LEZIONE IX SINTESI PROTEICA. Dott. Paolo Cascio

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1 LEZIONE IX SINTESI PROTEICA Dott. Paolo Cascio

2 L ESTREMITA 3 DEL trna SI LEA AD UN DETERMINATO AMINOACIDO CON UN LEAME COVALENTE AD ALTA ENERIA. IL PRODOTTO DI QUESTA REAZIONE E UNA MOLECOLA DI AMINOACILtRNA. LE MOLECOLE DI AMINOACIL-tRNA SONO SPESSO DETTE MOLECOLE DI trna CARICHE. IL TIPO SPECIFICO DI trna AMINOACILATO VIENE INDICATO CON UN PREFISSO: AD ESEMPIO ALANIL-tRNAALA. LI ENZIMI CHE CATALIZZANO L ATTACCO DELI AMINOACIDI ALLE SPECIE CORRISPONDENTI DI trna SONO DETTI AMINOACIL-tRNA- SINTETASI. POICHE ESISTONO 20 DIVERSI AMINOACIDI, IN CIASCUNA CELLULA SONO PRESENTI 20 DIVERSE AMINOACIL-tRNA-SINTETASI (NON DI PIU, NONOSTANTE CHE IL CODICE ENETICO SIA DEENERATO, PERCHE UNA SINTETASI E CAPACE DI RICONOSCERE LE DIVERSE MOLECOLE DI trna CHE SI LEANO ALLO STESSO AMINOACIDO trna isoaccettori ).

3 1 - UNO STESSO TRNA PUÒ RICONOSCERE PIÙ CODONI DIVERSI (CHE CODIFICANO PERÒ PER LO STESSO AMINOACIDO) ES: mrna trna ALA C I C U C C C A Codoni per l alanina

4 2 TRNA DIVERSI (CHE PORTANO PERÒ LO STESSO TIPO DI AMINOACIDO E CHE VENONO QUINDI RICONOSCIUTI DA UNA STESSA AMMINOACIL-TRNA SINTETASI) POSSONO LEARSI AD UN UNICO CODONE ES: trna HIS U I mrna trna HIS U A C A U Codone per l istidina trna HIS U N.B. LA COPPIA DI BASI -U È COMPATIBILE QUASI QUANTO LA COPPIA STANDARD -C

5 LE VARIE AMINOACIL-tRNA-SINTETASI PUR CATALIZZANDO TUTTE LO STESSO TIPO DI REAZIONE DIFFERISCONO NOTEVOLMENTE NELLA CONPOSIZIONE IN SUBUNITA E NEL PESO MOLECOLARE: ALCUNE SONO MONOMERI, ALTRE SONO ROSSI COMPLESSI MULTIMERICI FORMATI DA UN SOLO TIPO DI MONOMERO O DA PIU MONOMERI DIVERSI. LA REAZIONE COMPLESSIVA CATALIZZATA DA UNA AMINOACIL-tRNA- SINTETASI E : AMINOACIL- trna-sintetasi AMINOACIDO+tRNA+ATP AMINOACIL-tRNA+AMP+PP L AMINOACIDO VIENE LEATO AL trna TRAMITE UN LEAME ESTERE TRA IL PROPRIO RUPPO CARBOSSILICO E IL RUPPO OSSIDRILICO IN 2 O 3 DEL RIBOSIO CHE SI TROVA ALL ESTREMITA 3 DELLA MOLECOLA DI trna. QUESTA REAZIONE AVVIENE IN DUE FASI BEN SEPARATE. NELLA PRIMA FASE IL RUPPO CARBOSSILICO DELL AMINO-ACIDO SI ATTACCA AL FOSFORO IN α DELL ATP LIBERANDO UN PIROFOSFATO. IL PRODOTTO DI QUESTA REAZIONE E UN AMINOACILADENILATO CHE E

6 UNA MOLECOLA AD ALTA ENERIA (PER QUESTO MOTIVO SI DICE CHE SI ATTIVA L AMINOACIDO). L ENERIA NECESSARIA PER LA FORMAZIONE DELL AMINOACILADENILATO E FORNITA DALL IDROLISI DEL PIROFOSFATO. NELLA SECONDA FASE IL RUPPO AMINOACILICO DELL AMINOACIL- ADENILATO VIENE TRASFERITO AL RUPPO OSSIDRILICO 2 O 3 DEL RIBOSIO PRESENTE ALL ESTREMITA 3 DEL trna (QUALE DEI DUE OSSIDRILI VIENE UTILIZZATO DIPENDE DAL TIPO DI ENZIMA). UNA VOLTA CHE IL RESIDUO AMINOACILICO SI E LEATO AL RIBOSIO TERMINALE DEL trna ESSO SI SPOSTA SPONTANEAMENTE TRA LE POSIZIONI 2 E 3. DURANTE LA SINTESI PROTEICA, PERO, LI AMINOACIDI DEVONO TROVARSI NELLA POSIZIONE 3 PER POTER ESSERE TRASFERITI SULLA CATENA POLIPEPTIDICA IN ALLUNAMENTO. NELLA TRADUZIONE DEL MESSAIO ENETICO, IL RICONOSCIMENTO DI UN AMINOACIDO SPECIFICO E DI UNA MOLECOLA SPECIFICA DI trna DA PARTE DELL AMINOACIL-tRNA-SINTETASI E UNA FASE CRITICA. SE

7 QUESTO PROCESSO NON SI SVOLESSE IN MANIERA ACCURATA NELLA PROTEINA VERREBBERO INCORPORATI AMINOACIDI ERRATI. PER QUESTO MOTIVO LE AMINOACIL-tRNA-SINTETASI ATTACCANO LI AMINOACIDI ALLE CORRISPONDENTI MOLECOLE DI trna CON UNA NOTEVOLE SPECIFICITA. ONI AMINOACIL-tRNA-SINTETASI SELEZIONA IL PROPRIO SUBSTRATO AMINOACIDICO IN BASE ALLE DIMENSIONI E ALLA CARICA. SULLA SUPERFICIE DI ONI AMINOACIL-tRNA-SINTETASI E PRESENTE UNA TASCA DI LEAME CHE ACCOLIE IN MANIERA SPECIFICA UN SOLO TIPO DI AMINOACIDO. UNA PRIMA SELEZIONE VIENE OPERATA SULLA BASE DELLE DIMENSIONI DELI AMINOACIDI: AMINOACIDI TROPPO ROSSI RISPETTO ALLA TASCA NON POSSONO ESSERE ACCOLTI E VENONO COSI ESCLUSI PER MOTIVI STERICI. ANCHE AMINOACIDI TROPPO PICCOLI POSSONO PERO ESSERE SFAVORITI NELL INTERAIRE CON LA TASCA, PERCHE POSSONO STABILIRE MENO LEAMI DI VAN DER WAALS RISPETTO AD UN AMINOACIDO AVENTE LE IUSTE DIMENSIONI. AD ESEMPIO L ISOLEUCIL-tRNA-SINTETASI E 100 VOLTE PIU AFFINE PER L ISOLEUCINA CHE PER LA PIU PICCOLA VALINA.

8 LI AMINOACIDI VENONO POI SELEZIONATI IN BASE ALLA LORO CARICA E IDROFOBICITA. AD ESEMPIO LA TIROSIL trna-sintetasi LEA LA TIROSINA E NON LA FENILALANINA PERCHE LA TIROSINA HA UN OSSIDRILE CON IL QUALE L ENZIMA PUO FORMARE DEI PONTI H. LE AMINOACIL-tRNA-SINTETASI RICONOSCONO IN MANIERA ALTAMENTE SPECIFICA NON SOLO I DIVERSI AMINOACIDI, MA ANCHE LE DIVERSE MOLECOLE DI trna. QUESTO RICONOSCIMENTO E MEDIATO DALLA FORMAZIONE DI LEAMI SPECIFICI TRA L AMINOACIL-tRNA-SINTETASI E L ANSA DELL ANTICODONE DEL trna. ALTRE BASI IMPORTANTI PER IL RICONOSCIMENTO SI TROVANO SULLO STELO ACCETTORE. SINTESI PROTEICA NEI PROCARIOTI LA SINTESI PROTEICA PUO ESSERE DISTINTA IN TRE FASI: INIZIO, ALLUNAMENTO DELLA CATENA E FINE. L INIZIO COINCIDE CON LA DISSOCIAZIONE DEL RIBOSOMA 70S NELLE DUE SUBUNITA 30S E 50S. LA SUBUNITA 30S SI LEA QUINDI ALL mrna E LA SUBUNITA 50S SI RIASSOCIA A QUELLA 30S PER FORMARE UN RIBOSOMA 70S ATTIVO.

9 IL RIBOSOMA 70S ATTIVO RIMANE ASSOCIATO ALL mrna DURANTE TUTTA LA FASE DI ALLUNAMENTO DELLA CATENA. ALLA FINE DELLA SINTESI DELLA CATENA POLIPEPTIDICA IL RIBOSOMA 70S SI DISSOCIA NUOVAMENTE, SI SEPARA DALL mrna E LE DUE SUBUNITA 30S E 50S POSSONO RIFORMARE UN RIBOSOMA 70S INATTIVO. L AVVIO DELLA SINTESI PROTEICA RICHIEDE LA FORMAZIONE DI UN COMPLESSO D INIZIO 70S, FORMATO DALLE SUBUNITA 30S E 50S, DALL mrna E DA UN PARTICOLARE METIONIL-tRNA (trna INIZIATORE O trnai Met ). IL trna INIZIATORE VIENE RICONOSCIUTO DA UNA TRASFERASI CHE TRASFERISCE UN RUPPO FORMILICO ALLA METIONINA FORMANDO N-FORMIL METIONINA. PER QUESTO LA N- FORMILMETIONINA E IL PRIMO AMINOACIDO DI QUASI TUTTE LE PROTEINE BATTERICHE. IL COMPLESSO D INIZIO NON SI FORMA SPONTANEAMENTE, MA RICHIEDE L INTERVENTO DI 3 FATTORI D INIZIO: IF-1, IF-2 E IF-3. IF-3 SI LEA AL RIBOSOMA 70S E DETERMINA LA SEPARAZIONE DELLE DUE SUBUNITA 30S E 50S. IF-1 E IF-2 SI LEANO ALLA SUBUNITA 30S E COSI LEATA LA SUBUNITA 30S PUO LEARSI ALL fmet-trnai Met E ALL mrna.

10 PER ULTIMA SI LEA LA SUBUNITA 50S E SI FORMA COSI IL COMPLESSO D INIZIO ATTIVO. LA FORMAZIONE DEL COMPLESSO D INIZIO ATTIVO 70S RICHIEDE ENERIA CHE E FORNITA DALL IDROLISI DEL TP LEATO A IF-2. IL CORRETTO POSIZIONAMENTO DEL RIBOSOMA IN PROSSIMITA DEL CODONE D INIZIO AU E RESO POSSIBILE DALL APPAIAMENTO TRA UNA SERIE DI TRE-NOVE PURINE DELL mrna LOCALIZZATE A CIRCA 10 NUCLEOTIDI DALL ESTREMITA 5 DEL CODONE D INIZIO (SEQUENZA DI SHINE-DELARNO) E UNA SEQUENZA DI PIRIMIDINE PRESENTI NELL rrna 16S DEL RIBOSOMA. L APPAIAMENTO DI QUESTI NUCLEOTIDI COMPLEMENTARI PERMETTE IL POSIZIONAMENTO DEL RIBOSOMA NELLA POSIZIONE CORRETTA PER POTER INIZIARE LA SINTESI PROTEICA. LI mrna POLICISTRONICI CONTENONO VARIE SEQUENZE DI SHINE- DALARNO (UNA PER ONI PROTEINA) A LIVELLO DELLE QUALI SI ASSOCIA IL COMPLESSO D INIZIO 70S E INIZIA LA TRADUZIONE DI CIASCUNA PROTEINA

11 L ALLUNAMENTO DI UNA CATENA PROTEICA AVVIENE MEDIANTE UN MINICICLO RIPETUTO DI TRE FASI NEL CORSO DEL QUALE ONI ULTERIORE AMINOACIDO VIENE AIUNTO ALLA CATENA POLIPEPTIDICA NASCENTE. LE TRE FASI DI QUESTO CICLO SONO: 1) POSIZIONAMENTO SUL COMPLESSO RIBOSOMIALE DELL AMINOACIL-tRNA APPROPRIATO 2) FORMAZIONE DEL LEAME PEPTIDICO 3) SPOSTAMENTO DEL RIBOSOMA DI UN CODONE RISPETTO ALL mrna IL RIBOSOMA CONTIENE UN SITO ATTIVO PER LA FORMAZIONE DI UN LEAME PEPTIDICO E DUE SITI CHE LEANO I SUBSTRATI NECESSARI PER LA REAZIONE (SITO PEPTIDILICO E SITO ACCETTORE). IL SITO PEPTIDILICO (O SITO P) TRATTIENE LA CATENA POLIPEPTIDICA IN FASE DI ALLUNAMENTO ANCORA ATTACCATA MEDIANTE UN LEAME AMINOACILICO AL trna DELL ULTIMO AMINOACIDO AIUNTO. IL SITO ACCETTORE (SITO A) LEA L AMINOACIL-tRNA DEL SUCCESSIVO AMINOACIDO CHE DEVE ESSERE AIUNTO ALLA CATENA. LI ANTICODONI DEI trna IN AMBEDURE I SITI, P E A, FORMANO LEAMI IDROENO CON I CODONI DELL mrna.

12 ALL INIZIO DEL CICLO IL SITO A E VUOTO MENTRE IL SITO P E OCCUPATO DAL trna DELL ULTIMO AMINOACIDO AIUNTO ALLA CATENA. QUESTO trna (DETTO PEPTIDIL-tRNA) E LEATO ALLA CATENA POLIPEPTIDICA NASCENTE. IL trna DELL AMINOACIDO SUCCESSIVO SI LEA INNANZITUTTO CON IL FATTORE DI ALLUNAMENTO EF-TU. EF-TU E UN MONOMERO CON UN SITO DI LEAME PER IL TP. EF-TU:TP-AMINOACIL-tRNA FORMANO UN COMPLESSO TERNARIO CHE SI ADATTA AL SITO A DEL RIBOSOMA. EF-TU RICONOSCE LA STRUTTURA DELLO STELO ACCETTORE DEL trna (LEA TUTTI LI AMINOACIL-tRNA ECCETTO L N-FORMILMETIONILtRNAi Met ). UNA DELLE FUNZIONI DI EF-TU:TP E LA STABILIZZAZIONE DEL LEAME ESTERE NELLA POSIZIONE 3 DELL AMINOACIL-tRNA. SE L APPAIAMENTO TRA L ANTICODONE DELL AMINOACIL-tRNA DEL COMPLESSO TERNARIO E IL CODONE CHE SI TROVA NEL SITO A E CORRETTO, SI HA L IDROLISI DEL TP IN DP+Pi AD OPERA DI DUE PROTEINE RIBOSOMIALI (L7 E L12).

13 LA COMPONENTE PEPTIDILTRANSFERASICA DELLA SUBUNITA 50S DEL RIBOSOMA CATALIZZA IL TRASFERIMENTO DEL RUPPO PEPTIDILICO DAL PEPTIDIL-tRNA CHE SI TROVA NEL SITO P AL RUPPO AMINICO DELLA MOLECOLA DI AMINOACIL-tRNA CHE SI TRIVA NEL SITO A, ALLUNANDO COSI LA CATENA PEPTIDICA DI UN RESIDUO. LA MOLECOLA DI trna DEAMINOACILATA VIENE ESPULSA DAL SITO P. IL PEPTIDIL-tRNA APPENA SINTETIZZATO SI SPOSTA DAL SITO A AL SITO P MENTRE IL RIBOSOMA SI SPOSTA VERSO IL CODONE SUCCESSIVO. UNA NUOVA MOLECOLA DI AMINOACIL-tRNA OCCUPA IL SITO A VACANTE E IL CICLO PUO COSI RICOMINCIARE. IL RUPPO AMINICO LIBERO DELL AMINOACIL-tRNA FORMA UN LEAME PEPTIDICO CON IL CARBONIO CARBONILICO DELLA CATENA PEPTIDICA NASCENTE. L ATTIVITA PEPTIDILTRANSFERASICA, RESPONSABILE DELLA FORMAZIONE DEL LEAME PEPTIDICO, E LOCALIZZATA SU ALMENO 5 PROTEINE DELLA SUBUNITA 50S DEL RIBOSOMA E SULL rrna 23S. L ENERIA NECESSARIA ALLA FORMAZIONE DEL LEAME PEPTIDICO VIENE FORNITA DALL IDROLISI DEL LEAME ESTERE AD ALTO

14 CONTENUTO DI ENERIA TRA LA CATENA PEPTIDICA NASCENTE E L OH IN 3 DEL RIBOSIO DEL trna. LO SCORRIMENTO DEL RIBOSOMA DI UN CODONE IN DIREZIONE 3 (IN CONCOMITANZA CON L ESPULSIONE DEL trna DEAMINOACILATO E CON LO SPOSTAMENTO DEL PEPTIDIL-tRNA DAL SITO A AL SITO P) PRENDE IL NOME DI TRASLOCAZIONE. LA TRASLOCAZIONE RICHIEDE L INTERVENTO DI UNA PROTEINA CHIAMATA EF- CHE LEA ANCH ESSA IL TP. L IDROLISI DI QUESTO TP PERMETTE A EF- DI OPERARE L ESPULSIONE DEL trna DEAMINOACILATO E LO SPOSTAMENTO DEL PEPTIDIL-tRNA DAL SITO A AL SITO P. TRE FATTORI DI RILASCIO, RF-1, RF-2 E RF-3 PARTECIPANO ALLA CONCLUSIONE DELLA SINTESI PROTEICA. QUANDO NEL SITO A VIENE A TROVARSI UNO DEI TRE CODONI DI STOP (UA, UA, UAA) LA SINTESI PROTEICA HA TERMINE. INFATTI IL SITO A NON PUO ESSERE OCCUPATO DA NESSUN AMINOACIL-tRNA (NON ESISTONO ANTICODONI COMPLEMENTARI PER I 3 CODONI DI STOP) MA VIENE OCCUPATO DAI FATTORI DI RILASCIO: RF-1 RICONOSCE UAA E UA RF-2 RICONOSCE UAA E UA

15 RF-3 SI LEA CON IL TP E SI ASSOCIA, POI, CON RF-1 O RF-2 I COMPLESSI RF-3:TP-RF-1 E RF-3:TP-RF-2 ALTERANO L ATTIVITA DELLA PEPTIDILTRANSFERASI DEL RIBOSOMA, FACENDOLE IDROLIZZARE IL LEAME ESTERE DEL PEPTIDIL-tRNA. IL POLIPEPTIDE VIENE COSI RILASCIATO NEL CITOPLASMA. SINTESI PROTEICA NELI EUCARIOTI LE TRE FASI DELLA SINTESI PROTEICA (INIZIO, ALLUNAMENTO DELLA CATENA E FINE) SONO SIMILI NEI PROCARIOTI E NELI EUCARIOTI. LE DIFFERENZA PIU MARCATE SI HANNO NELLA FASE D INIZIO, PERCHE L mrna EUCARIOTICO PRESENTA ALL ESTREMITA 5 IL CAPPUCCIO DI 7-METILUANINA. INOLTRE NELI EUCARIOTI L mrna FORMA STRUTTURE SECONDARIE ESTESE CHE VENONO, POI, RICOPERTE DA SVARIATE PROTEINE. VARI FATTORI D INIZIO RIMUOVONO QUESTE PROTEINE E PERMETTONO COSI L INIZIO DELLA TRADUZIONE. LA MAIOR PARTE DELI mrna EUCARIOTICI HANNO UN UNICO SITO D INIZIO SITUATO VICINO AL CAPPUCCIO DI 7-METIL-UANOSINA. L INTERAZIONE DELLA SUBUNITA MINORE DEL RIBOSOMA CON IL CAPPUCCIO DI 7m RICHIEDE UN RUPPO DI PROTEINE CHIAMATE eif4

16 DOPO AVER RICONOSCIUTO IL CAPPUCCIO 7m (RAZIE A Eif4F) LA SUBUNITA MINORE DEL RIBOSOMA COMINCIA A SCORRERE LUNO L mrna FINO A RAIUNERE IL CODONE D INIZIO AU (SITUATO A NON PIU DI CIRCA 100 NUCLEOTIDI DAL CAPPUCCIO 7m). IL RICONOSCIMENTO DEL CODONE D INIZIO VIENE FACILITATO DA SEQUENZE SPECIFICHE AD ESSO VICINE: SEQUENZE DI KOZAK. A QUESTO PUNTO ARRIVANO IL Met-tRNAi Met E LA SUBUNITA RIBOSOMIALE MAIORE E LA TRADUZIONE PUO COSI COMINCIARE. QUESTO MECCANISMO D INIZIO IMPEDISCE AL RIBOSOMA DI RICONOSCERE CODONI AU ALL INTERNO DELL mrna. PERCIO TUTTE LE MOLECOLE DI mrna NELI EUCARIOTI CODIFICANO PER UN SOLO POLIPEPTIDE E SONO DEFINITE MONOCISTRONICHE. TUTTAVIA ALCUNI mrna VIRALI, CHE VENONO TRADOTTI DALL APPARATO DELLE CELLULE EUCARIOTICHE INFETTE, SONO PRIVI DI CAPPUCCIO DI 7m. IN QUESTI CASI LA TRADUZIONE VIENE INIZIATA A LIVELLO DI SITI INTERNI PER L INRESSO DEI RIBOSOMI (IRES, INTERNAL RIBOSOME ENTRY SITES) CON UN MECCANISMO NON ANCORA BEN CHIARO.

17 COSTO ENERETICO DELLA SINTESI PROTEICA PER ONI AMINOACIDO AIUNTO ALLA CATENA POLIPEPTIDICA VENONO SCISSI 4 LEAMI FOSFODIESTERE AD ALTA ENERIA: ATP AMP + PP P + P (SINTESI AMINOACIL-tRNA) TP MP + PP (EF-TU) TP MP + PP (EF-) COSTO ENERETICO MOLTO ELEVATO: IN E. COLI LA SINTESI PROTEICA UTILIZZA DAL 30 AL 50% DELL ATP TOTALE LA VELOCITA DI SINTESI DI UNA PROTEINA E DI CIRCA 3-5 AMINOACIDI ADDIZIONATI AL SECONDO. PICCOLE PROTEINE DI AMINOACIDI VENONO SINTETIZZATE IN CIRCA UN MINUTO. LA SINTESI DELLA PROTEINA PIU RANDE ATTUALMENTE NOTA, LA TITINA FORMATA DA AMINOACIDI, RICHIEDE 2-3 ORE.