Quorum sensing microbico e igiene degli alimenti

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1 Quorum sensing microbico e igiene degli alimenti Valerio Giaccone Dipartimento di Sanità pubblica, Patologia comparata e Igiene veterinaria, Facoltà di Medicina veterinaria, Università degli Studi di Padova. 1. PREMESSA I batteri sono esseri viventi come tutti gli altri, solo un po meno complessi come struttura. Per decenni sono stati visti come esseri viventi molto individualisti che conducono la loro esistenza come singole cellule libere in un mezzo, alla costante ricerca di nutrienti per sopravvivere e, se ci sono le possibilità, riprodursi. In realtà oggi sappiamo che i batteri fanno parte di una società piuttosto complessa e che sono in grado di comunicare fra loro. Non si può dire che parlino o cantino, così come accade all uomo o come fanno (in modo più elementare) delfini e balene, ma certo si scambiano informazioni rilasciando nell ambiente una serie di messaggi che i loro consimili percepiscono. Per esempio, i batteri periodicamente fanno il censimento della popolazione e tastano il terreno, ossia verificano praticamente in tempo reale le condizioni dell ambiente che li circonda, sia esso l ambiente esterno o l interno di un essere animato come una pianta, un animale o l uomo stesso. In questo contesto i batteri producono e rilasciano nell ambiente circostante alcuni composti chimici specifici che fungono da trasmettitori del messaggio; altri batteri li captano, li interpretano e rispondono producendo a loro volta dei messaggi, diciamo così, odorosi. Nella società dei batteri (o meglio, nell ambiente in cui una certa popolazione microbica è inserita) corrono costantemente dei segnali chimici, molecole di piccole dimensioni simili agli anticorpi e chiamati autoinduttori. Queste molecole si accumulano al di fuori delle singole cellule microbiche, ma finché la carica microbica è bassa e diluita nell ambiente esterno non succede nulla. Quando però la stessa popolazione si accresce e supera un certo livello (un quorum, visto come numero legale per una votazione) le molecole che si sono accumulate possono innescare una serie di eventi che si succedono per lo più con effetto a cascata determinando qualche reazione o qualche effetto. Questo sistema di comunicazione è chiamato, appunto, quorum sensing. Il quorum sensing, in altri termini, è un sistema complesso di comunicazione cellula-cellula con il quale i batteri sono in grado di comunicare fra loro. Grazie a questo sistema i batteri sono capaci di mettere in atto attività coordinate, una capacità che un tempo si riteneva propria soltanto degli esseri viventi superiori. Questa capacità di comportarsi come un organismo complesso coordinato ha parecchi vantaggi per una popolazione microbica, quali la capacità di migrare verso un altro ambiente dove si trovino migliori condizioni di habitat e di nutrienti o l adozione di nuovi modelli di sviluppo che potrebbero costituire una difesa contro le aggressioni esterne. Alla luce delle nuove acquisizioni in questo settore si profila all orizzonte una nuova disciplina, la socio-microbiologia che dovrebbe studiare i comportamenti di una singola popolazione batterica che funziona come un aggregato coordinato di esseri

2 viventi e non come un insieme caotico e disordinato di singoli entità (Parsek e Greenberg, 2005; Gobbetti et al., 2007). Sfruttando il quorum sensing i batteri possono regolare: 1) l emissione di bioluminescenza 2) la formazione di biofilm sulle superfici di lavoro nelle industrie alimentari 3) la crescita competitiva tra differenti popolazioni e la sporulazione 4) la sintesi di antibiotici e di batteriocine 5) l induzione di fattori di virulenza nelle piante o negli umani 6) i processi di infezione degli organismi superiori 7) la differenziazione di linee cellulari a partire da cellule primigenie. Il presupposto essenziale perché i microrganismi possano colloquiare fra loro e coordinarsi nelle loro attività sta proprio nelle concentrazioni dei mediatori chimici del messaggio nel mezzo in cui i batteri sono immersi. È indispensabile qui ricordare che i batteri possono essere presenti nell ambiente in due forme di vita: a) la forma libera nel mezzo acquoso, definita forma planctonica b) la forma sessile, adesa a una qualsiasi superficie e immersa in una matrice amorfa di sostanza organica al cui interno i batteri possono sopravvivere e moltiplicare. Questo speciale aggregato di batteri e sostanza organica (EPS Extracellular Polymeric Substances) è chiamato biofilm. I biofilm sono un universo in miniatura e per i microrganismi costituiscono un ambiente di vita in cui la crescita o la riduzione della popolazione microbica è regolata dal quorum sensing in base alle condizioni più o meno favorevoli del substrato. Come tali, i biofilm costituiscono un aspetto importante per l igiene degli alimenti perché è proprio grazie ai biofilm che batteri alteranti o pericolosi per la salute (come Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus e Bacillus cereus) possono sopravvivere su superfici di lavoro anche in assenza di nutrienti e resistere all azione dei disinfettanti. Inoltre, sempre grazie al quorum sensing all interno della loro popolazione i batteri possono modulare la manifestazione di determinate caratteristiche fenotipiche rispetto ad altre secondo le necessità. Immersi in un biofilm o liberi nell ambiente in forma planctonica, i batteri comunicano fra di loro sintetizzando e liberando nel mezzo dei messaggi di tipo chimico costituiti da specifici composti. I più conosciuti e studiati sono gli AHL ossia gli acil-omoserinalattoni. Posto di fronte a un sistema di comunicazione piuttosto complesso che si fonda su una cascata di reazioni biochimiche e sulle interazioni di geni che codificano questa sintesi, un igienista degli alimenti, da buon praticone, è portati a chiedersi a che cosa possa servire entrare così a fondo nella vita intima di una comunità batterica, a cosa serva studiare i sofisticati meccanismi biochimici di comunicazione dei batteri. L importanza di una simile conoscenza diventa evidente se ricorriamo, come paragone, all esempio dei codici cifrati utilizzati dai Comandi militari giapponesi nella Seconda Guerra mondiale per emanare ordini alle truppe dislocate lontano dalla madrepatria. Quando gli Americani riuscirono a decifrare il codice cifrato utilizzato dai Nipponici, le sorti della guerra si ribaltarono perché i primi riuscirono a inserirsi nelle comunicazioni del nemico e a scoprire quali fossero i bersagli degli attacchi. Traslando il concetto, conoscere i meccanismi che regolano la comunicazione tra i singoli componenti di una popolazione microbica immersa in un biofilm può permetterci di tenerla meglio sotto controllo e di dominarla, facendo in modo che quella rallenti il suo sviluppo (come nel caso di germi patogeni o alteranti) o lo

3 accentui, nel caso di batteri utili nelle fermentazioni microbiche. In questa sede mi prefiggo soltanto di riassumere i concetti essenziali del quorum sensing rimandando i lettori ai riferimenti bibliografici citati alla fine del documento per ulteriori approfondimenti sull argomento. È importante sottolineare subito che i batteri possono scambiarsi messaggi sia all interno di una stessa specie sia tra generi microbici differenti. Tuttavia, i meccanismi chimici sui quali si fonda il quorum sensing dei batteri Gram negativi sono differenti da quelli che permettono ai Gram positivi di comunicare fra loro: in pratica, i mediatori chimici in gioco non sono gli stessi. 2. QUORUM SENSING DEI BATTERI GRAM NEGATIVI Il primo meccanismo di quorum sensing scoperto ha riguardato proprio un batterio Gram negativo, Vibrio fischeri, un batterio bioluminescente che vive come simbionte negli organi luminosi specializzati di un particolare cefalopode decapode (Euprymna scolopes) e del pesce Monocentres japonicus. Questo sistema è sempre preso a paradigma per dare una prima idea e spiegare meglio i meccanismi del quorum sensing. Il gene luxi, racchiuso in un operone chiamato luxicdabe, codifica la sintesi di una specifica sintetasi che a sua volta porta alla sintesi di una molecola specifica, N-(3- ossoesanoil)-omoserina lattone (OHHL) che è l autoinduttore. Il gene luxr, a sua volta, codifica la produzione di un fattore trascrizionale il quale, dopo avere interagito con l autoinduttore prima citato, va a legarsi all operone luxicdabe rendendo possibile e attivando la trascrizione di tutti i geni ivi contenuti che portano alla sintesi di tutti i componenti del sistema luciferasi così come a un aumento esponenziale della sintesi di LuxI. Per passare alla forma attiva il trascrittore LuxR richiede la presenza di due distinte chaperonine, GroEL e GroESL (Adar et al., 1992). In sintesi, quindi, l autoinduttore fa sapere a tutti i batteri che essi esistono all interno di un organo luminescente e che non sono, invece, immersi nel mare dove sarebbero così dispersi da non potere creare mai le concentrazioni sufficienti per dare origine al messaggio. Nei batteri Gram negativi il quorum sensing è mediato dagli acil-omoserina-lattoni (AHL), la cui sintesi prende le mosse da due differenti gruppi di composti, l Sadenosil-metionina (SAM) e una proteina acil-acil carrier (acil-acp). Il LuxI promuove la formazione di un legame ammidico tra acil-acp e SAM, e dalle successive reazioni si origina un AHL. In tutti i segnali sinora individuati le molecole hanno come denominatore comune proprio l anello omoserina-lattone (Parsek e Greenberg, 2005). Le molecole possono poi contenere catene laterali con un numero di atomi di carbonio che varia tra 4 e 14 e altre piccole differenze strutturali e di composizione. La membrana dei batteri Gram negativi è permeabile agli AHL e man mano che la cellula li sintetizza, li emette nell ambiente esterno, dove devono avere la possibilità di accumularsi. Finché le concentrazioni microbiche sono basse l AHL diffonde passivamente al di fuori delle singole cellule a causa del gradiente di concentrazione (maggiore all interno della cellula e più basso al di fuori di essa). Quando però il numero di batteri presenti in un ambito piuttosto ristretto comincia a diventare notevole, la concentrazione di AHL al di fuori delle singole cellule batteriche diventa presto superiore a quello presente all interno di ciascuna di esse. A questo punto, l AHL deve prima accumularsi all interno della cellula finché la sua concentrazione

4 diventa superiore a quella presente all esterno. Solo a quel punto potrà fuoriuscirne dell altro. Le principali specie batteriche di interesse alimentare in cui è documentata la presenza di proteine LuxI sono: Vibrio fischeri, Burkholderia cepacia, Enterobacter agglomerans, Erwinia carotovora, Escherichia coli, Pseudomonas aureofaciens, Ps. aeruginosa, Ralstonia solanacearum, Salmonella enterica ser. typhimurium, Serratia liquefaciens, Yersinia enterocolitica QUORUM SENSING E ALTERAZIONI DEGLI ALIMENTI DA BATTERI GRAM NEGATIVI Con i dovuti distinguo, si può generalizzare ricordando che la flora microbica delle carni fresche refrigerate in via di putrefazione è costituita essenzialmente da: (1) pseudomonadacee che possono arrivare a cariche fino a 10 9 ufc/g se le carni sono conservate in aria (2) batteri lattici ed enterobatteri (fino a ufc/g) nel caso delle carni confezionate in pellicola plastica sotto vuoto. Parecchi autori, tra cui cito Jay e coll. (2003) e Medina-Martinez e coll. (2006) hanno rilevato la presenza di AHL in campioni di carni prelevati direttamente dal circuito commerciale, pervenendo alla conclusione che batteri quali Pseudomonas possano formare dei biofilm sulla superficie delle carni alterate e che il quorum sensing sia uno dei meccanismi che facilitano la formazione di questi biofilm. È sempre grazie al quorum sensing che i batteri regolano la produzione di enzimi idrolitici e che coordinano fra loro attività quali la loro mobilità e la colonizzazione di un substrato. Alla luce di queste considerazioni si è anche ipotizzato che siano proprio gli AHL a favorire e accentuare la sintesi enzimatica quando la carica microbica degli enterobatteri raggiunge valori soglia sufficienti, contribuendo alla comparsa di modificazioni sensoriali sgradevoli nelle carni fresche anche se la CMT non ha ancora raggiunto valori, diciamo così, esplosivi (Gram et al., 1999). In effetti, nella carne si può riscontrare la presenza evidente di AHL quando la carica ha appena raggiunto le 10 6 ufc/g, una concentrazione microbica che non è ancora sufficiente per parlare nelle carni di vera e propria putrefazione. Fra gli enterobatteri che formano una delle due principali componenti della flora microbica delle carni fresche confezionate sotto vuoto, predominano Hafnia alvei e Serratia spp. (Riddel e Korkeala, 1997). Sottoponendo a gascromatografia il surnatante di colture di ceppi di questi due batteri isolati dalle carni, Bruhn e coll. (2004) hanno dimostrato che fra tutti gli AHL presenti la molecola più abbondante era costituita dall OHHL, molecola citata più sopra. Anche Yersinia enterocolitica è in grado di sintetizzare degli acil-omoserina-lattoni come l OHHL e l N-esanoil omoserina-lattone, se fatta crescere in estratti di carne e anche di pesce (Medina-Martinez et al., 2006). Tutto ciò ha portato Hentzer e coll. (2003) a ipotizzare che in futuro si potrebbe aumentare la conservabilità delle carni e dei prodotti ittici freschi e confezionati sotto vuoto utilizzando particolari additivi conservanti che siano specificamente in grado di inibire la sintesi di AHL e che potrebbero essere definiti come inibitori del quorum sensing. Va però rimarcato che non tutti i ricercatori sono concordi con queste proposte; alcuni studiosi (Bruhn et al., 2004) fanno notare che il quorum sensing, pur essendo un fattore che favorisce lo scadimento sensoriale delle carni, non è e non può essere considerato la causa fondamentale della putrefazione delle carni fresche.

5 Dal punto di vista diagnostico, il rilevamento dei AHL nei substrati in cui si sospetta una parte attiva del quorum sensing nei processi degradativi può essere fatto con due tipi di controlli analitici: (a) prove biologiche che utilizzano vari ceppi batterici, in cui si punta a inattivare il gene luxi omologo responsabile della produzione degli AHL. Eliminato il gene suddetto in una certa popolazione batterica, è evidente che l espressione del gene sopra indicato diventerà possibile solo se nel substrato che si vuole esaminare si ha la presenza di altro AHL (b) vettori di plasmidi che rispondono all inattivazione degli omologhi LuxR, come è stato fatto in colture di E. coli. Grazie alla specificità di ciascun omologo del LuxR diventa possibile individuare le differenti molecole di AHL e di distinguerne il profilo di produzione. Con questi sistemi diagnostici, i brasiliani Pinto e coll. (2007) hanno condotto indagini sulla presenza dei principali mediatori chimici del quorum sensing, gli acil-omoserinalattoni, nelle flore microbiche Gram negative isolate dal latte crudo refrigerato. Già Liu e Griffiths (2003) avevano rimarcato che i difetti del latte crudo provocati da un eccessivo sviluppo di Pseudomonas fluorescens potevano essere correlabili alla capacità del batterio di produrre AHL e di sintetizzare proteasi extracellulari. I ricercatori brasiliani hanno studiato la liberazione di AHL da parte della flora microbica Gram negativa isolata da latte crudo. In totale hanno isolato e identificato 53 differenti ceppi di batteri dei generi Acinetobacter, Aeromonas, Burkholderia, Cedecea, Chryseomonas, Chryseobacterium, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Moraxella, Pantoea, Providencia, Pseudomonas, Rahnella e Serratia. Gli autori hanno evidenziato che quasi l 85% di tutti questi ceppi era in grado di produrre AHL e che, di conseguenza, fra i batteri Gram negativi responsabili delle alterazioni del latte crudo il quorum sensing gioca un ruolo di estrema importanza. 3. QUORUM SENSING DEI BATTERI GRAM POSITIVI I batteri Gram positivi mettono in atto il quorum sensing utilizzando molecole segnale e modalità differenti da quelle utilizzate dai Gram negativi. I Gram positivi sfruttano come molecola di trasmissione del segnale un oligopeptide di origine ribosomiale chiamato peptide autoinduttore (AIP o peptide feromone ). Il gene che codifica la sintesi di questa molecola messaggero, sovente è adiacente a un gene che codifica il sistema regolatore a due componenti (2CRS). I Gram positivi che si sono sinora rivelati in grado di produrre questo composto sono: Bacillus subtilis, Carnobacterium maltaromaticum e C. piscicola, Enterococcus faecalis, Lactobacillus plantarum e L. casei, Lactococcus lactis, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae. Mancano ancora dati certi sull esistenza di un quorum sensing in Listeria monocytogenes e nelle listeria in genere, anche se ciò è probabile. L insieme dei due geni associati prende nome di sistema regolatore a 3 componenti (3CRS). È opportuno ricordare che in tutti i batteri il sistema 2 CRS, formato da istidina-proteina-chinasi (HPK) di membrana e da un regolatore di risposta (RR), è il principale sistema di trasduzione di segnale attraverso la membrana cellulare. È grazie a questo sistema 2CRS che i batteri possono percepire le modificazioni di ph, concentrazioni di soluti, temperatura ecc. che intervengono nell ambiente in cui sono inseriti.

6 Nei batteri Gram negativi le molecole di AHL diffondono passivamente attraverso la membrana del batterio, fluendo dal suo interno all esterno; perché una seconda cellula riesca a captare questo messaggio, invece, bisogna che il mediatore chimico sia trasportato attivamente all interno della cellula, se si vuole ottenerne una reazione. Nel caso dei batteri Gram positivi, invece, il modello peptide-feromone non prevede quest ultima fase, proprio grazie al fatto che la proteine sensore vista prima è già collocata sulla faccia esterna della membrana. Il sistema 3CSR tiene sotto controllo e regola la manifestazione di alcuni aspetti fenotipici dei batteri Gram positivi: a) sintesi di batteriocine in Carnobacterium piscicola, Lactobacillus plantarum, L. casei ed Enterococcus faecium b) trasferimento di plasmidi mediante coniugazione in Enterococcus faecalis c) competenza genetica in Streptococcus pneumoniae e Bacillus subtilis d) espressione dei fattori di virulenza negli stafilococchi e) sporulazione di Bacillus subtilis f) formazione di biofilm g) risposte che i batteri mettono in atto contro gli stress subletali. Studiando le sequenze genomiche complete esistenti di Streptococcus thermophilus scopriamo che tutte comprendono i geni che codificano la sintesi del sistema 2CRS; ne desumiamo, quindi, che tutti i ceppi del batterio sono potenzialmente in grado di mettere in atto il quorum sensing (Hols et al., 2005). Autori giapponesi hanno segnalato, infine, che probabilmente nei batteri Gram positivi il quorum sensing funziona anche con altre molecole-segnale differenti dal sistema 3CRS, i gamma-butiro-lattoni. Il fatto non deve stupire perché queste molecole sono strutturalmente simili agli AHL dei Gram negativi e sembrano intervenire nello stimolare la produzione di antibiotici in Streptomyces (Takano et al., 2001). IN SINTESI Xavier e Bassler (2003) definiscono il quorum sensing «un processo di comunicazione tra cellule batteriche che comporta la sintesi, la liberazione e la captazione di molecole segnale extracellulari chiamate autoinduttori». un requisito essenziale perché il fenomeno si realizzi è il raggiungimento da parte della popolazione microbica di un valore soglia, perché si possa contare su una certa quantità minima di molecole antoinduttrici per trasmettere il segnale (Bassler, 2002). la scoperta dell esistenza del quorum sensing e le sempre maggiori conoscenze che si accumulano su questo argomento cominciano a rivoluzionare l approccio che i ricercatori hanno nello studio dei microrganismi. con le conoscenze del quorum sensing si cominciano a giustificare meglio comportamenti prima non ben spiegabili, come la sporulazione dei batteri sporigeni e altri aspetti di fisiologia microbica. il quorum sensing ci fa comprendere che le popolazioni microbiche non sono dei semplici aggregati più o meno caotici di microrganismi che vivono ciascuno per proprio conto, bensì una comunità coordinata al cui interno fluiscono costantemente informazioni che permettono alla comunità stessa di resistere alle condizioni avverse e di avvantaggiarsi per il loro fine. per altro verso, le conoscenze che si stanno accumulando sul quorum sensing microbico permetteranno all uomo di comprendere meglio i meccanismi di

7 colonizzazione microbica degli alimenti e dei loro processi alterativi. Le possibilità che si schiudono sono quelle di potere interferire, per via chimica, con il coordinamento delle società microbiche, scardinandolo o quanto meno disturbandolo. In questo modo si dovrebbe riuscire a tenere meglio sotto controllo le popolazioni microbiche, avendo come risultati ultimi un migliore livello di salubrità e igiene dei prodotti e un aumento della loro conservabilità commerciale. Riferimenti bibliografici 1. Adar Y.Y., Simaan M., Ulitzur S. (1992) Formation of the LuxR protein in the Vibrio fischeri lux system is controlled by HtpR through the GroESL proteins. J. Bacteriol., 174, Bassler B.L. (2002) Cell-Cell Communication In Bacteria. A promising new approach to improve bioleaching efficiency? In: Microbial processing of metal sulfides, , Springer Verlag, The Netherlands. 3. Bruhn J.B., Christensen A.B., Flodgaard L.R., Nielsen K.F., Larsen T.O., Givskov M., Gram L. (2004) Presence of acylated homoserine lactones (AHLs) and AHL-producing bacteria in meat and potential role of AHL in spoilage of meat. Appl. Environm. Microbiol., 70, Gobbetti M., De Angelis M., Di Cagno R., Minervini F., Limitine A. (2007) Cell cell communication in food related bacteria. Int. J. Food Microbiol., xx, xxx-xxx. 5. Gram L., Christensen A.B., RAvn L., Molin S., Givskov M. (1999) Production of acylated homoserine lactones by psychrotrophic members of the Enterobacteriaceae isolated from foods. Appl. Environm. Microbiol., 65, Hentzer M., Wu H., Andersen J.B., Riedel K., Rasmussen T.B., Bagge N., Kumar N., Schembri M.A., Song Z., Kristoffersen P., Maniefeld M., Costerton J.W., Molin S., Eberl L., Steinberg P., Kjelleberg S., Hoiby N., Givskov M. (2003) Attenuation of Pseudomonas aeruginosa virulence by quorum sensing inhibitors. EMBO Journal, 22, Hols P., Hancy F, Fontanine L., Grossiord B., Prozzi D., Leblond-Bourgert N., Decaris B., Bolotin A., Delborme C., Ehrlich S.D., Guèdon E., Monnet V., Renault P., Kleerebezem M. (2005) New insights in the molecular biology and physiology of Streptococcus thermophilus revealed by comparative genomics. FEMS Microbiol. Reviews, 29, Jay J.M., Vilai J.P., Hughes M.E. (2003) Profile and activity of the bacterial biota of ground beef held from freshness to spoilage at 5-7 C. Int. J. Food Microbiol., 81, Medina-Martinez M.S., Uyttaendaele M., Meireman S., Debevere J. (2006) Relevance of N- acyl-l-homoserine lactone procuction by Yersinia enterocolitica in fresh foods. J. Applied Microbiol., 100, Parsek M.R., Greenberg E.P. (2005) Sociomicrobiology: the connections between quorum sensing and biofilms. Trends in Microbiol., 13, Pinto U.M., de Souza Viana E., Lopes Martins M., Dantas Vanetti M.C. (2007) Detection of acylated homoserine lactones in gram-negative proteolytic psychrotrophic bacteria isolated from cooled raw milk. Food Control, 18, Riddel J., Korkeala H. (1997) Minimum growth temperature of Hafnia alvei and other Enterobacteriaceae isolated from refrigerated meat determined with a temperature gradient incubator. Int. J. Food Microbiol., 35, Takano E., Chakraburtti R., Nihira T., Yamada Y., Bibb M.J. (2001) A complex role for the gamma-butyro-lactone SCB1 in regulating antibiotic production in Streptomyces ceolicolor A3(2). Molecular Microbiol., 41, Whitehead N.A., Barnard A.M.L., Slater H., Simpson N.J.L., Salmond G.P.C. (2001) Quorumsensing in gram-negative bacteria. FEMS Microbiol. Rev., 25, Xavier K. B., Bassler B. L. (2003) LuxS quorum sensing: more than just a numbers game. Curr. Opin. Microbiol., 6, Zhu J., Chai Y., Zhong Z., Winans S.C. (2003) Agrobacterium bioassay strain for ultrasensitive detection of an N-acylhomoserine lactone-type quorum-sensing molecules: detection of autoinducers in Mesorhizobium huakuii. Appl. Environm. Microbiol. 69,