La catalisi enzimatica. Copyright 2013 Zanichelli editore S.p.A.

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2 Le proprietà generali degli enzimi Concetti chiave Gli enzimi si differenziano dai catalizzatori chimici di uso comune per velocità, condizioni, specificità e controllo della reazione. Le proprietà fisiche e chimiche uniche del sito attivo limitano l'attività degli enzimi a substrati e reazioni specifiche. Alcuni enzimi richiedono ioni metallici o cofattori organici.

3 Il fattore Fig. 8-1.jpg

4 Termodinamica e cinetica chimica

5 Velocità di Reazione

6 Catalisi Chimica vs Enzimatica

7 Le velocità delle reazioni catalizzate dagli enzimi sono elevate

8 Gli enzimi agiscono su substrati specifici

9 Interazioni stereospecifiche enzima-substrato

10 Gli enzimi sono macchine molecolari

11 Alcuni enzimi catalizzano reazioni altamente stereospecifiche

12 Alcuni enzimi sono più permissivi

13 Gli enzimi sono classificati in base al tipo di reazione che catalizzano

14 Classificazione degli Enzimi Nome raccomandato e nome sistematico. Numero di Classificazione: Numero a quattro cifre preceduto da EC (Enzyme Commission: la prima cifra indica la classe, la seconda la sotto-classe, la terza la sotto-sotto-classe, la quarta il numero seriale).

15 Unità di attività enzimatica e dosaggio degli Enzimi Catal (kat, nel sistema SI): è la quantità di enzima che converte 1 mole di reagente nel prodotto in 1 secondo nelle condizioni di reazione standard (ottimali). L Unità internazionale (U o UI): corrisponde alla quantità di enzima che converte 1 mole di reagente nel prodotto in 1 minuto, nelle condizioni di reazione standard (ottimali). Poiché 1 mole/min = 1, moli/s, 1U = 1, kat. L attività specifica: è il rapporto tra il numero di U o di kat e il volume che la contiene (U/mL) o la quantità totale di proteina espressa in milligrammi (U/mg).

16 Effetto del ph L attività enzimatica è influenzata dal ph. Ciò può derivare dai valori di pk a del substrato e/o dell enzima. Perciò il ph scelto e la selezione di un tampone appropriato sono fondamentali per i saggi di attività enzimatica. Amminoacidi nel sito catalitico o implicati nella stabilizzazione della conformazione nativa

17 Effetto della temperatura Le reazioni enzimatiche, come le reazioni chimiche, dipendono dalla temperatura; tuttavia, ad una determinata soglia, il moto di agitazione termica denatura l enzima

18 Proprietà generali degli Enzimi Gli enzimi, come le altre proteine, sono classificati come semplici (se costituite esclusivamente da amminoacidi) o coniugati (se contengono metalli o composti organici). Nel loro complesso, gli elementi non amminoacidici che si aggiungono alla porzione proteica di un enzima coniugato vengono detti cofattori. La maggior parte dei cofattori organici, i coenzimi, sono derivati di vitamine solubili in acqua. Gli ioni metallici sono i più comuni cofattori inorganici. Gli enzimi la cui forma attiva comprende uno o più metalli saldamente legati alla matrice proteica (Fe 2+, Fe 3+, Cu 2+, Cu +, Zn 2+, Mn 2+, Co 3+ o Mo 3+ ) sono detti metalloenzimi (un terzo degli enzimi conosciuti). Gli enzimi attivati da metalli (Na +, K +, Mg 2+ o Ca 2+ ) richiedono solo un legame debole di questi.

19 I cofattori ampliano il range delle reazioni enzimatiche APOENZIMA (Enzima cofattore) OLOENZIMA (Enzima + cofattore)

20 Coenzimi e Gruppi prostetici Se i cofattori organici si legano reversibilmente all enzima, sono detti coenzimi (p.e., NAD, FAD). Se i cofattori organici sono legati permanentemente all enzima, sono indicati come gruppi prostetici (p.e., eme)

21 Esempi di enzimi e loro cofattori Beriberi Pellagra Anemia perniciosa

22 COFATTORI organici (e vitamine) NAD(P) niacina (o vit B 3 ) FAD e FMN riboflavina (o vit B 2 ) Ubichinone (o CoQ) CoA pantotenato (o vit B 5 ) Eme NTP TPP tiamina THF folato PLP piridossina (o vit B 6 ) Biotina Cobalammina vit B 1 Cofattori.pdf

23 Scheda riassuntiva dei principali coenzimi

24 Struttura e reazione del NAD(P)+

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27 Le proprietà generali degli enzimi Punto di verifica Quali proprietà consentono di distinguere gli enzimi dagli altri catalizzatori? Descrivete come sono classificati e nominati i diversi enzimi. Quali sono i fattori che influenzano la specificità per il substrato di un enzima? Per quale motivo i cofattori sono necessari per determinate reazioni enzimatiche? Qual è la correlazione tra cofattori, coenzimi e gruppi prostetici?

28 L'energia di attivazione e la coordinata di reazione Concetti chiave Un enzima fornisce un percorso a bassa energia per convertire un substrato in prodotto, ma non influenza la variazione di energia libera complessiva della reazione.

29 Catalisi

30 Diagrammi dello stato di transizione Perché due molecole possano reagire devono scontrarsi e rompere i legami che tengono uniti i loro atomi; per far questo necessitano di sufficiente energia cinetica, tale da portarsi in stretta vicinanza l una con l altra superando la repulsione tra i rispettivi gusci elettronici. Lo stato di massima energia di un sistema di molecole reagenti è detto complesso attivato o stato di transizione. La barriera energetica che separa i reagenti dallo stato di transizione prende il nome di energia di attivazione (ΔG ). Non si confonda ΔG con ΔG ; il ΔG (variazione di energia libera standard di reazione) è invece una misura della stabilità termodinamica relativa tra reagenti e prodotti. In altre parole, il ΔG indica il punto di equilibrio della reazione.

31 Diagramma dello stato di transizione di una reazione a due tappe

32 Effetto di un catalizzatore sul diagramma dello stato di transizione

33 L'energia di attivazione e la coordinata di reazione Punto di verifica Disegnate e identificate le varie parti dei diagrammi di transizione di stato per una reazione con e senza il catalizzatore. Qual è la relazione tra ΔG e ΔG?

34 I meccanismi di catalisi Concetti chiave Le catene laterali degli amminoacidi in grado di donare o accettare protoni possono prendere parte alle reazioni chimiche come catalizzatori acidi o basici. I gruppi nucleofili possono catalizzare le reazioni tramite la formazione di legami covalenti transitori con il substrato. Nella catalisi da ioni metallici le proprietà elettroniche tipiche dello ione metallico favoriscono la reazione. Gli enzimi accelerano le reazioni avvicinando i gruppi reagenti e orientandoli correttamente. La stabilizzazione dello stato di transizione può diminuire significativamente l'energia di attivazione di una reazione.

35 Catalisi Acida Generale Accelera la velocità della reazione mediante il trasferimento temporaneo di un protone da un acido di Bronsted al substrato. Es., His 57 nel sito catalitico della chimotripsina (primo stadio); His 119 nel sito catalitico della RNAsi A

36 Catalisi Basica Generale Accelera la velocità della reazione mediante il trasferimento temporaneo di un protone dal substrato ad una base di Bronsted. Es., l His 12 nel sito catalitico della RNAsi A e l His 57 nel sito catalitico delle serina proteasi (secondo stadio)

37 Catalisi Acido-Base Generale Prevede l azione simultanea di un catalizzatore acido generale e di un catalizzatore basico generale sul substrato. Es., le due istidine nel sito catalitico dell RNAsi A.

38 Struttura dell'rnasi S pancreatica bovina

39 Il meccanismo dell'rnasi A

42 Catalisi covalente Accelera la velocità edlla reazione attraverso la formazione temporanea di legami covalenti tra enzima e substrato. Prevede due tappe: òa prima, la tappa nucleofila serve per formare un legame covalente tra enzima e substrato; la seconda è la tappa elettrofila in cui si ha la perdita di elettroni dal centro della reazione verso un sito elettrofilo. Es., chimotripsina

43 Gruppi nucleofili ed elettrofili di rilevanza biologica

44 Gruppi nucleofili di rilevanza biologica

45 Esempio di catalisi covalente (tappa nucleofila: formazione legame E-S)

46 Gruppi elettrofili di rilevanza biologica

47 Esempio di catalisi covalente (fasse elettrofila: rottura del legame E-S)

48 Catalisi da effetto di prossimità e di orientamento Aumenta la velocità della reazione mediante la vicinanza e l immobilizzazione nel corretto orientamento dei gruppi reattivi all interno del sito catalitico. L energia libera necessaria per compiere questo lavoro è data dall energia di legame del substrato all enzima.

49 La catalisi per vicinanza e orientamento

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51 Catalisi da metallo 1. Stabilizzazione di cariche, tramite interazioni elettrostatiche favorevoli tra metallo e gruppi reattivi del substrato 2. Promozione del corretto orientamento del substrato 3. Promozione delle reazioni redox 4. Catalisi elettrofila 5. Promozione della catalisi nucleofila mediante un aumento della ionizzazione dell acqua

52 Ruolo dello ione Zn 2+ nell'anidrasi carbonica Anidrasi carbonica PDBid 1HCB

53 Ruolo dello ione Zn 2+ nell'anidrasi carbonica

54 La catalisi attraverso il legame preferenziale dello stato di transizione

55 La catalisi attraverso il legame preferenziale dello stato di transizione

56 I meccanismi di catalisi Punto di verifica Descrivete come i gruppi funzionali delle proteine agiscono da catalizzatori acido-base. Come è possibile per una singola catena laterale di un amminoacido comportarsi da acido e da base? Spiegate in che modo i nucleofili funzionano da catalizzatori covalenti. Quali sono gli amminoacidi adatti a fare ciò? Elencate i modi in cui gli ioni metallici prendono parte alla catalisi. Quali sono i ruoli della vicinanza e dell'orientamento nella catalisi enzimatica? Perché è improbabile che i catalizzatori non enzimatici agiscano legando preferenzialmente lo stato di transizione?

57 Le serina proteasi Concetti chiave I residui cataliticamente attivi di Ser, His e Asp delle serina proteasi sono stati identificati tramite marcatura chimica e analisi strutturale. La tasca di legame determina la specificità del substrato delle diverse serina proteasi. Le serina proteasi catalizzano l'idrolisi del legame peptidico per effetti di vicinanza e orientamento, catalisi acido-base, catalisi covalente, catalisi elettrostatica e stabilizzazione dello stato di transizione. Gli zimogeni sono i precursori inattivi degli enzimi.

58 Le serina proteasi Concetti chiave I residui cataliticamente attivi di Ser, His e Asp delle serina proteasi sono stati identificati tramite marcatura chimica e analisi strutturale. La tasca di legame determina la specificità del substrato delle diverse serina proteasi. Le serina proteasi catalizzano l'idrolisi del legame peptidico per effetti di vicinanza e orientamento, catalisi acido-base, catalisi covalente, catalisi elettrostatica e stabilizzazione dello stato di transizione. Gli zimogeni sono i precursori inattivi degli enzimi.

59 Tripsina di bovino con il suo inibitore leupeptina Complesso covalente leupeptina-tripsina PDBid 2AGI

60 I residui del sito attivo della chimotripsina Chimotripsina PDBid 2AGI

61 Organofosfati: I veleni per il sistema nervoso diisopropilfluorofosfato (DFP) Target: enzimi con serina attivata Target vitale: acetilcolinesterasi

62 Il meccanismo di catalisi delle serina proteasi

68 Stabilizzazione TS nelle serina proteasi

69 Tasche di specificità di serina proteasi

70 Il complesso tripsina-bpti