Due possibili approcci per la formazione del legame fosfodiestereo: accrescimento in direzione 3-5 o in direzione 5-3

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Chiara Piazza
6 anni fa
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3 Due possibili approcci per la formazione del legame fosfodiestereo: accrescimento in direzione 3-5 o in direzione

4 Per poter ottenere un buon controllo della regioselettività delle reazioni di accoppiamento, è necessario proteggere i gruppi funzionali potenzialmente interferenti

5 In linea di principio, è necessario utilizzare gruppi protettori adatti per: 1) le funzioni alcoliche dello zucchero non implicate nella reazione di accoppiamento; 2) i gruppi amminici esociclici delle basi azotate citosina, guanina e adenina (la timina è generalmente poco reattiva).

6 Gruppo protettore per l OH in 5 : 4,4 -Dimetossitrifenilmetile (DMT), acido-labile

7 Protezione per l OH in 3 come estere (base-labile): 1) Conversione in estere benzoico (in sintesi in soluzione) o 2) Aggancio al supporto solido attraverso un linker succinico (in sintesi in fase solida)

8 Protezione per i gruppi amminici esociclici delle purine o pirimidine: formazione di ammidi aromatiche (labili alle basi)

9 Formazione del legame 3-5 fosfodiestereo

10 Attivazione del fosfato con un arensolfonilcloruro Formazione di un anidride mista al fosfato, intermedio molto reattivo (atomo di P reso centro elettrofilo, arensolfonato ottimo gruppo uscente)

11 Attivazione del fosfato con DCCI Si realizza un legame anidridico con la DCCI; il P è reso un buon centro elettrofilo, con la dicicloesilurea come gruppo uscente

12 Metodo del fosfodiestere in fase solida Supporto solido usato: resina poliacrilammidica; rese medie per accoppiamento: 95%; tempo medio per singolo accoppiamento: 12 ore.

13 Problemi presenti nella chimica del fosfodiestere: formazione di catene parassite mediante legami pirofosfato

14 Metodo del fosfotriestere

15 Metodo del fosfotriestere per sintesi in soluzione

16 Rimozione dei gruppi protettori dall oligonucleotide protetto

17 Metodo del fosfotriestere in fase solida

18 Nucleotidi con fosfati a diversa reattività

19 Sintetizzatore manuale per sintesi di oligonucleotidi

20 Metodo del fosforammidito: l intermedio chiave Nucleosidi 3 -fosforammidito sono relativamente stabili (ad esempio, una volta sintetizzati, possono essere conservati a 18 C per mesi), ma in presenza di acidi anche molto deboli risultano estremamente reattivi verso i nucleofili. Il metodo del fosforammidito è stato descritto per la prima volta da Serge Beaucage e Marvin Caruthers nel Attualmente è il metodo più usato per la sintesi di oligonucleotidi in fase solida.

21 Sintesi di ODN in fase solida con chimica del fosforammidito

22 Meccanismo di attivazione di un fosforammidito Nu = nucleoside 2-cianoetile = gruppo protettore per il fosfito

23 Un derivato fosfito triestere (P III, molto reattivo) può essere rapidamente e quantitativamente convertito in fosfato triestere [P (V), stabile] mediante ossidazione in condizioni anche molto blande. Tipicamente, questa reazione è effettuata con I 2 (0.1 M) in piridina/thf con piccole percentuali di acqua.

24 Ciclo di sintesi completo su sintetizzatore di oligonucleotidi Inizio del ciclo

25 Un sintetizzatore automatico di oligonucleotidi su scala di laboratorio ABI 392 DNA synthesizer (Applied Biosystem)

26 Monitoraggio dell efficienza di accoppiamento mediante quantizzazione del catione DMT + Il catione DMT + è fortemente colorato in rosso-arancione (λ max = 498 nm, ε=71700 cm -1 M -1 )

27 Resa complessiva teorica in funzione della resa per singolo accoppiamento e del numero di accoppiamenti % resa singolo accoppiamento Numero di accoppiamenti

28 Il supporto solido più usato: la CPG (Controlled Pore Glass) lcaa = Long Chain Alkylamine (linker a lunga catena, terminante con funzione amminica primaria)

29 Funzionalizzazione del supporto CPG con il primo nucleoside Funzionalizzazione media: micromoli per grammo di supporto

30 Il supporto Tentagel è una valida alternativa alla CPG Funzionalizzazione media: 100 micromoli per grammo di supporto secco

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