FASI SPERIMENTALI PRINCIPALI
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- Alice Pasquali
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1 FASI SPERIMENTALI PRINCIPALI 1: I dentificazione, isolamento e clonaggio gene codificante per proteina bersaglio ( BIOINFORMATICA) 2: espressione in sistema eterologo 3: purificazione e caratterizzazione proteina wild type (stabilità termodinamica e cinetica) ( FOLDING) 4: progettazione, produzione e caratterizzazione versioni mutate ( BIOINFORMATICA)
2 ISOLAMENTO DEL GENE ANALISI DI REPERTORI MOLECOLARI (gene o cdna) Isolamento per omologia (clone di topo per ottenere cdna umano) Genetica inversa (dalla proteina al gene) Isolamento in base alla posizione genomica (informazioni genetiche) Anticorpo (libreria di espressione) CLONAGGIO DIRETTO PCR (geni procariotici o cdna) SINTESI EX-NOVO Oligonucleotidi sintetici (geni di piccole dimensioni)
3 Le caratteristiche di una libreria di cloni ideale Completa Almeno un clone per mrna Ben classificabile Possibilità di formare sottogruppi Flessibile Cloni trasferibili in altri vettori velocemente Esprimibile I cloni devono essere completi e pronti per l inserzione di sequenze aggiuntive utili Ad alta qualità Tutti I cloni sequenziati Economicamente accessibile Disponibilità commerciale e informazioni mgc.nci.nih.gov
4 La completezza delle librerie è condizionata dalle dimensioni degli inserti N = [ln (1-P)]/[ln (1-f)] P probabilità di completezza N numero di cloni richiesti f proporzione di genoma nel singolo clone Genoma umano - plasmidi (max 5 Kb) P 99% f 5 kb/4,400,000 kb = 1.14 x 10-6 N = [ln.01]/[ln ] = -4.6/-1.14 x 10-7 = 40,350,877 cloni Batteriofagi (40kB)= 578, 616 cloni YACs(500kB) = 40,350 cloni
![Genoma umano - plasmidi (max 5 Kb) P 99% f 5 kb/4,400,000 kb = 1.14 x 10-6 N = [ln.01]/[ln 0.](/docs-images/43/5705592/images/page_4.jpg "99999886] = -4.6/-1.")
5 ISOLAMENTO PER OMOLOGIA Cloni su filtro Libreria di geni umani Sonda costruita su gene di topo Positivi sono omologhi al gene di topo
6 MOLTI METODI DI CLONAGGIO (e altro) SONO BASATI SULL USO DELLA PCR ATG TAA.e i primers? Si scrivono sempre 5 ->3 Primer sense (forward) = filamento codificante -> 5 -ATG -3 Primer antisense (reverse) = reverse complement -> 5 -TTA -3
7 PCR Primers: ALCUNE REGOLE DA RICORDARE Primer Length: Lunghezza ottimale bp. Assicura specificità e facilità di legame. 2. Melting Temperature: è la temperatura a cui la metà di un duplex si denatura dando un single strand. Tm= o C danno risultati ottimali; primers con Tm più elevate (>65 C) tendono a formare strutture secondarie. Formula per calcolo T m (rigorosa e basata su la valutazione per coppie di basi delle interazioni):
8 FORMULE SEMPLIFICATE 1. Più corti di 18 basi Tm= 4 C x (G +C) + 2 C x (A + T) 2. Più lunghi di 18 basi Tm = 64.9 C + 41 C x [(G+C) 16.4]/N 3. Tiene conto dell effetto dei sali (Primer 3 program e altri) T m = 81.5 C C x (log 10 [Na+] + [K+]) C x (%GC) 675/N 3. Calcolo del peso molecolare (accurato): MW = (329.2 * G) + (313.2 * A) + (304.2 * T) + (289.2 * C) Correzioni: -78 per il 5' phosphate group (PO 3 ) sostituito da un idrogeno (primers defosforilati) +17 per il 3 OH.
![6 C x (log 10 [Na+] + [K+]) + 0.41 C x (%GC) 675/N 3. Calcolo del peso molecolare (accurato): MW = (329.2 * G) + (313.](/docs-images/43/5705592/images/page_8.jpg "2 * A) + (304.2 * T) + (289.")
9 4.Primer annealing temperature : Stima della stabilità dell ibrido DNA-DNA. T a troppo elevata: primer-template hybridization insufficiente: resa bassa prodotto PCR. T a troppo bassa: prodotti aspecifici per la presenza di mismatches T a = 0.3 x T m (primer) T m (prodotto) 14.9 Dove T m (primer) = Melting Temperature dei primers T m (product) = Melting temperature del prodotto di PCR 5. GC Content : (numero di G e C nel primer come % basi totali) dovrebbe essere 40-60%. 6. GC Clamp : La presenza di basi G o C nelle ultime 5 basi al 3 dei primer ha un effetto positivo (meglio non più di tre). 7. Strutture secondarie : La presenza di strutture secondarie abbassa la resa in prodotto influenzando il processo di annealing primer-templato. Riduce la concentrazione effettiva dei primers. Hairpin : Intramolecolare nel primer. Sono tollerati: 3' -hairpin con DeltaG di -2 kcal/mol e hairpin interni con DeltaG di -3 kcal/mol Self Dimer : Intermolecolari tra primer omologhi. Sono tollerati: 3' - self dimer con DeltaG di -5 kcal/mol e self dimer interni con DeltaG di -6 kcal/mol. Cross Dimer : Intermolecolari tra primer senso e antisenso. Sono tollerati: 3' - cross dimer con DeltaG di -5 kcal/mol e cross dimer interni con DeltaG di -6 kcal/mol.
10 8. Repeats : ripetizioni consecutive di due nucleotidi: possono dare errori di innesco. Sono tollerati massimo 4 dinucleotidi 9. Runs : sequenze formate dallo stesso nucleotide: possono dare errori di innesco. Esempio: AGCGGGGGATGGGG. Sono tollerati runs di massimo 4 nucleotidi ' End Stability : è il valore massimo del deltag delle 5 basi al 3. Non dovrebbe essere molto negativo. 11. Evitare le zone in cui nel templato sono presenti strutture secondarie. 12. Evitare le regioni di cross-omologia tra geni presenti nella miscela di reazione. ACUNI SITI ONLINE PER IL DISEGNO DI PRIMERS PRIMER3
11 Cloning Sequencing Primer_List Primer_Check
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13 Differential Primers PCR primer design per: Gene-specific primers (per multi-gene families) -identificare specie o ceppi specifici -diagnostica molecolare Consensus primers amplificare geni appartenenti a una famiglia di geni BISOGNA LAVORARE SU ALLINEAMENTI MULTIPLI E TROVARE ZONE CONSERVATE O MENO (CONSENSUS O SPECIFICHE) Primer 3 at the MIT Whitehead Institute GeneFisher by Folker Meyer & Chris Schleiermacher at Bielefeld University, Germany
14 GENETICA INVERSA 1. La sequenza della proteina è nota e si può dedurre una sequenza genica (o proteine omologhe) NH 3+ -Met-Asp-Gly Trp-Ser-Lys-COO - 5 -ATG-GAT-GCT TGG-AGT-AAA-3 C C C G A TCT G C A G 2. Si possono progettare primers degenerati Forward primer: 5 -ATGGAT/CGCN-3 (sense) Reverse primer: 5 -T/CTTNC/GT/ACCA-3 (antisense) Note: T/C = miscela di T e C; N = miscela di 4 nucleotidi (anche dinosina) NB La degenerazione diminuisce la concentrazione effettiva del singolo primer (nell esempio: sense= 1/4x1/2=1/8 ; antisense= 1/4x(1/2) 3 =1/32) Evitare degenerazioni maggiori di 1/512..
15 3. Si amplifica il frammento di gene mediante PCR 4. Si analizza una libreria di cloni Cloni su filtro Libreria Sonda = frammento di PCR Positivi sono il gene umano di interesse
16 ISOLAMENTO DIRETTO DA MATERIALE GENETICO Fonti di materiale genetico di vario tipo Microrganismi, Virus vegetali, Linee cellulari animali ed umane SITO : PCR su stampi a sequenza nota (genomi caratterizzati) SINTESI EX-NOVO Oligonucleotidi sintetici (geni di piccole dimensioni) < 1.5 USD/bp (da 1800 USD espressione) < 1 euro/bp
17 Polimerasi ad alta fedeltà Taq polimerasi (dal termofilo Thermus aquaticus) = 94 kda con 2 attività catalitiche A) 5 3 DNA polymerase (50-60 nucleotidi/sec) B) 5 3 esonucleasi (rimuove nucleotidi al 5 ) Versioni ricombinanti di Taq Manca la attività 3 5 esonucleasi Frequenza di errore: 1 per 104 nucleotidi per un frammento di 400 bp amplificato per 106 volte (=20 cicli) : 33% mutati Polimerasi ad alta fedeltà (= con attività 3 5 esonucleasi) Riconosce se il nucleotide al 3 si appaia con il templato. A volte taglia anche i nucleotidi non appaiati al 3 del primer ( nibbling ) Aumento di fedeltà 5-12 volte Vent, DeepVent, Tli (Thermoccocus litoralis),pfu (Pyrococcus furiosus) Blunt ends invece che overhangs (Si può fare ultimo ciclo con Taq per TA cloning)
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19 I METODI DI CLONAGGIO SONO DI GRANDE IMPORTANZA SIA NELL ISOLAMENTO E PRODUZIONE DELLA PROTEINA WILD TYPE CHE NELLA PRODUZIONE DI MUTANTI -NECESSITA DI LAVORARE CON UN NUMERO ELEVATO DI CLONI IN TEMPI SPERIMENTALI RAGIONEVOLI SONO STATE SVILUPPATE NUOVE TECNOLOGIE DI CLONAGGIO RAPIDO
20 CLONAGGI: Approccio tradizionale (ligasi) Approccio per ricombinazione Strategia comune per clonare in vettori diversi Singola reazione di breve durata Alta resa (HTP) Efficienza quasi 100% No mutazioni SISTEMI GATEWAY E TOPO (Invitrogen)
21 Il sistema Gateway si basa sul processo di ricombinazione tra fago lambda ed E. coli Integrase (Int) Host Integration Factor (IHF) Int+IHF+ Excisionase (Xis)
22 Il principio Gateway: le reazioni LR e BP La LR clonasi comprende le attività Int, IHF e Xis (= excisione di lambda) Il costrutto di espressione: -ha selezione positiva (Ap r ) - non ha selezione negativa (ccdb) ccdb gene= gene killer: interferisce con l attività della DNA girasi causando morte cellulare (plasmide F con ccda=antidoto)
23 La procedura sperimentale è semplice
24 IL VETTORE DI INGRESSO PUO ESSERE COSTRUITO CON STRATEGIE DIVERSE 1. Restrizione e clonaggio in vettore Gateway attl 3. Libreria di clonaggio 4. Libreria di espressione 2. PCR con primers attb (>20-25 basi extra) e clonaggio in vettore Gateway attp
25 QUALSIASI VETTORE PUÒ DIVENTARE VETTORE DI DESTINAZIONE Deve essere replicato in un ceppo con una mutazione nella DNA girasi (gyra462) (DB3.1 )
26 I vettori di destinazione possono avere caratteristiche diverse a seconda dello scopo dell esperimento
27 e i tempi? 3 giorni: 6 prodotti di fusione e loro espressione
28 Il sistema TOPO si basa sulla attività della topoisomerasi I 1. Si lega covalentemente al gruppo fosfato di una sequenza specifica 2. Svolge il DNA 3. Riforma il legame covalente (attività = ligasi)
29 1 (TOPO) La topoisomerasi è covalentemente legata ad un gruppo fosfato presente alle estremità del vettore di clonaggio 2 (TOPO) L inserto ha una estremità 3 che si allinea al vettore 3 (TOPO) L enzima forma il legame covalente (attività = ligasi) e poi si stacca
30 Il metodo di clonaggio è molto veloce Il sistema TOPO può essere trasformato in sistema di clonaggio ad alta resa (High-Throughput,HT) se nella singola provetta sono presenti molte reazioni (es. 500)
31 I sistemi Gateway e TOPO possono essere combinati
32 I vantaggi di questi sistemi sono molteplici: 1. i tempi sperimentali si abbreviano
33 Si possono progettare esperimenti HTP (High-throughput)
34 E.coli expression screenings (1) Fully automated expression screening: 8 hours for 160 cultures Expression screening (normalized) with auto-inducing medium in 24 well plate followed by anti-his DotBlot and Ni affinity purification with 96-well filter plate reference scale 3 classes: -soluble -partially soluble -not soluble Freedom Tecan robot Total Soluble Total expression (mg/l of culture) for 1-4 ml cultures Soluble Fraction (mg/l of culture) No expression Soluble < 2mg/L No expression Soluble > 2mg/L Not Soluble No expression Soluble > 2mg/L No expression Soluble > 2mg/L Not Soluble Soluble < 2mg/L Soluble < 2mg/L No expression Not Soluble Not Soluble Soluble < 2mg/L Soluble < 2mg/L Not Soluble Soluble > 2mg/L Not Soluble Soluble < 2mg/L Soluble > 2mg/L Soluble < 2mg/L Soluble > 2mg/L Soluble > 2mg/L Soluble < 2mg/L Soluble < 2mg/L Not Soluble Soluble < 2mg/L Soluble > 2mg/L Soluble < 2mg/L Not Soluble Not Soluble Soluble < 2mg/L Soluble > 2mg/L Not Soluble Not Soluble Not Soluble Soluble < 2mg/L Soluble < 2mg/L Vincentelli R et al. (2005) Anal. Bioch
35 Si possono ottenere molteplici informazioni sulla stessa proteina 2 + X c L C Z Y A B A n c c p n c n Localizzazione Interazioni Saggio funz #1 Saggio funz #2 Saggio funz #3 Purificazione
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