FISIOPATOLOGIA (Prof. Condorelli)

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1 FISIOPATOLOGIA (Prof. Condorelli) LA CELLULA E IL DNA La cellula La cellula è la più piccola struttura ad essere classificabile come vivente; nel corpo umano è possibile individuare più di 200 tipi cellulari distinti, ma aventi tutti la stessa struttura di base, ossia tutte le cellule hanno lo stesso patrimonio genetico che risiede nel DNA. Tutte le cellule sono rivestite da membrana cellulare che ha la funzione di proteggere la cellula ed isolarla dall ambiente esterno. Si distinguono due tipi di cellule: CELLULE EUCARIOTE (protisti, animali funghi e piante) e CELLULE PROCARIOTE (batteri). CELLULE EUCARIOTE NUCLEO BEN DEFINITO, nel quale è contenuto la maggior parte del materiale genetico, il DNA; Il CITOPLASMA contiene una grande quantità di canali, filamenti e corpiccioli detti ORGANULI CELLULARI (si interessano della respirazione, formazione delle proteine e digestione sostanze alimentari); MEMBRANA PLASMATICA a doppio strato lipidico; CELLULE PROCARIOTE PRIVE DI NUCLEO, il DNA è sparso nel citoplasma in una zona detta zona NUCLEARE o NUCLEOIDE; Il CITOPLASMA è privo di nucleo e contiene principalmente DNA e ribosomi; MEMBRANA PLASMATICA TIPICA; Alcuni procarioti possiedono estroflessioni: quelle corte (pili) aiutano i microorganismi ad aderire alla superficie, mentre quelle lunghe (flagelli) permettono alla cellula di muoversi nei liquidi; HANNO ENTRAMBE IL DNA COME MATERIALE GENETICO, SONO CIRCONDATE DA MEMBRANA ESTERNA ED I RIBOSOMI, CHE HANNO LA FUNZIONE DI PRODURRE PROTEINE Il DNA (Acido deossiribonucleico) Il DNA è un acido nucleico che contiene le informazioni genetiche necessarie alla biosintesi di RNA e proteine (molecole necessarie per lo sviluppo e il corretto funzionamento della maggior parte degli organismi viventi). Dal punto di vista chimico, il DNA è un polimero organico costituito da monomeri, chiamati NUCLEOTIDI, costituiti da uno zucchero a 5 atomi di carbonio al quale sono legati le basi azotate ed un gruppo fosfato che permette il legame tra due nucleotidi. Lo zucchero che compone il DNA è IL deossiribosio. Le basi azotate del DNA SONO quattro: ADENINA, GUANINA, CITOSINA e TIMINA. Esse sono in grado di formare legami idrogeno e di associarsi tra loro in modo reversibile. Inoltre

2 esse possono distinguersi in PURINE (adenina e guanina) e PIRIMIDINE (citosina e timina). Le prime risultano essere più piccole rispetto alle seconde La molecola di DNA è a doppio filamento e forma una struttura a spirale definita a doppia elica. Tale struttura è dovuta ai legami obbligati tra le basi azotate, difatti l adenina si lega con la timina e la guanina si accoppia con la citosina. Nella doppia elica il senso di un filamento è opposto al filamento complementare. Per tale motivo i due filamenti sono ANTIPARALLELI. Nella struttura a doppia elica si può vedere una struttura esterna rappresentata dallo zucchero ed una parte interna costituita dalle basi. I due filamenti sono denominati in modo differente, 5-3 ed il suo complementare 3-5. I primi studi sulla struttura del DNA sono stati condotti da Rosalind Franklin, anche se il premio Nobel per la medicina fu dato a Watson e Crick che arrivarono a descrivere la doppia elica nel 1954 tramite la cristallografia a raggi-x. Il DNA può andare incontro ad una separazione reversibile dei due filamenti. Se la struttura originaria (STATO NATIVO) viene sottoposta ad una temperatura molto elevata ( 90 C) i due filamenti possono separarsi (DENATURAZIONE) e successivamente il DNA si può riavvolgere a formare nuovamente la struttura a doppia elica (RINATURAZIONE) grazie alla complementarietà dei legami tra le basi azotate. Differenza DNA/RNA DNA (acido deossiribonucleico) Struttura a doppio filamento ZUCCHERO: DEOSSIRIBOSIO BASI AZOTATE: adenina timina citosina guanina RNA (acido ribonucleico) Struttura singolo filamento ZUCCHERO: RIBOSIO BASI AZOTATE: adenina uracile citosina guanina Disposizione DNA Nel nucleo di ciascuna cellula il DNA viene complessato con proteine dette ISTONI (il complesso DNA-PROTEINE viene chiamato CROMATINA) ed è organizzato in strutture definite CROMOSOMI. In particolare, la doppia elica si avvolge agli istoni con cui forma il NUCLEOSOMA. Esso è composto da un ottamero di istoni e 146 basi di DNA avvolti 1.75 volte intorno alla struttura centrale; gli istoni

3 sono piccole proteine che contengono molti aminoacidi a carica positiva che possono ben riconoscere il DNA che possiede carica negativa. I nucleosomi a loro volta si comprimono per dare vita alla cromatina ottenendo infine il cromosoma. I cromosomi sono costituiti da una regione centrale, detta CENTROMERO, che li divide in due sezioni dette BRACCIA: Braccio corto, p; Braccio lungo, q; La parte terminale del cromosoma viene detto TELOMERO. Un cromosoma umano medio contiene un doppio filamento di DNA lungo 8cm: le cellule utilizzano meccanismi molto sofisticati per riuscire a comprimere tutto il loro DNA nell esiguo spazio del volume nucleare. Nelle cellule eucariotiche i cromosomi sono localizzati nel nucleo, mentre nelle cellule procariotiche si trovano in una regione detta NUCLEOIDE. I cromosomi eucariotici sono formati da cromatina, un complesso di DNA e proteine che si condensa durante la divisione cellulare. Le cellule somatiche hanno due serie di cromosomi (patrimonio genetico diploide), mentre i gameti o cellule germinali hanno un unica serie di cromosomi (patrimonio genetico aploide). Ognuno di noi possiede 46 cromosomi: 22 coppie di autosomi e 2 cromosomi sessuali (XY per l uomo e XX per la donna). Quindi ogni persona ha due copie di ciascun gene, chiamate ALLELI: ogni cromosoma è costituito da due strutture, chiamate CROMATIDI FRATELLI: ogni cromosoma (o UNITA CROMOSOMIALE) è pertanto un duplicato, perché una copia deriva dal padre e una dalla madre. Anomalie di cromosomi possono caratterizzare alcune patologie come il cancro. Il CARIOTIPO è l insieme delle caratteristiche dei cromosomi nella cellula, quindi l analisi del cariotipo è un analisi del patrimonio genetico che viene fatta per esempio nella diagnosi prenatale per osservare l eventuale presenza di anomalie genetiche nel numero o nella struttura dei cromosomi. Il progetto genoma umano è stato un progetto di ricerca scientifica internazionale il cui obiettivo principale era quello di determinare la sequenza delle coppie di basi azotate che formano il DNA e di identificare e mappare i geni del genoma umano. Il GENOMA è la totalità aploide del DNA contenuta in una cellula di un organismo ed è lo stesso per il 99,9% delle persone, mentre l ultimo 2% è costituito dai geni. Gli umani possiedono circa geni, di cui per la maggior parte la funzione è sconosciuta. I Geni Il gene è l unità funzionale dell ereditarietà ed è costituita da DNA e contiene informazioni per formare proteine, l insieme di tutti i geni di un organismo viene detto GENOTIPO, mentre l insieme delle caratteristiche esterne e visibili dell organismo determinate dall associazione del genotipo con l ambiente è detto FENOTIPO. I geni umani sono molto simili a quelli di altre specie come topo, larva, etc. l unicità di una specie non è imputabile ai geni in sé, ma a come gli stessi geni sono regolati e organizzati nel genoma (DNA codificante). Alcuni geni si sono conservati durante l evoluzione, difatti nell uomo circa il 74% dei geni è presente anche in organismi semplici: ciò è di grande importanza perché questi organismi sono utilizzati in laboratorio per lo studio di diverse patologie riguardanti l uomo.

4 Concretamente il gene è costituito da una sequenza di DNA e tale sequenza è caratterizzata da: REGIONE CODIFICANTE (sequenza coding) che prende il nome di ESONE e da luogo alle proteine; difatti essa contiene le basi nucleotidiche che codificano per il prodotto proteico; REGIONE PROMOTORE posta in corrispondenza dell estremità 5 ed è fondamentale per il controllo dell espressione del gene: essa viene riconosciuta da alcuni fattori trascrizionali e rappresenta il sito di inizio della trascrizione ; REGIONE NON CODIFICANTE (sequenza non coding) avente funzione strutturale e regolatoria e viene chiamata INTRONE. Essa può essere presente tra un esone ed un altro e non solo alle estremità; REGIONE TERMINATORE presente sull estremità 3 del gene. Le proteine sono parte importante dei tessuti, pertanto bisogna vedere come l informazione contenuta nel DNA si trasforma in proteina dando la possibilità al tessuto di strutturarsi (il tessuto si organizza per formare un organo che va, pian piano, a costituire un apparato e tutto insieme costituisce l organismo). Ciò avviene attraverso due processi: TRASCRIZIONE e TRADUZIONE. DNA RNA PROTEINE Trascrizione (nel nucleo) Traduzione (nei ribosomi) La trascrizione È il fenomeno attraverso il quale l informazione genetica contenuta nel DNA viene trasferita nell RNA messaggero (mrna) ed avviene nel nucleo. Attraverso tale processo si ottengono diversi tipi di RNA: mrna (RNA messaggero): è il prodotto della trascrizione rrna (RNA ribosomiale): forma insieme ad altre proteine i ribosomi trna (RNA transfer): trasporta sui ribosomi uno specifico aminoacido Si tratta dunque di un processo di replicazione del DNA: tutto il DNA viene replicato, sia la regione intronica che esonica. Affinché L mrna venga tradotto in proteina sono necessarie modificazioni, in particolare le regioni introniche devono essere eliminare per dare vita all mrna maturo. Durante questo processo la doppia elica si separa e soltanto uno dei filamenti funge da stampo, quello 3-5, la cui regione promotore viene riconosciuta dal particolare enzima che interviene durante la trascrizione, l RNA-polimerasi: L mrna ottenuto sarà identico al filamento da codificare, cambierà solo per una base azotata (la timina viene sostituita con l uracile).

5 Nel processo della trascrizione possiamo distinguere tre fasi: INIZIO, ELONGAZIONE TERMINAZIONE. e INIZIO: proteine chiamate fattori di trascrizione si legano al promotore di un gene. Questa regione è fondamentale poiché ci fornisce il segnale di inizio di trascrizione ed il segnale di legame ad alcuni fattori, detti FATTORI TRASCRIZIONALI, che determinano l aumento della trascrizione di un gene particolare. I fattori trascrizionali determinano come un gene deve essere acceso o spento, fenomeno importante per il differenziamento e lo sviluppo dei tessuti sia qualitativamente che quantitativamente nel nostro organismo. Si dice quindi che i fattori trascrizionali sono TESSUTI-SPECIFICI, perché le cellule possiedono tutte lo stesso DNA, ma diversi fattori trascrizionali. In seguito l RNA-polimerasi lega il DNA nel sito di inizio individuato e inizia così la polimerizzazione dell RNA. ELONGAZIONE: l RNA-polimerasi scorre lungo tutta la sequenza facendo procedere il processo di polimerizzazione. TERMINAZIONE: si ha nel momento in cui l RNA-polimerasi incontra il segnale di stop. La molecola di RNA così ottenuta è ancora immatura e non può essere ancora utilizzata per la fase successiva di traduzione. L espressione dei geni può cambiare durante processi fisiologici e patologici di una cellula infatti può accadere che in una cellula tumorale sia espresso un gene, che risulta essere spento in una cellula sana. Analizziamo ora il passaggio da RNA immaturo a RNA maturo; l RNA ancora immaturo è costituito da sequenze codificanti e non codificanti e prima di lasciare il nucleo deve subire delle modificazioni per andare poi nel citosol, infatti devono essere eliminate le regioni introniche e devono essere aggiunte delle sequenze terminali in corrispondenza delle estremità 5 e 3 denominate CAP e TAIL. Il processo di maturazione prevede tre tappe: CAPPING, POLI-ADENILAZIONE e SPLICING. CAPPING: consiste nell aggiunta di un cappuccio di 7-metil guanosina all estremità 5. Quest operazione serve a proteggere la degradazione dell RNA e a favorirne la traduzione, rendendo così l RNA più stabile (CAP) POLI ADENILAZIONE: consiste nell aggiunta di una sequenza poliadenilica di circa 200 nucleotidi (poli A) all estremità 3. Quest operazione serve ad inibire l attività della nucleasi che degrada l RNA e quindi a favorire il processo di traduzione SPLICING: processo durante il quale gli introni sono rimossi e gli esoni vengono uniti. Lo splicing riguarda regioni specifiche di RNA e avviene tramite particolari enzimi di riconoscimento che riconoscono il confine tra esone ed introne, effettuano il taglio e cuci, unendo così le regioni coding adiacenti. Si ottiene così l mrna maturo che deve lasciare il nucleo e riversarsi nel citosol per poter andare incontro al processo di traduzione.

6 La traduzione La traduzione, detta anche SINTESI PROTEICA, è il processo attraverso il quale l informazione genetica contenuta nell mrna viene convertita in proteine. È un processo che avviene in particolari organelli cellulari, i RIBOSOMI, presenti su un complesso sistema di membrane, il RETICOLO ENDOPLASMATICO RUGOSO. Il reticolo endoplasmatico è costituito da una serie di membrane ripiegate l una sull altra a formare tubuli e sacchetti che hanno il compito di raccogliere le proteine sintetizzate dai ribosomi. Si differenziano due regioni del reticolo endoplasmatico: reticolo endoplasmatico ruvido, sulla cui superficie sono contenuti i ribosomi, e reticolo endoplasmatico liscio, privo di ribosomi e maggiormente impegnato ad operare modificazioni post-traduzionali sulle proteine. L l informazione contenuta nell mrna è utilizzata per la produzione delle proteine: il processo viene appunto chiamato traduzione in quanto l informazione viene convertita da una serie di basi nucleotidiche ad una serie di triplette, chiamate CODONI. Una tripletta di basi, il codone, corrisponde ad un AMINOACIDO. Quindi, dalla loro posizione dipenderà l ordine in cui saranno disposti gli aminoacidi e il loro prodotto proteico finale. Le basi dell RNA sono quattro: adenia, guanina, citosina e uracile per cui esistono 4 3 =64 codoni possibili, che definiscono il CODICE GENETICO. Pertanto in natura esistono soltanto 20 aminoacidi e questo vuol dire che un aminoacido può essere codificato da più codoni. Si definisce così il CODICE GENETICO DEGENERATO in cui 61 codoni rappresentano i 20 aminoacidi, mentre i tre codoni restanti (UAA, UAG e UGA) codificano segnali di stop (stabiliscono a che punto deve interrompersi l assemblamento della catena polipeptidica). I codoni distinti che codificano il medesimo aminoacido vengono detti SINONIMI. La traduzione negli eucarioti ha inizio sempre dallo stesso codone (AUG), che codifica la METIONINA, quindi le catene polipeptidiche hanno in prima posizione la metionina. Il RIBOSOMA è la macchina esecutrice della sintesi proteica: esso è costituito da due subunità, una più piccola e una più grande, che contengono RNA ribosomiale (rrna e proteine). La subunità minore funge da sostegno e da sito di ingresso dell mrna da tradurre, cioè si lega con l mrna per fare da guida durante la sintesi proteica, e possiede un sito di attacco per l mrna. La subunità maggiore è la principale macchina catalizzata del complesso costituita da 3 siti di attacco per il trna (RNA transfer): - SITO A: accoglie i codoni dei singoli aminoacidi - SITO P: si forma il legame peptidico - SITO E: avviene il rilascio del trna Il trna è un ulteriore tipo di RNA, indispensabile per la sintesi proteica. Esso ha una struttura a croce, infatti ha 4 sporgenze di cui due sono le più importanti. Un estremità possiede l ANTICODONE, costituito dalla tripletta di basi complementari a quelle del codone da riconoscere. L altra estremità possiede il sito di attacco per l aminoacido corrispondente all anticodone presente sull estremità opposta (es. codone GCG > anticodone CGC). Vi sono tanti trna quanti sono i codoni e quanti sono gli aminoacidi. Ad ogni anticodone (e quindi ad ogni codone) corrisponde un aminoacido che viene caricato all altra estremità del trna grazie ad

7 un enzima attivante specifico per quell aminoacido e quel codone. Le fasi della traduzione sono tre: INIZIO, ALLUNGAMENTO e TERMINE DELLA TRADUZIONE. INIZIO: si forma il complesso costituito da: - Subunità minore del ribosoma - mrna (codone AUG) - trna di inizio (con anticodone UAC e metionina) - sito P della subunità maggiore del ribosoma ALLUNGAMENTO: consiste in: - Arrivo del trna (contenente l anticodone specifico per il secondo codone) nel sito A; - Allungamento della catena polipeptidica e legame covalente tra gli aminoacidi; - Rilascio trna di inizio nel sito E; - Il secondo trna legato a dipeptide scivola nel sito P. TERMINE DELLA TRADUZIONE: il processo termina quando si arriva ad un codone di stop e giunge nel sito A un fattore di rilascio, che idrolizza il legame tra l ultimo trna e il polipeptide appena formato. Le proteine Le proteine sono grandi biomolecole costituite da aminoacidi legati l un l altro da un legame peptidico. Esse svolgono una vasta gamma di funzioni all interno degli organismi viventi. Le proteine differiscono l un l altra in base alla loro sequenza di aminoacidi, dettata dalla sequenza nucleotidica conservata nei geni e che solitamente si traduce in un ripiegamento proteico in una struttura tridimensionale specifica che determina la sua attività. I costituenti essenziali delle proteine sono gli aminoacidi, di cui si riconoscono 20 tipi differenti che vanno a formare catene polipeptidiche di diversa lunghezza. Gli aminoacidi, pur essendo diversi, hanno una struttura simile: si riconoscono un GRUPPO AMMINICO e un GRUPPO CARBOSSILICO che sono legati ad un atomo di carbonio centrale, e poi delle catene laterali (R) sempre connessi all atomo di carbonio centrale. GRUPPO AMMINICO NH 2 GRUPPO CAARBOSSILICO COOH Il legame peptidico avviene tra il gruppo amminico di un aminoacido e il gruppo carbossilico dell altro aminoacido ed è un legame COVALENTE. Gli aminoacidi possono distinguersi in base alla catena laterale, alla carica elettrica, alla massa e determinano la conformazione finale della proteina: a seconda degli aminoacidi costituenti, la proteina svolgerà una determinata funzione.

8 La struttura della proteina si può dividere in: STRUTTURA PRIMARIA: così come viene sintetizzata dai ribosomi; è una sequenza lineare di aminoacidi; STRUTTURA SECONDARIA: è l organizzazione di parti di una catena polipeptidica (es. α-elica o il foglietto β); STRUTTURA TERZIARIA: è la struttura tridimensionale completa di una catena polipeptidica; STRUTTURA QUATERNARIA: forma che risulta dall unione di più molecole proteiche, le cui funzioni prendono parte alla funzione globale del complesso proteico. La disposizione nelle varie conformazioni dipende anche dalle cariche elettriche contenute nei vari aminoacidi. Tra la struttura primaria e quaternaria si ha un aumento del livello di compressione e dei legami all interno della proteina stessa. Se ad esempio, modifichiamo un aminoacido, ed in particolare lo sostituiamo con uno a carica differente, può accadere che la proteina assuma una conformazione differente e quindi svolga un attività biologica differente. Molte proteine spesso vanno incontro a modifiche post-traduzionali: aggiunta di gruppi fosfati, zuccheri e acidi grassi. Molte di queste modifiche avvengono nel reticolo endoplasmatico e sono fondamentali per direzionare la proteina e definire la sua localizzazione all interno e all esterno della cellula (ad esempio l aggiunta di acidi grassi può dire alla proteina di legarsi alla membrana plasmatica, costituita da un doppio strato fosfolipidico).

9 MODIFICAZIONI EPIGENETICHE L ESPRESSIONE GENICA è il processo attraverso il quale l informazione contenuta in un gene viene convertita in un fenotipo osservabile (comunemente la produzione di proteine). Questo processo riguarda le tecniche attraverso le quali la cellula determina la quantità di gene effettivamente espresso ed è fondamentale per il differenziamento e lo sviluppo dei vari tessuti. Nel genoma umano esistono circa geni, ma solo una parte (circa nella maggior parte delle cellule) è espressa: il processo della traduzione avviene solo per una frazione di geni che possediamo. Ad esempio, la cellula muscolare esprime il gene della MIOSINA, al contrario di una cellula nervosa che, pur avendo lo stesso gene, non lo rende attivo. La regolazione dell espressione genica dipende da vari fattori: (a livello del gene) dal tipo di compattamento del DNA (più è compatto maggiore è la difficoltà nel tradurlo in mrna); dalla presenza di particolari fattori trascrizionali che riconoscono delle sequenze specifiche nel mrna ed aumentano la produzione di geni (Trascrizione); da come l mrna viene processato con il MECCANISMO DI SPLICING; da come l mrna viene esportato fuori dal nucleo nel citosol; dalla fase di traduzione grazie alla presenza delle sequenze di DNA non codificante; dalla stabilità dell mrna. In genere l mrna è una molecola molto instabile, ma può acquisire stabilità grazie all aggiunta di gruppi e catene laterali. In questo caso l mrna avrà vita maggiore al di fuori del nucleo e permetterà la produzione di una maggiore quantità di proteine; dalle modifiche post-traduzionali: anche le proteine possono andare incontro a degradazione ed acquisire stabilità tramite eventuali modifiche (aggiunta di gruppi) effettuati dopo la loro sintesi. REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE La regolazione della trascrizione determina: - quali geni sono copiati nell RNA; - quali geni sono mantenuti in stato inattivo; - in che quantità sono trascritte le copie dei geni.

10 Nella regolazione hanno un ruolo fondamentale i FATTORI DI TRASCRIZIONE e la STRUTTURA DELLA CROMATINA. FATTORI DI TRASCRIZIONE L enzima che trasforma il DNA in mrna (RNA polimerasi) da solo non è efficiente per attivare la trascrizione e necessita della presenza dei fattori trascrizionali, cioè proteine che legano sequenze di DNA dette promotori, da cui si inizia il processo di trascrizione. I fattori di trascrizione si distinguono in: - INDUCIBILI: regolati da fattori fisici, chimici o biologici; - COSTITUITIVI: responsabili di proteine che sono sempre espresse e, quindi, sono sempre attivi; - UBIQUITARI: distribuiti in tutti i tessuti; - TESSUTI SPECIFICI: caratteristici di un tessuto. L attività di molti promotori è aumentata dalla presenza di sequenze definite ENHANCERS, cioè sequenze di DNA di lunghezza di circa basi che svolgono il loro ruolo pro-trascrizione attraverso l associazione con diverse proteine. Gli enhancers esplicano la loro funzione aumentando (fino a 200 volte) la frequenza di trascrizione del gene che controllano. Inoltre, non devono necessariamente essere vicini ai promotori, ma possono essere situati anche ad una lunga distanza dalla regione del promotore ed esplicare la funzione stimolatoria. CROMATINA Il DNA si avvolge 1,75 volte intorno agli istoni formando il nucleosoma. Gli istoni sono piccole proteine (da 102 a 135 aminoacidi) che contengono un elevata quantità di aminoacidi carichi positivamente (per esempio lisina e arginina) e perciò mostrano grandi affinità con il DNA, carico negativamente. L affinità dei fattori di trascrizione per il legame con il DNA è ridotta quando il DNA è impacchettato sotto forma di nucleosoma. Quindi possiamo dire che quando aumenta la condensazione della cromatina, la trascrizione sarà inattiva; quando invece diminuisce la condensazione, cioè andiamo a srotolare la cromatina, la trascrizione sarà attiva. Questo meccanismo è chiamato RIMODELLAMENTO DELLA CROMATINA. Si distinguono due tipi di cromatina: - ETEROCROMATINA: cromatina molto condensata ed inattiva per la trascrizione. - EUCROMATINA: cromatina poco condensata ed attiva per la trascrizione.