Espansione di ripetizioni. Lezione 11

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1 Espansione di ripetizioni Lezione 11 1

2 Anticipazione alcuni fenotipi a trasmissione autosomica dominante diventano piu gravi nelle generazioni successive perche? espansione di triplette: tipo di mutazione individuata nel 1990 Corea di Hunghinton, X fragile, Distrofia Miotonica premutazione : stato che aumenta il rischio di trasmettere il fenotipo patologico. Il rischio non e piu quantizzabile in termini mendeliani prudenza nel considerare neutri i polimorfismi 2

3 Polimorfismo PCR Mini e micro satelliti: Riconosciuti su gel dopo amplificazione con PCR 3

4 Espansioni di triplette instabili: mutazioni dinamiche Mutazioni dovute all espansione di trinucleotidi localizzati nelle regioni codificanti o non-codificanti di alcuni geni, si originano per errori nella replica del DNA. Possono originare un sito fragile visibile citogeneticamente. Se si trova in una regione codificante il prodotto del gene presentera n numero di residui amminoacidici corrispondenti alla tripletta superiori al prodotto dell allele selvatico. Di solito la tripletta coinvolta e CAG (acido glutammico). Se si trova in una regione non-codificante possono alterare l espressione del gene in cis. Distrofia miotonica: 3 UTR; atassia di Friedrich: introne1; X-fragile:5 UTR.. 4

5 Mutazioni dinamiche: origine Le triplette possibili sono 64, ma in realta le combinazioni sono solo 10 (per la lettura su entrambi i filamenti): AAC/GTT AAG/CTT AAT/ATT ACC/GGT ACG/CGT ACT/AGT AGG/CCT ATC/GAT CAG/ CCG/ Tutte le altre sono permutazioni cicliche di queste 5

6 Mutazioni dinamiche: caratteristiche comuni La variabilita degli alleli ripetuti dipende dalla loro lunghezza Il tasso di mutazione dipende dalla lunghezza Le unita ripetute tendono ad aumentare piuttosto che a diminuire Presenza dello stato di premutazione: espansione di triplette non ancora associato alla comparsa del fenotipo, ma che rende la regione instabile e piu suscettibile a raggiungere il livello di mutazione completa. Difficolta nel definire la correlazione genotipo fenotipo per la presenza di un range di espansione che si puo associare alla comparsa del fenotipo. Presenza di anticipazione: aumento della gravita del fenotipo nelle generazioni successive 6

7 Mutazione completa, range di mutazione Premutazione Normale Schema di mutazioni dinamiche UTR esone introne esone introne esone 3 UTR X-fragile Atassia di Friedrich Distrofia miotonica 3000 Mutazione completa, range di mutazione Premutazione Normale CAG CAG CAG CAG 36 CAG CAG 35 CAG CAG CAG Esone ORF Corea di Huntington Atassia spinocerebellare

8 Mutazioni dinamiche: effetti I Perche l espansione origina un fenotipo patologico? Espansioni molto ampie esterne alla sequenza codificante: perdita di funzione. Espansioni modeste di CAG nelle regioni codificanti La premutazione e uno stato di suscettibilita : l instabilita puo essere considerata una patologia della macchina della replicazione. 8

9 Mutazioni dinamiche: effetti II Perche l espansione origina un fenotipo patologico? Espansioni molto ampie esterne alla sequenza codificante: perdita di funzione UTR esone introne esone introne esone 3 UTR X-fragile Atassia di Friedrich Distrofia miotonica Possono abolire o interferire con la trascrizione. Sono presenti anche mutazioni puntiformi nella regione codificante che hanno lo stesso effetto. Il fenotipo e sempre recessivo eccetto per la distrofia miotonica e la SCA8. A questa classe appartiene il gene per l epilessia mioclonica giovanile (JME) che e originata da espansionedi 12 monomeri (CCCCGCCCCGCG)n 9

10 Mutazioni dinamiche: effetti III Perche l espansione origina un fenotipo patologico? Espansioni modeste di CAG nelle regioni codificanti CAG CAG CAG CAG CAG CAG 35 CAG CAG CAG Esone ORF Corea di Huntington Atassia spinocerebellare Codificano tratti di poliglutammina nel prodotto del gene. Si determina l aggregazione delle molecole e la morte cellulare. 10

11 Mutazioni dinamiche: effetti IV Espansioni modeste di CAG nelle regioni codificanti Caratteri comuni alle malattie di questa classe Il fenotipo ha trasmissione dominante eccetto per la malattia di Kennedy (X-linked) e sono patologie neuroderegenitive ad insorgenza tardiva Malattia di Kennedy o atrofia muscolare spino bulbare. Il gene responsabile è il recettore degli androgeni L allele espanso viene trascritto e la ripetizione codifica per un tratto di poliglutammina 11

12 X-fragile Ripeto che questo e solo un modello, per spiegare il fenomeno e capire come funziona il nostro genoma 1/4000 maschi e 1/7000 femmine È la causa di ritardo mentale più importante nei maschi 12

13 Metafase di affetto da X-fragile 13

14 Sindrome X fragile E originata dalla mancata espressione del gene FMR1 Il prodotto del gene lega diversi mrna ed e importante per la loro corretta traduzione. Il cromosoma X della quasi totalita degli affetti presenta un sito fragile in Xq28 in una percentuale variabile delle metafasi, se la coltura di sangue viene eseguita aggiungendo particolari sostanze al terreno coltura. Nelle femmine di solito non si riesce ad evidenziare. Solo una piccola percentuale delle sicure portatrici manifesta il ritardo mentale 14

15 X fragile 15

16 Modalita di trasmissione X-fragile Dal momento che il locus mappa sul cromosoma X dovrebbe seguire un pattern di trasmissione X-linked E cosi, ma analizzando le famiglie e eseguendo analisi di linkage,prima dell identificazione del tipo di mutazione e del clonaggio del gene, emerse quello che fu chiamato paradosso di Sherman, che porto a ipotizzare la presenza della premutazione 16

17 Paradosso di Sherman the first mutation caused a premutation state that produced no clinical symptoms, and that a second mutation was required to convert the premutation to a full mutation form that was associated with the characteristic symptoms 17

18 Paradosso di Sherman La figlia III di un maschio II non affetto, ma portatore, ha un rischio più elevato di avere figli affetti rispetto a sua nonna I anche se di fatto ha il suo stesso allele Di qui l ipotesi che qualcosa nel gene sia cambiato durante le generazioni. La mutazione è dinamica 18

19 Identificazione della mutazione e clonaggio di FMR1 ripetizione 5-50 Normale polimorfismo stabile in meiosi Premutazione sia nei maschi che nelle femmine instabile anche se non compromette la funzione del gene >200 Mutazione completa 19

20 Quando avviene l espansione Nella meiosi, soprattutto femminile Infatti sembra che la conversione da premutazione a mutazione avvenga nella gametogenesi femminile e non avvenga in quella maschile (nella corea di Huntington l espansione è nella gametogenesi maschile) Nella mitosi, femminile e maschile (esiste un mosaicismo somatico nei tessuti e nel tempo) 20

21 FMR1 polimorfismi Il gene e composto di 17 esoni ed e lungo 38 Kb.All interno del primo esone al 5 UTR e presente una serie di.nella popolazione questa regione e polimorfica: varia da 7 a 52 ripetizioni: l allele piu comune e quello di 30 (effetto fondatore). Gli alleli premutati sono compresi fra 60 e 200. Gli alleli completamente mutati possono raggiungere le centinaia di ripetizioni Quando il numero delle triplette supera 230 l intera regione viene ipermetilata aggiungendo un gruppo metilico a C su entrambe le eliche il promotore del gene viene inattivato e FRM1 diviene silente Inoltre la cromatina non riesce a condensare correttamente 21

22 Fenotipo di maschi e femmine con mutazione I maschi con la mutazione manifestano il fenotipo Le femmmine: hanno un fenotipo piu lieve, 1) sono 46,XX (quindi hanno un allele che produce la proteina normale) 2) Inattivazione casuale della X 22

23 X fragile: diagnosi molecolare La PCR permette di identificare gli alleli normali e le premutazioni, ma per le espansioni maggiori, la presenza di un elevato numero di GC (la tripletta e ) rende meno efficiente la tecnica. Si ricorre al Southern Blot dopo doppia digestione con enzimi sensibili alla metilazione: la regione espansa fino a mutazione completa e ipermetilata e l enzima non taglia. 23

24 Analisi delle mutazioni:pcr Primer Normale 5-50 Premutazione Mutazione completa >200 24

25 Meccanismo di formazione dell espansione 25

26 Distrofia miotonica 26

27 (AD) ~ 1/20000 Distrofia miotonica Fenotipo: problemi alla muscolatura scheletrica, liscia, oculare (facies caratteristica,difficolta ad utilizzare gli utensili, i muscoli si contraggono facilmente ma si rilassano con difficoltà) cataratta, difetti cardiaci (pace maker, terapia farmacologica) Intelletto: normale o lievemente deficitario Anomalie del sistema endocrino (spesso i pazienti sono diabetici) Aspettativa di vita ridotta 27

28 Distrofia miotonica (AD) ~ 1/20000 DMPK (mappata sul cromosoma 19) è una Ser-thr Kinasi -E espressa in cervello, muscolo, cuore - Il cui ruolo non è chiaro(regolazione componenti del citoscheletro, omeostasi del calcio) -Contiene ()n al 3 UTR, -Nei pazienti sembra esserci un deficit di questa proteina Lieve diagnosi anni, n=50-150, cataratta, miotonia lieve Classica diagnosi anni, n= , muscoli, cuore, occhi, intelletto Congenita diagnosi entro i 10 anni, generalmente alla nascita, pochi movimenti fetali, grave ipotonia, MR nel 50% dei casi n= , di solito ereditano l allele espanso dalla madre, 28

29 Il gene DMPK 29

30 Il gene DMPK Nei pazienti ()n è espanso 30

31 Distrofia miotonica questo non e sufficiente per dire che quel gene e il responsabile della malattia: bisogna individuare anche affetti con mutazioni puntiformi. Nel caso di FMR1 ci sono affetti senza espansione con mutazioni puntiformi che impediscono l espressione. si ritiene che il gene identificato sia il principale, ma non si e ancora compreso perche l espansione provochi la patologia. Forse altera l espressione dei geni adiacenti. Esistono modelli murini che sembrerebbero validare questa ipotesi. Ma allora bisogna ritenere DM una sindrome da geni contigui 31

32 La diagnosi molecolare Distrofia Miotonica 32

33 Il materiale didattico e presente in rete: NON sono dispense, ma un ausilio allo studio sul libro 33