Corso di Laurea: Laurea Triennale in Biotecnologie. Nome del corso: Biologia Molecolare e Microbiologia. Responsabile del Corso.

Transcript

1 Corso di Laurea: Laurea Triennale in Biotecnologie Nome del corso: Biologia Molecolare e Microbiologia Responsabile del Corso tipologia del Corso Sonia Senesi Corso di 12 CFU, 2 moduli di 6 CFU: Biologia molecolare (I modulo) e Microbiologia (II modulo) Responsabile del I (Biologia molecolare) tipologia del I Responsabile del II modulo Microbiologia) tipologia del II Obiettivo formativo generale del I Elenco degli argomenti trattati nel I Giovanni Cercignani Lezioni, 6 CFU Sonia Senesi Lezioni (5 CFU), Laboratorio (0.5 CFU). Esercitazioni (0.5 CFU). Fornire agli studenti una metodologia di studio e basi operative per apprendere il funzionamento degli organismi a livello molecolare, con particolare riguardo ai meccanismi funzionali alla replicazione, trascrizione e traduzione dei genomi. Comprendere e saper utilizzare operativamente le proprietà fisiche, chimiche e biologiche di DNA, RNA e proteine connesse con i suddetti meccanismi. Approfondire i processi di replicazione, trascrizione e trasformazione del DNA, di traduzione dell RNA in proteine e di modulazione dell espressione genica nei batteri. Apprendere gli elementi fondamentali delle tecniche di manipolazione del DNA, sia a fini biotecnologici sia nelle applicazioni alla ricerca di base 1 CFU: Strutture e funzioni di nucleotidi ed acidi nucleici. Introduzione alla Biologia molecolare. L oggetto di studio, la storia, i metodi e gli obiettivi. Evidenze storiche per il ruolo funzionale del DNA. Le strutture dell RNA. L esperimento di Meselsohn e Stahl: la replicazione del DNA è semiconservativa. Il flusso dell informazione genica: dal DNA all RNA alle proteine. I costituenti degli acidi nucleici: le basi azotate, i nucleosidi ed i nucleotidi; fondamenti di bioenergetica, accoppiamento energetico, intervento dei nucleosidi trifosfati. Tecniche di isolamento ed analisi degli acidi nucleici. Le regole di Chargaff, la denaturazione del DNA. Legami a idrogeno e altre interazioni non covalenti alla base del riconoscimento tra biomolecole. Il modello di Watson e Crick. Le forme del DNA e loro parametri geometrici. I due filamenti sono antiparalleli. Il solco

2 maggiore ed il solco minore. Si possono leggere sequenze nel DNA a doppia elica. 2 CFU: Sintesi proteica. Generalità sull espressione genica: unità trascrizionali negli Eubatteri, i loro segnali di inizio e di terminazione; formazione degli mrna e degli RNA stabili. La traduzione negli Eubatteri. Ruolo e struttura dei trna. Attivazione degli amminoacidi. Le amminoaciltrna sintetasi. Struttura e assemblaggio del ribosoma. I fattori di inizio della traduzione. N-formil-Metionina: sintesi e ruolo. Il codice genetico: ridondanza e wobble hypothesis. La fase di allungamento: ruolo delle proteine G. La fase di terminazione della traduzione. Accuratezza della sintesi proteica: considerazioni teoriche e fatti sperimentali. Amminoacidi omologhi e isosterici: attività correttive di alcune amminoacil-trna sintetasi. La regolazione dell espressione genica in procarioti. Ruolo delle terminazioni dipendenti da Rho nella espressione di diversi cistroni di un unica unità trascrizionale. Principali differenze nella trascrizione/traduzione dei geni negli Eucarioti rispetto ai Procarioti. 3 CFU: Replicazione del DNA negli eubatteri. La replicazione del DNA in E. coli: bidirezionalità della replicazione. La topologia del DNA e le topoisomerasi. Le conseguenze e le funzioni del superavvolgimento nel duplex di DNA circolare e lineare. Reazione di polimerizzazione. La DNA polimerasi I e le sue attività enzimatiche. La polimerasi III. La processività. Il modello semidiscontinuo della replicazione (Okazaki e Kornberg). Modello di replicazione del DNA in E. coli. L OriC. Le proteine dnaa, dnab e dnac. Il replisoma e l avanzamento della forca replicativa. Ruolo delle topoisomerasi nella replicazione. La sintesi discontinua del lagging strand ed i frammenti di Okazaki. La correzione degli errori di copiatura in corso di replicazione. La DNA ligasi ed il suo meccanismo di azione. La terminazione della replicazione in E. coli. Cenni sulla riparazione del DNA, con particolare riguardo alla correzione in corso di replicazione. Altri sistemi di replicazione in fagi e virus. 4 CFU: La trascrizione del DNA negli eubatteri e la sua regolazione. Funzioni e meccanismi generali della trascrizione nelle unità trascrizionali procariotiche. Filamento stampo e filamento sequenza. L RNA polimerasi. Il fattore sigma. Identificazione dei siti di legame della polimerasi: il footprinting. Struttura generale del promotore procariotico. Fasi di allungamento del trascritto. Siti di pausa dell RNA polimerasi. Terminatori indipendenti e dipendenti da Rho. La regolazione dell espressione genica per induzione e repressione (controllo negativo) e per attivazione (controllo positivo). Controllo negativo e positivo negli operoni catabolici (lac, ara, gal). L operone del triptofano: controllo negativo e meccanismo di attenuazione. Cenni sulla ciclo litico e lisogenico nel fago lambda come esempio complesso di regolazione della trascrizione. I piccoli RNA regolatori: meccanismi on/off di trascrizione/traduzione. Cenni sulla trasposizione e l inversione di elementi genici. 5 CFU: Genoma eucariotico. L organizzazione del genoma eucariotico. Cinetica di riassociazione di filamenti complementari. Il C o t 1/2. DNA satellite. Cromatina e struttura del nucleosoma. Telomeri e centromeri. La telomerasi. DNA a sequenza unica ripetute. Geni ripetuti in tandem. La cromatina attiva in trascrizione. La trascrizione in eucarioti: i vari livelli

3 della regolazione dell espressione genica. Electrophoretic mobility shift assay. Chromatin ImmunoPrecipitation. La RNA pol I e la RNA pol III. RNA polimerasi II. Il promotore della RNA pol. II. Upstream promoter elements. I fattori generali della trascrizione. Il complesso di pre-inizio. I fattori si trascrizione specifici: esempi delle classi principali e della loro struttura modulare. Espressione di geni inducibili: esempi di geni tessutospecifici e indotti da ormoni. Maturazione e riarrangiamento dei trascritti eucariotici: Lo splicing e i suoi meccanismi. Self-splicing. Lo splicing alternativo. RNA editing. I meccanismi dell interferenza da RNA: mirna, sirna e shrna. 6 CFU: Le tecniche del DNA ricombinante. Le endonucleasi di restrizione. Mappatura del genoma: mappe geniche e mappe fisiche. Il chromosome walking. Tecniche elettroforetiche per separare poli(d)nucleotidi a doppio ed a singolo filamento. Determinazione della sequenza di un frammento di restrizione di DNA (Sanger). Le sonde di acidi nucleici: metodi di preparazione e loro usi. La tecnica del blotting. Amplificazione del DNA in vitro: polymerase chain reaction (PCR): concetti di base e sviluppi recenti. Tecniche di clonaggio. I vettori plasmidici, fagici, cosmidici. Il fago M13. Vettori per genoteche di DNA genomico YAC e BAC. Sintesi del cdna da mrna. Banche di DNA genomico e di cdna. La proteomica. Genoma, trascrittoma e proteoma. Metodi per il sequenziamento del DNA: metodo del dideossi o di Sanger; metodo chimico o di Maxam e Gilbert; Pyrosequencing. Next generation sequencing. RNA sequencing e Direct RNA Sequencing. Obiettivo formativo generale del II Lezioni: Caratteristiche morfo-funzionali e strutturali-molecolari di Eubatteri, Archea, Virus e Miceti nell ottica di un loro uso biotecnologico. Fisiologia delle cellule microbiche, la loro flessibilità metabolica, l adattamento ambientale, dinamica di crescita e strategie di sopravvivenza di popolazioni batteriche. Ricombinazione genica nei microrganismi. Meccanismi molecolari della patogenicità batterica e la loro interazione con l ospite, nell ottica di prospettare vaccini ricombinanti protettivi. Laboratorio/esercitazioni: esecuzione di metodiche convenzionali e molecolari utili nella diagnostica microbiologica e di sistemi di valutazione delle suscettibilità batterica agli antimicrobici.. Elenco degli argomenti trattati nel II Breve rassegna dello sviluppo delle Biotecnologiche microbiche. Struttura e funzione dei principali componenti cellulari di Eubacteri, Archea, Virus e Miceti. Studio della struttura e funzione dei seguenti componenti. 1. Capsula propriamente detta e strato mucoso; 2. Parete cellulare: struttura e composizione negli Eubatteri Gram-positivi e Gramnegativi e negli Archea; biosintesi della mureina ed antibatterici che la inibiscono. 3. La membrana esterna dei batteri Gram-negativi: proteine porine, periplasma e proteine periplasmatiche, endotossine. 4. Membrana cellulare: composizione e struttura negli Eubacteri ed Archea, i mesosomi e loro funzioni. 5. Flagelli batterici: struttura, movimento flagellare in liquido e su superfici solide; la risposta chemiotattica. 6. Fimbrie, pili, spine. 7.

4 Nucleoide batterico e citoplasma. 8. La spora batterica: caratteristiche morfologico-strutturali; la sporulazione; la termoresistenza delle spore batteriche; geminazione ed esocrescita. Archea: Principali caratteristiche morfologiche, strutturali, fisiologiche e molecolari che differenziano gli Archea dagli Eubacteria. Caratteristiche generali degli Alofili estremi, Metanogeni, Metanotrofi ed Iper-termofili in rapporto all'habitat colonizzato. Loro importanza biotecnologica. Virus: Struttura della particella virale. Organizzazione dei virioni: struttura del capside e tipi di acido nucleico. Virioni con rivestimento ed infezione cellulare. Coltivazione dei virus. I batteriofagi: Replicazione dei fagi T pari (T4 come modello di fago virulento) e fago lambda (come modello di fago temperato). Batteriofagi a ssdna lineare e circolare ed ad RNA. Miceti: Caratteristiche morfo-funzionali e strutturali-molecolari. Fisiologia e metabolismo fungino. Coltivazione dei miceti in laboratorio e loro identificazione con sistemi tradizionali e molecolari. Nutrizione, metabolismo e crescita batterica: Caratteristiche generali del metabolismo microbico: flessibilità ed adattabilità metabolica. Produzione di energia. Respirazione aerobica, anaerobica e fermentazione. Richiami ai sistemi di trasporto e nutrizione batterica. Cinetica della crescita delle popolazioni batteriche in terreno liquido (fase di latenza, di crescita esponenziale, stazionaria, di morte). Caratteristiche delle cellule in fase esponenziale, stazionaria e di sopravvivenza, con particolare riguardo ai meccanismi cellulari e molecolari che regolano la risposta cellulare nella transizione crescita/non crescita e nella sopravvivenza; cellule vitali non coltivabili. Parametri che influenzano la resa cellulare ed il ritmo di crescita. Sistemi di regolazione globlale e differenziamento nei procarioti. Sistemi a due componenti e fattori sigma alternativi. La risposta chemiotattica. La risposta Quorum sensing. Differenziamento swarming. La regolazione del ciclo cellulare in batteri a rapida e lenta crescita. La repressione catabolica e la risposta stringent/relaxed. La risposta a variazione dell osmolarità nei Gram-negativi. La ricombinazione genica nei batteri: Meccanismi di trasferimento genico: coniugazione, transduzione, trasformazione. Caratteristiche generali dei plasmidi e trasposoni: principali tipi di plasmidi e meccanismi di controllo del numero e partizione delle copie. Importanza dei plasmidi nella farmaco-resistenza e patogenicità microbica. Patogenicità e virulenza microbica. Meccanismi molecolari di patogenicità microbica. Fattori di virulenza (adesine, invasine, enzimi degradativi) e patogenicità (eso- ed endotossine). Plasmidi di virulenza ed isole di patogenicità. Rapporto ospite-parassita: Microrganismi patogeni, patogeni opportunisti e commensali. Epidemiologia, meccanismi patogenetici e diagnosi microbiologica di microrganismi modello, tra cui Streptococcus pneumonieae e Neisseria meningitidis. Testi consigliati I : Watson, T. A. Baker, S. P. Bell, A. Gann, M. Levine, R. Losick - Biologia molecolare del gene 6 a edizione. Zanichelli II : E. Galli, G. Dehò Biologia dei microrganismi. Casa Editrice

5 Ambrosiana Illustrazione di eventuali attività di laboratorio e/o esercitazioni Modalità di svolgimento delle prove d esame Propedeuticità Conoscenze richieste II : LABORATORIO/ESERCITAZIONI Preparazione ed uso di terreni di coltura solidi e liquidi (minimo, ricco, complesso, sintetico, non selettivo, selettivo, differenziale e di arricchimento). Le colture microbiche e fungine: semina su terreni di crescita solidi. Isolamento in coltura pura ed identificazione delle colture mediante analisi delle colonie e delle caratteristiche biochimiche-metaboliche dei microrganismi. Introduzione ai sistemi diagnostici automatizzati. Introduzione ai farmaci antibatterici e determinazione del valore di MIC ed MBC in terreno liquido e solido. I : Sono previste due verifiche scritte in itinere; l esame finale è orale. II : Possono essere effettuate verifiche scritte in itinere con esame finale orale I e II : Tutti i corsi del 1 anno. Fondamenti di Biologia generale, Biologia Cellulare, fondamenti di Chimica generale e di Chimica Organica, concetti di Fisica, principi di Biochimica e Genetica generale