CHIMICA Ven 15 novembre 2013 Lezioni di Chimica Fisica

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1 Laurea triennale in BIOLOGIA A. A CHIMICA Ven 15 novembre 2013 Lezioni di Chimica Fisica Spettroscopia UltraVioletta-Visibile ibile (UV( UV-vis) 2^ parte Fluorescenza e Fosforescenza Prof. Antonio Toffoletti

2 Principali cromofori biologici e caratteristiche di assorbimento 2

3 Esempio di spettro di assorbimento UV di una proteina λ<190nm σ-σ* di tutti i legami 190nm<λ<240nm Assorbimento π-π* dei legami peptidici 240nm<λ<300nm Assorbimento π-π* degli amminoacidi aromatici 3

4 Spettri di assorbimento UV dei principali amminoacidi aromatici Triptofano (Trp) Fenilalanina (Phe) Assorbimento π-π* aromatico Tirosina (Tyr) L assorbimento a λ=280 nm viene talvolta usato per misurare la concentrazione di proteine 4

5 Spettri di assorbimento UV dei principali amminoacidi aromatici Triptofano (Trp) Fenilalanina (Phe) ε 280 (Trp) = 5690 l mol -1 cm -1 ε 280 (Tyr) = 1280 l mol -1 cm -1 ε 280 (Phe) = 160 l mol -1 cm -1 Tirosina (Tyr) 5

6 Esempio di spettri di assorbimento UV delle basi del DNA, RNA NH 2 N N Adenina (A) N N O N NH Guanina (G) N N N O NH Timina (T) N O NH 2 N Citosina (C) N O O N Uracile (U) Assorbimento π π* tra nm N O 6

7 L incolonnamento delle basi nella struttura del DNA induce una diminuzione di assorbimento (effetto ipocromico ). Si utilizza questo effetto per misurare la denaturazione del DNA ( curva di fusione del DNA) 7

8 Fluorescenza S 3 S 2 La fluorescenza avviene sempre a lunghezze d onda uguali o maggiori dell assorbimento.si può osservare struttura vibronica anche nella fluorescenza S 1 A S 0 8

9 Si definisce la resa quantica di fluorescenza come il rapporto tra il numero di fotoni emessi ed il numero di fotoni assorbiti Φ fl = nr. fotoni emessi nr. fotoni assorbiti è un numero compreso tra 0 e 1 I principali fluorofori biologici intrinseci sono gli amminoacidi aromatici, in particolare tirosina e triptofano. Le basi degli acidi nucleici sono pochissimo fluorescenti. Sono fluorescenti alcuni coenzimi come NADH, FAD e FMN. H 2 O, ph = 7 9

10 Schema semplificato della strumentazione per assorbimento / fluorescenza UV-VIS

11 Schema di una spettrometro di assorbimento UV-VIS a doppio raggio Sorgente Monocromatore (prisma, reticolo) T A ( λ) ( λ) = = I I 0 ( λ) ( λ) Log 10 1 T ( ) λ fenditura Riferimento Campione I 0 (λ) I(λ) Rivelatori di intensità luminosa (fotodiodi o tubi fotomoltiplicatori) specchi 11

12 Schema di una spettrometro di fluorescenza UV-VIS (fluorimetro) Sorgente Monocromatore di eccitazione (prisma, reticolo) Rivelatore di intensità luminosa (tubo fotomoltiplicatore) Campione Monocromatore di emissione (prisma, reticolo) 12

13 Esercizi di spettroscopia

14 1) La radiazione elettromagnetica con numero d onda cm -1 appartiene al campo a) dell infrarosso b) del visibile c) dell ultravioletto 2) Se una radiazione elettromagnetica ha una frequenza ν = Hz, quant è il periodo dell oscillazione del campo elettrico? a) T=10 14 secondi b) T=10-2 millisecondi c) T=10-2 picosecondi 3) Il coefficiente di assorbimento (o estinzione) molare (ε) nella legge di Lambert-Beer dipende : a) dalla lunghezza d onda b) dalla concentrazione c) dal percorso ottico

15 4) Quale delle seguenti componenti di un spettrofotometro sono utilizzate per separare le diverse componenti in frequenza della radiazione a) la lampada b) prisma o reticolo di diffrazione c) rivelatore

16 6) Il fenomeno della fluorescenza si riferisce a: a) assorbimento di un fotone da parte di un cromoforo b) emissione di un fotone da parte di un cromoforo dopo l eccitazione c) assenza di eccitazioni elettroniche in un cromoforo 7) Se una soluzione di triptofano a concentrazione M ha assorbanza 1.1 a λ=280nm in una cella con cammino ottico di 1 cm, quanto vale ε (λ=280)? A εcl A cl 1.1 moli -1-1 = ε = = = 5500 l moli cm l 1cm

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