine Inoltre le cellule destinate a divenire trofoblasto incrementano nel loro citoplasma il fattore di trascrizione CDX2 (Caudal type homeobox trancription factor 2) Queste modificazioni sarebbero sostenute da BMP4 (Bone Morphogenetic Protein 4) che inibisce l espressione dei geni della staminalità (OCT4, NANOG e SOX2) nelle cellule periferiche e fa esprimere loro CDX2

18 MODIFICAZIONI DELLA MORULA all interno della tuba uterina si hanno ulteriori trasformazioni che portano alla costituzione della blastocisti tra le cellule della morula cominciano a comparire piccole cavità ripiene di liquido richiamato dall esterno Il liquido è trasportato dalle cellule periferiche più chiare che dispongono di pompe Na/K ATP dipendenti, e aquaporine (canali per il passaggio dell H2O) le cellule della massa cellulare interna si distaccano dalle cellule periferiche Si costituisce la BLASTOCISTI

19 INTERAZIONI TROFOBLASTO- ENDOMETRIO le cellule del trofoblasto esprimono L-selectine che interagiscono con oligosaccaridi espressi dalle cellule dell endometrio uterino le cellule del trofoblasto che ricoprono il polo embrionale cominciano a inserirsi tra le cellule epiteliali dell endometrio a ciò segue l interazione tra molecole espresse sulla superficie delle cellule trofoblastiche (integrine: avb3) e molecole espresse nella matrice connettivale dell endometrio (laminina, fibronectina) il legame integrina-laminina favorisce l attacco il legame integrina-fibronectina stimola la migrazione cellulare l interazione integrina molecole della matrice avvia la trasduzione del segnale per la proliferazione e differenziazione delle cellule trofoblastiche

20 FATTORI MOLECOLARI DELLA DIFFERENZIAZIONE DI IPOBLASTO ED EPIBLASTO (OSSERVAZIONI SPERIMENTALI SU ANIMALI) Øcausalmente alcune cellule della ICM esprimono FGF4 (Fibroblast Growth Factor4) Øciò avviene sotto l azione di OCT4 e SOX2 Øtali cellule continuano ad esprimere NANOG e diventano cellule dell epiblasto Øaltrecelluledella ICM esprimono invecefgf2 ØFGF2 induce queste cellule a produrre GATA4 (GlobinTranscription factor 4), GATA6 e SOX17 (Sry-box 17) Øtali cellulediventano lecelluledell ipoblasto