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1 Enzimi Prof Spina Riabilitativa 2015 /2016

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3 Gli enzimi i sono catalizzatori t i biologici i i molto efficienti: i caratterizzati da potere catalitico e specificità, possegono una porzione dedicata: il sito attivo, tutti gli enzimi sono proteine, con l eccezione di molecole di RNA cataliticamente attive, legano con specificità diversa molte molecole di cui promuovono la catalisi fornendo loro il giusto orientamento e stabilizzando lo stato di transizione.

4 Gli enzimi sono catalizzatori molto efficaci. Possono accellerare una reazione di migliaia di volte: L anidrasi carbonica ad esempio porta la velocità di reazione da 1,3 x10-1 sec a 1 x 10 6 sec, con un potenziamento di 7,7 x10 6. Ogni molecola l di E può òid idratare 10 5 CO 2 al secondo

5 La specificità ità di un E è dovuta alla interazione con il substrato; ciò è reso possibile grazie all intricata struttura tridimensionale della p. enzimatica, che garantisce la corretta funzione dell E. Si consideri i che la DNA polimerasi i I introduce un nucleotide sbagliato nella catena meno di 1 volta su

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9 Molti E hanno bisogno di cofattori per svolgere la loro attività. Apoenzima + Cofattore = Oloenzima

10 Cofattore Tiamina pirofosfato (B1)... Flavin adenin dinucleotide (B2).. Enzima Piruvato Deidrogenasi Monoamina Ossidasi Nicotinamide id adenin dinucleotide (niacina i NAD)... Lattico Deidrogenasi i Piridossal Fosfato (B6).. Transaminasi Coenzima A (Ac. Pantotenico). Acetil CoA Carbossilasi Biotina Piruvato Carbossilasi Zn2+ Anidrasi Carbonica Mg2+... Esochinasi Mg2+... Ureasi

11 Gli Enzimi convertono l energia da una forma all altra L energia contenuta nei reagenti viene riconvertita con elevata efficienza; ad es. - Nella fotosintesi t i l energia radiante della luce è convertita in energia di un legame attraverso un gradiente ionico; - nei mitocondri l energia libera contenuta nelle molecole dei nutrienti è convertita prima nell energia libera di un gradiente ionico poi in energia libera del legame del Pi nell ATP. - L energia dell ATP può essere usata in molti modi:in lavoro meccanico (contrazione della miosina), movimento (trasporto di ioni o piccole molecole da un comparto all altro -pompe-ioniche)

12 Gli E vengono classificati in base al tipo di reazione che catalizzano Ossidoreduttasi Ossidoriduzione es. LDH. Transferasi transf.di 1gruppo es. NMPchinasi. Idrolasi Reaz. di idrolisi es. Carbossilasi. Liasi Agg. o Rim. di un gruppo es. Fumarasi. Isomerasi Trasferimento intramolecolare es. Ti Trioso PI. Ligasi Unione di 2 substrati a spese di ATP es.aminoacil- transferasi.

13 La specificità ità di un E è dovuta all interazione con il substrato; ciò è reso possibile dall intricata struttura tridimensionale della proteina enzimatica, ciò garantisce il corretto funzionamento dell E, si consideri che la DNA polimerasi i I introduce un nucleotide sbagliato nella catena meno di 1 volta su

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16 L energia libera è la funzione termodinamica + utile per capire gli E. Ricordiamo brevemente che l energia dell universo è costante, (sistema + ambiente= K). L entropia è il grado di ordine, entropia ordine; la variazione di entropia dell ambiente sarà collegato alla quantità di calore trasferita dal sistema. L entalpia è il calore contenuto in un sistema. L energia libera di Gibbs è in relazione alla differenza di entalpia e di entropia del sistema tenendo conto della T.: G = Hsist - T ssistini altre parole una reazione può avvenire spontaneamente solo se la variazione di energia libera è negativa

17 Due proprietà termodinamiche di una reazione sono utili per comprendere il funzionamento degli E. La differenza di energia libera G tra i prodotti P e i reagenti S e L energia richiesta per la conversione dei reagenti nei corrispondenti stati di transizione. La prima determina se una reazione può avvenire spontaneamente, la seconda la velocità con cui avviene.

18 E+S ES EP E+P Equilibrio Chimico e Velocità della Reazione

19 G ++ : energia di attivazione non

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22 Quanto prodotto per unità di tempo è la velocità della reazione

23 LE MIGLIAIA DI REAZIONI CHE AVVENGONO NEGLI ORGANISMI VIVENTI SI VERIFICANO IN CONDIZIONI ESTREMAMENTE BLANDE E AD UNA VELOCITÁ UTILE ALL'ECONOMIA CELLULARE GRAZIE ALL'ATTIVITÁ CATALITICA DI PROTEINE SPECIFICHE: GLI ENZIMI

24 UNA REAZIONE CHIMICA AVVIENE PERCHÈ UNA CERTA FRAZIONE DI MOLECOLE DI REAGENTE(I) POSSIEDE, IN UN DATO ISTANTE, ABBASTANZA ENERGIA PER RAGGIUNGERE UNA CONDIZIONE ATTIVATA, A PIÚ ALTO CONTENUTO ENERGETICO, DETTA STATO DI TRANSIZIONE NE

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26 IL CATALIZZATORE SI LEGA TRANSITORIAMENTE AL REAGENTE FORMANDO UN COMPLESSO IL CUI STATO DI TRANSIZIONE HA MINOR ENERGIA DI QUELLO DELLA REAZIONE NON CATALIZZATA.

27 IN ANALOGIA CON GLI ALTRI CATALIZZATORI, GLI ENZIMI: 1. ACCELERANO LE REAZIONI 2. ABBASSANO L'ENERGIA DI ATTIVAZIONE 3. NON ALTERANO L'EQUILIBRIO DELLE REAZIONI

28 A DIFFERENZA DEGLI ALTRI CATALIZZATORI, GLI ENZIMI PRESENTANO: 1. UN ENORME POTERE CATALITICO 2. UN'ELEVATA SPECIFICITÁ 3. LA POSSIBILITÁ DI ESSERE REGOLATI

29 LA VELOCITÁ DELLE REAZIONI CATALIZZATE DAGLI ENZIMI È DA 10 3 A VOLTE MAGGIORE DI QUELLA DELLE STESSE REAZIONI IN ASSENZA DI ENZIMA.

30 H 2 O + CO 2 <-----> HCO 3- + H + VELOCITÁ = 1 H + <-----> O CO 2 HCO H ANIDRASI CARBONICA VELOCITÁ = 10 7

31 L'ANIDRASI CARBONICA È UNO DEGLI ENZIMI A PIÙ ELEVATO NUMERO DI TURNOVER : OGNI MOLECOLA PUÒ IDRATARE 6x10 5 MOLECOLE DI CO 2 PER SECONDO

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37 MODELLO CHIAVE-SERRATURA IL SITO ATTIVO DELL'ENZIMA HA UNA FORMA COMPLEMENTARE A QUELLA DEL SUBSTRATO

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39 MODELLO DI ADATTAMENTO INDOTTO IL SITO ATTIVO ASSUME UNA FORMA COMPLEMENTARE A QUELLA DEL SUBSTRATO SOLO DOPO CHE QUESTO SI È LEGATO

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42 CINETICA ENZIMATICA STUDIA LA VELOCITÁ DELLE REAZIONI ENZIMATICHE.

43 VELOCITÁ E' DEFINITA DAL NUMERO DI MOLI DI PRODOTTO CHE SI FORMANO IN UN SECONDO.

44 VELOCITÁ INIZIALE (V 0 ) LA VELOCITÁ DEVE ESSERE MISURATA A TEMPI BREVI, QUANDO CIOÈ SI È CONSUMATA SOLO UNA PICCOLA PARTE DEL SUBSTRATO.

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48 L' equazione di Michaelis-Menten può però essere manipolata per ottenere l' equazione di una retta in cui Vmax e Km siano delle intercette e non più degli asintoti. Uno dei metodi più usati e quello di Lineweaver-Burk che usa la forma reciproca dell' equazione di Michaelis-Menten: Menten: ove le variabili sono 1/v e 1/[S]. 1/Vmax è l' intercetta sull' asse y e -1/Km èl' intercetta sull' asse x.

49 1/Vmax è l' intercetta sull' asse y e -1/Km è l' intercetta sull' asse x.

50 Sia la trasformazione di Lineweaver-Burk che quella di Eadie-Hofstee rendono più semplice e più accurata la determinazione di Vmax e Km e permettono di scoprire se l' enzima stia lavorando secondo una cinetica classica (stato stazionario ed equilibrio rapido). L'uso di trasformazioni lineari dell' equazione di Michaelis- Menten sono inoltre particolarmente utili nello studio degli inibitori reversibili E E E+S ES E+P

51 E+S ES E +P E+S ES E + P

52 Significato pratico della Km. Il valore della Km è importante per varie ragioni: La Km rappresenta approssimativamente il valore della concentrazione intracellulare del substrato. Infatti per [S intracell ] << Km, l' enzima sarebbe estremamente sensibile a variazioni della concentrazione del substrato, ma gran parte del suo potenziale catalitico sarebbe inutilizzato in quanto in queste condizioni v<<vmax. a) Non avrebbe senso dal punto di vista fisiologico neppure che [S intracell ] fosse >> Km, in quanto l' enzima pur lavorando con una velocità vicino alla Vmax,,perderebbe la possibilità di essere regolato da variazioni della concentrazione del substrato.

53 Quindi LA Km PUO ESSERE DEFINITA COME QUEL VALORE DI CONCENTRAZIONE DEL SUBSTRATO A CUI: LA REAZIONE PROCEDE AD UNA VELOCITÁ PARI A METÁ DELLA Vmax

54 L'INIBIZIONE ENZIMATICA È CLASSIFICATA IN DUE TIPI: - IRREVERSIBILE - REVERSIBILE

55 ESEMPIO TIPICO DI INIBITORE IRREVERSIBILE È IL DIISOPROPILFLUOROFOSFATO CHE SI LEGA COVALENTEMENTE CON UN RESIDUO DI Ser DELLE PROTEASI SERINICHE

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57 INIBIZIONE REVERSIBILE VIENE FONDAMENTALMENTE DISTINTA IN DUE TIPI: - COMPETITIVA - NON COMPETITIVA

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59 INIBIZIONE COMPETITIVA L'INIBITORE PRESENTA ANALOGIA STRUTTURALE CON IL SUBSTRATO E QUINDI COMPETE CON QUESTO PER IL SITO ATTIVO

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62 INIBIZIONE NON COMPETITIVA L'INIBITORE ED IL SUBSTRATO SI POSSONO LEGARE SIMULTANEAMENTE ALL'ENZIMA. CIÒ SIGNIFICA CHE I SITI DI LEGAME SONO DISTINTI.

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64 INIBIZIONE SUICIDA UN ENZIMA CONVERTE UN SUBSTRATO IN UN INIBITORE REATTIVO CHE IMMEDIATAMENTE BLOCCA LA SUA ATTIVITÁ CATALITICA.

65 POICHE' LA VELOCITÁ DELLE E REAZIONI CELLULARI DIPENDE DAGLI ENZIMI, IL CONTROLLO DELLA LORO ATTIVITÁ RAPPRESENTA IL PIU IMPORTANTE FATTORE DI REGOLAZIONE DEL METABOLISMO.

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67 LA VARIAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DELL'ENZIMA ENZIMA O DELLE SUE PROPRIETÁ CINETICHE RAPPRESENTA IL MEZZO PIÙ EFFICACE DI REGOLAZIONE.

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69 E CHIAMATA TAPPA LIMITANTE LA REAZIONE PIÙ LENTA CHE CONDIZIONA LA VELOCITÁ COMPLESSIVA DI UNA VIA METABOLICA.

70 ALTRI IMPORTANTI FATTORI DI REGOLAZIONE POSSONO ESSERE: - ORGANIZZAZIONE DI SISTEMI MULTIENZIMATICI - COMPARTIMENTALIZZAZIONE - TRASPORTO SELETTIVO DI METABOLITI ATTRAVERSO LE MEMBRANE

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72 QUATTRO SONO I MECCANISMI DI REGOLAZIONE DELL'ATTIVITÁ ENZIMATICA: - ATTIVAZIONE DI ZIMOGENI - INTERCONVERSIONE - ALLOSTERISMO - REGOLAZIONE ONE DA PARTE DI PROTEINE DI CONTROLLO

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77 MODIFICHE POST-SINTETICHE PIU FREQUENTI DELLE PROTEINE - FOSFORILAZIONE - ACETILAZIONE - IDROSSILAZIONE - METILAZIONE - ADP-RIBOSILAZIONE - UBIQUITINAZIONE

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81 Teoria Chiave-Serratura

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83 Gli isoenzimi forniscono un mezzo di regolazione specifico di stadi di sviluppo e tessuti distinti Differiscono nella sequenza di aa., ma catalizzano la stessa reazione. Presentano di solito differenti parametri cinetici: Km e Vmax, o differenti tipologie di regolazione. Sono codificati da diversi loci genici: per duplicazione e divergenza. Possono essere distinti per la diversa mobilità elettroforetica.

84 GLI ENZIMI CHE CONSENTONO LA DIGESTIONE Indispensabile per l utilizzazione delle proteine, sono peptidasi o proteasi dette: endopeptidasi i (quando idrolizzano i legami peptidici all interno della molecola, generando spezzoni polipetidici) esopeptidasi (quando attaccano il legame peptidico p terminale della catena polipeptidica). p p I frammenti polipeptidici possono essere ulteriormente t demoliti rimuovendo l aminoacido id con l aminogruppo libero (aminopeptidasi) o quello con il gruppo carbossilico libero (carbossipeptidasi). Una dipeptidasi libera gli aminoacidi dai dipeptidi

85 LA DIGESTIONE PROTEICA AVVIENE IN TRE FASI: gastrica, pancreatica, intestinale. Nel duodeno termina l azione della pepsina gastrica ed inizia quella degli enzimi del succo pancreatico (tripsina, i chimotripsina, i i elastasi, carbossipeptidasi). Un sistema di enzimi secreti dall intestino (duodeno e digiuno) è l erepsina. ASSORBIMENTO aminoacidi: intestino>colon>stomaco vena porta fegato