ANALISI DEI PRODOTTI FITOSANITARI E SUPPORTO ANALITICO AI LABORATORI PER IL CONTROLLO: ESPERIENZE E CRITICITA
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1 ANALISI DEI PRODOTTI FITOSANITARI E SUPPORTO ANALITICO AI LABORATORI PER IL CONTROLLO: ESPERIENZE E CRITICITA Angela Santilio Istituto Superiore di Sanità Dipartimento di Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria angela.santilio@iss.it
2 INTRODUZIONE Nell ambito delle collaborazioni tra Ministero della Salute e Istituto Superiore di Sanità nel periodo (Fascicoli 6M46 e 1S24) sono stati sviluppati i seguenti argomenti: Attività di coordinamento con organi periferici per l implementazione dei sistemi di controllo dei prodotti fitosanitari Implementazione dei sistemi di verifica e delle prestazioni dei Laboratori destinati al controllo Implementazione dei sistemi di assicurazione di qualità secondo la UNI CEI EN ISO/IEC Attività inerenti la verifica dei prodotti fitosanitari contraffatti sul mercato nazionale.
3 COORDINAMENTO Attività di coordinamento con organi periferici per l implementazione dei sistemi di controllo dei prodotti fitosanitari. L obiettivo è quello di supportare dal punto di vista tecnico-scientifico i laboratori ufficiali preposti al controllo dei pp.ff. Sono state raccolte informazioni su: stato attuale dei laboratori in materia di accreditamento, applicazione dei metodi ufficiali, trattamento del dato analitico.
4 COORDINAMENTO Stato attuale dei laboratori in materia di accreditamento Sono pochi i laboratori accreditati su metodi di analisi dei prodotti fitosanitari e su proprietà chimico fisiche e tecnologiche dei pp.ff. Applicazione dei metodi Metodi CIPAC Metodi propri del laboratorio (particolare per screening su sostanza attiva mediante GC/MS o LC/MS) Metodi forniti dai notificanti in fase di autorizzazione (ISS raccolta di tali metodi per prodotti autorizzati in Italia) Trattamento del dato analitico Tolleranza secondo Regolamento (EU) n. 1107/2009 Incertezza di misura
5 CIPAC METODI CIPAC - Collaborative International Pesticide Analytical Council. E un organizzazione no-profit e no governativa internazionale che: Promuove gli accordi internazionali su metodi di analisi per i prodotti fitosanitari e per metodi di analisi per le proprietà chimico fisiche e tecnologiche dei prodotti fitosanitari Promuove programmi inter-laboratorio per la valutazione dei metodi di analisi.
6 CIPAC METODI
7 CIPAC METODI
8 CIPAC METODI I metodi sono proposti dai notificanti e sono provati da laboratori internazionali partecipanti. Studi collaborativi
9 CIPAC METODI per partecipare ad uno studio collaborativo CIPAC la «call» sul Il partecipante invia la richiesta al punto di contatto descritto nella «call» Conferma di partecipazione Ricevimento dei campioni, metodo da applicare, sheet di calcolo e scadenza per inviare i risultati.
10 CIPAC METODI
11 CIPAC METODI 20 partecipanti massimo; Invio dei risultati al punto di contatto; Durante il meeting annuale del CIPAC viene presentato il report finale e i risultati sono valutati; Dopo valutazione dei risultati il metodo può essere approvato come completo e pubblicato nei CIPAC Handbook oppure può essere considerato provvisorio perché necessita di ulteriori indagini.
12 CIPAC METODI Aspetti positivi Sono metodi accettati a livello internazionale, validati e considerati ufficiali Sono riconosciuti da organismi internazionali come FAO e WHO Non necessitano di validazione indipendente quando sono usati per le autorizzazioni di sostanza attiva e/o di prodotto fitosanitario. Aspetti negativi Abbiamo metodi che sono obsoleti e non sono ancora sostituiti Abbiamo metodi che utilizzano tecniche superate che spesso non sono più applicabili dai laboratori. I metodi vanno in fase di revisione e aggiornamento sulla base delle recenti innovazioni tecniche questo processo di revisione comporta un nuovo studio di validazione e valutazione.
13 VERIFICA DATO ANALITICO Nell ambito del sistema di verifica del dato analitico è importante la partecipazione ai circuiti di validazione dei metodi di analisi e ai circuiti inter-laboratorio (Proficiency Test - PT) europei ed internazionali. PT- Federal Laboratory for Food Safety (FASFC) Belgio organizza Proficiency test su: contenuto di sostanza attiva in pp.ff proprietà chimico fisiche e tecnologiche dei pp.ff Contatto: alain.dubois@afsca.be PT Association of American Pesticide Control Official (AAPCO) organizza Profociency test su contenuto di sostanza attiva in pp.ff. wanp@purdue.edu
14 VERIFICA DATO ANALITICO Istituto Superiore di Sanità Reparto Antiparassitari 2015 PT- Association of American Pesticide Control Official (AAPCO) Sostanza attiva Tipologia formulazione Tecnica strumentale Concentrazione (% p/p) Risultato (% p/p) Z-score Propiconazole Liquido HPLC/DAD 14,3% 14,5% 0,39 Deltametrina Polvere HPLC/DAD 0,05% 0,04% -0,22 Sulfentrazone Liquido HPLC/DAD 1,36% 1,43% 1,77 Prodiamine Liquido GC/FID 2,73% Z-score = -3.5 z-score 3,5 fuori intervallo - non accettabile
15 VERIFICA DATO ANALITICO Istituto Superiore di Sanità Reparto Antiparassitari 2016 PT- Association of American Pesticide Control Official (AAPCO) Sostanza attiva Tipologia formulazione Tecnica strumentale Concentrazione (%) Risultato Z-score Glifosate Liquido HPLC/DAD 30.38% 32.75% 2,19 Imidacloprid Granulare HPLC/DAD 0,5% 0,54% 0,97 Lambda Cialotrina Granulare GC/FID 0,1% ,4-D Liquido HPLC/DAD 41.5% Acido equivalente 41.3% Acido equivalente Z-score = -3.5 z-score 3,5 fuori intervallo - non accettabile
16 VERIFICA DATO ANALITICO Istituto Superiore di Sanità Reparto Antiparassitari 2017 PT- Association of American Pesticide Control Official (AAPCO) Sostanza attiva Tipologia formulazione Tecnica strumentale Concentrazione (%) Risultato* Z-score Atrazina Liquido/emulsione HPLC/GC 4% Acetamiprid Liquido HPLC/DAD 8,6% Penoxulam Granulare HPLC/DAD 0,04% Prometon Pellets HPLC/GC 5,0% *in corso Z-score = -3.5 z-score 3,5 fuori intervallo - non accettabile
17 ASSICURAZIONE DI QUALITA E fondamentale che il controllo e la verifica dei campioni siano basati sulla qualità del dato analitico. E importante avere un sistema di qualità che assicuri: I. Risultati attendibili II. Analisi di pp.ff seguendo i criteri di qualità e la misura dell incertezza Questo obiettivo può essere raggiunto applicando la norma UNI CEI EN ISO/IEC
18 ASSICURAZIONE DI QUALITA Il Reparto Antiparassitari ha implementato il sistema di assicurazione di qualità per la determinazione dell ingrediente attivo in pp.ff. commercialmente disponibili in Italia. Per l accreditamento è stata selezionata la sostanza attiva Cyprodinil in formulazioni di tipo emulsione concentrata (EC) e granuli dispersibili in acqua (WG). Emulsione Concentrata (EC) 296 g/kg Granuli Dispersibili in acqua (WG) 500 g/kg e 375 g/kg
19 ASSICURAZIONE DI QUALITA E stato applicato metodo CIPAC MT 511 e l analisi è stata condotta mediante HPLC/DAD Fase stazionaria: Nucleosil C mmx4 mm; 5 mm Fase mobile: Acetonitrile/acqua acidificata (1% TFA) (40:60, v/v) Flusso: 1.2 ml/min Volume iniezione: 10 ml DAD= 254 nm
20 ASSICURAZIONE DI QUALITA Campioni conservati a temperatura ambiente Prima dell analisi i campioni sono stati omogeneizzati meccanicamente Preparazione delle soluzioni di calibrazione e della soluzione del campione.
21 ASSICURAZIONE DI QUALITA Equilibrazione del sistema La soluzione di calibrazione è stata iniettata finché il tempo di ritenzione e l area del picco deviano meno del ± 1% dalla media di tre iniezioni successive.
22 ASSICURAZIONE DI QUALITA Determinazione quantitativa La quantificazione è stata condotta mediante Fattore di Risposta (FR) ottenuto iniettando soluzioni di calibrazione tra i campioni. Il fattore di risposta medio delle soluzioni di calibrazione precedente e successive al campione viene calcolato e usato per la determinazione quantitative.
23 ASSICURAZIONE DI QUALITA Il contenuto di Cyprodinil è calcolato con la seguente formula: Fi= Fattore di risposta singolo F= Fattore di risposta medio Hs = area del picco del cyprodinil nella soluzione di calibrazione Hw = area del picco del cyprodinil nella soluzione del campione S= massa del cyprodinil standard nella soluzione di calibrazione (mg) W = massa del campione pesato (mg) P = purezza del cyprodinil standard (g/kg)
24 ASSICURAZIONE DI QUALITA Per la determinazione della ripetibilità l analisi è stata condotta su 6 ripetizione del campione in due giorni diversi con o stesso operatore e strumento. Il parametro di ripetibilità è stato confrontato con la ripetibilità calcolata nel metodo CIPAC per le diverse concentrazioni di p.f. Incertezza di misura è stata calcolata usando la riproducibilità del metodo per ciascuna concentrazione.
25 ASSICURAZIONE DI QUALITA Sulla base dei dati presentati in corso di verifica è stato rilasciato l accreditamento per il metodo del Cyprodinil. Il lavoro è stato lungo e laborioso e per questo risulta difficile poter accreditare tutte le combinazioni prodotto/sostanza attiva, di conseguenza sarebbe auspicabile che l ente accreditante possa riconoscere la complessità del lavoro, proponendo un adeguato programma di controllo qualità (tipo/frequenza): Partecipazione a PT Controllo qualità interno (prove in doppio) verifica ripetibilità. A tal proposito stiamo lavorando per poter ottenere un sistema di accreditamento più versatile e meno dispendioso in termini di risorse economiche.
26 ASSICURAZIONE DI QUALITA Prodotti fitosanitari a formulazione Emulsione Concentrata (EC) e granuli idrodispersibili (WG) Denominazione della prova: Ciprodinil Metodo di prova: CIPAC 511:2009 Prodotti fitosanitari a formulazione Emulsione Concentrata (EC) e granuli idrodispersibili (WG) Denominazione della prova: Ciprodinil Metodo di prova: metodi CIPAC
27 CONTRAFFAZIONE PRODOTTI FITOSANITARI La produzione e la vendita di prodotti fitosanitari contraffatti è un fenomeno in aumento e rappresenta un serio rischio per la salute pubblica e l ambiente. Le contraffazioni possono presentarsi come: Assenza di sostanza attiva Sostanza attiva sbagliata (in genere non autorizzata in EU) Quantità di sostanza attiva inferiore a quella autorizzata Confezione non conforme a quella autorizzata Contaminazione con sostanze inaspettate che potrebbero essere tossiche.
28 CONTRAFFAZIONE PRODOTTI FITOSANITARI IMPATTO Vendita su web Venditori illegali PPPs non efficaci PPPs fitotossicità Contaminazione persistente di campi Rischio per l ambiente Rischio per l operatore, gli operai, gli astanti e i consumatori (residui nelle colture trattate)
29 CONTRAFFAZIONE PRODOTTI FITOSANITARI Le analisi dei prodotti contraffatti e illegali rappresentano una nuova frontiera per i laboratori analitici. I potenziali target per il controllo dell autenticità sono: Co-formulanti/solventi Impurezze Isomeri Proprietà chimiche, fisiche e tecnologiche (ph, densità, emulsionabilità..)
30 CONTRAFFAZIONE PRODOTTI FITOSANITARI Le procedure di confronto sono differenti a seconda dei casi, in ogni caso possiamo generalizzare con: Ispezione del contenitore Esame visuale del prodotto (colore diverso, granulometria differente ) Analisi mediante IR Analisi del contenuto di sostanza attiva Analisi delle proprietà tecnologiche del prodotto (emulsionabilità..) Analisi del profilo cromatografico
31 CONTRAFFAZIONE PRODOTTI FITOSANITARI Esame visuale del prodotto. Il caso illustrato è evidente, ma esistono casi in cui l evidenza delle differenze non è cosi evidente. Per questo ogni situazione va vista come unica e speciale, di conseguenza lo studio e la verifica va fatta come un approccio tipo CASO PER CASO contraffatti originale
32 CONTRAFFAZIONE PRODOTTI FITOSANITARI Sono stati confrontati i granuli del contraffatto rispetto all originale. In questo caso la differenza è visivamente osservabile. In ogni caso l osservazione andrebbe verificata con strumentazione adeguata (microscopi) a fornire un valore scientifico.
33 CONTRAFFAZIONE PRODOTTI FITOSANITARI Per i liquidi l esame diventa più complesso in quanto risulta più complicato apprezzare diversità di colore. Si possono preparare soluzioni alla stessa diluizione in acqua per verificare eventuali differenze
34 CONTRAFFAZIONE PRODOTTI FITOSANITARI L analisi mediante spettrometria infrarosso si rivela un utile strumento per la verifica dei due prodotti. La strumentazione attuale è di facile uso e permette un primo approccio qualitativo alle differenze di composizione dei prodotti. Potremmo considerarla una comparazione dell impronta digitale dei due prodotti.
35 CONTRAFFAZIONE PRODOTTI FITOSANITARI
36 CONTRAFFAZIONE PRODOTTI FITOSANITARI La presenza di un prodotto contraffatto sul mercato potrebbe impattare sull applicabilità dello stesso e sui residui che si potrebbero determinare sulle derrate agricole con conseguente impatto sull ambiente e sulla salute del consumatore. Per questo motivo è importante verificare le proprietà chimiche, fisiche e tecnologiche dei due prodotti. I parametri di accettabilità sono le specifiche FAO del prodotto. ph, densità, emulsionabilità, sospensibilità.
37 CONTRAFFAZIONE PRODOTTI FITOSANITARI L esame cromatografico può essere condotto per: Determinare contenuto di ingrediente attivo Determinare il profilo delle impurezze e/o coformulanti Attualmente si dispone di Metodi CIPAC per sostanze attive Metodi forniti da Ditte per le sostanze attive
38 CONTRAFFAZIONE PRODOTTI FITOSANITARI Attualmente si dispone di metodi CIPAC per le seguenti impurezze Dihydrosafrole in piperonyl butoxide technical Terpyridines in diquat Terpyridines in Paraquat S-methylfenitrothion in Fenitrothion Tetramethyl pyrophosphothioate (TMPP) in Fenitrothion 1-chloro-2-methylcycloprene (1-MCP) and 3-chloro-2-methylpropene (3_CMP) in methylcycloprene 1-MCP)
39 CONTRAFFAZIONE PRODOTTI FITOSANITARI Non si hanno a disposizione metodi per altre impurezze e co-formulanti (nessun informazione). Questo è limitante per una corretta valutazione Si dovrebbe avere una collaborazione tra Ditte e Laboratori
40 CONTRAFFAZIONE PRODOTTI FITOSANITARI L analisi mediante cromatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC/MS, HPLC/MS) mi permette di identificare i componenti dei prodotti e di avere informazioni non solo qualitative (identificazione componenti in libreria) ma anche un informazione quantitativa, se si dispone di standard analitici.
41 CONTRAFFAZIONE PRODOTTI FITOSANITARI
42 CONTRAFFAZIONE PRODOTTI FITOSANITARI Disponibilità di strumentazione idonea e dedicata (IR, Microscopio, GC/FID, GC/MS, HPLC/DAD, HPLC/MS) Metodi di analisi per sostanze attive, impurezze e coformulanti Standard analitici (impurezze e co-formulanti) Standard analitici per le impurezze e /o i coformulanti non sono disponibili commercialmente e neppure di facile reperimento dai Notificanti i prodotti. Spesso vengono prodotti in fase di preparazione del prodotto e non sono disponibili su scala commerciale.
43 AGGIORNAMENTI L importanza degli argomenti trattati sta diventando importante anche in sede comunitaria 22 e 23 Settembre 2016 si è tenuta a Brussels una prima riunione di esperti per discutere l analisi dei prodotti fitosanitari. Sono stati discussi i seguenti argomenti: Punti di vista ed aspettative nazionali Analisi dei prodotti fitosanitari (esperienza tedesca) Programmazione di linee guida europee su: Strategie di analisi Interpretazione dei risultati analitici Controllo di qualità compreso sub-campionamento Raccolta/prelievo campioni.
44 AGGIORNAMENTI Organizzazione di sottogruppi di lavoro con esperti degli Stati Membri ITALIA partecipa, insieme a Germania, Romania, Grecia, Paesi Bassi al sottogruppo «Interpretazione dei risultati» Misura dell incertezza, Tolleranze per co-formulanti, Tolleranze per impurezze/sostanze estranee, Tolleranze per la densità Specifiche per co-formulanti (NPE, POE tallowamines).
45 AGGIORNAMENTI In sede Nazionale programmazione di una riunione di esperti (ISS e laboratori periferici) per la definizione di una proposta da presentare ad ACCREDIA relativamente all accreditamento su pp.ff. Successivamente riunione con ISS, laboratori periferici, rappresentanti di ACCREDIA, Ditte per una discussione su accreditamento e analisi di pp.ff. Aggiornamenti su linee guida comunitarie in materia.
46 CONCLUSIONI Importanza dei controlli sui prodotti fitosanitari Collaborazione e coordinamento in materia di analisi di prodotti fitosanitari. Incremento dell interesse in materia da parte dell Europa 23 Febbraio Corso «Metodi analitici per il controllo ufficiale dei prodotti fitosanitari» presso ISS.
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Angela Santilio. Istituto Superiore di Sanità Dipartimento Ambiente e Salute
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