IV giorno: controllo postivo, e nome del gruppo di lavoro controllo negativo di 252 CAT, e nome del gruppo di lavoro

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1 IV giorno: 1) Analisi in gel di agarosio dei campioni di PCR 2) Colorazione Gram e Colorazione Acido-resistenza 3) Analisi al microscopio del campione colorato 4) Discussione dei risultati 1. Analisi in gel di agarosio dei campioni di PCR Trasferire 10µl di campione corrispondente (DNA da PCR) in eppendorf da 500 µl, siglate con campione secco, e nome del gruppo di lavoro coltura liquida, e nome del gruppo di lavoro controllo negativo, e nome del gruppo di lavoro controllo postivo, e nome del gruppo di lavoro controllo negativo di 252 CAT, e nome del gruppo di lavoro Ad ogni campione, aggiungere 2 µl di loading buffer cambiando puntale ogni volta Caricare 5µl di miscela già pronta, costituita da marker 1Kb + loading buffer+acqua, vicina alla camera elettroforetica. Caricare tutto il volume dei campioni preparati (campione secco, e nome del gruppo di lavoro; coltura liquida, e nome del gruppo di lavoro; controllo negativo, e nome del gruppo di lavoro; controllo postivo, e nome del gruppo di lavoro, controllo negativo di 252 CAT, e nome del gruppo di lavoro) in pozzetti distinti nel gel di agarosio all 1.1%, segnando su un foglio comune l ordine di caricamento. Il gel verrà analizzato al transilluminatore dopo 1h di corsa a 70 mv, per visualizzare la presenza e la concentrazione del DNA amplificato

2 2. Colorazione Gram e Colorazione Acido-resistenza 2.a Colorazione Gram i) Teoria La colorazione Gram fa parte di tecniche di colorazione policromatica (differenziale), cioè in grado di distinguere diversi tipi di batteri; i coloranti reagiscono con essi e li discriminano in funzione della diversa composizione delle loro strutture pericellulari. In particolare, la colorazione Gram consente di discriminare i batteri in base alla differente composizione della parete batterica, e pertanto in funzione della diversa reattività dei batteri ai coloranti utilizzati. Tutti i batteri si colorano di blu-viola, ma quelli con parete dotata di un sottile strato di peptidoglicano e ricca di lipidi, cioè i Gram negativi (Gram-), vengono decolorati rapidamente da un solvente organico (alcool etilico e/o acetone), mentre quelli con parete ricca di peptidoglicano e priva di lipidi, cioè i Gram positivi (Gram +) non vengono decolorati. Le cellule Gram+ risulteranno colorate di viola mentre quelle Gram- di rosa (perché ricolorabili con colorante di contrasto-vedi dopo). Tutte le colorazioni policromatiche, e quindi anche quella di Gram, richiedono 4 soluzioni: - un colorante basico, cioè un colorante il cui colore è nello ione positivo (spesso i coloranti sono sali di cui uno degli ioni è colorato) - un mordente, che aiuta a fissare il colorante sulle cellule aumentando l affinità tra cellula e colorante. Può essere un acido, una base, un sale metallico, iodio (per colorazione di Gram). Con l utilizzo del mordente la cellula si colora più intensamente ed è perciò più difficile lavar via la colorazione - un agente decolorante, che toglie il colorante dalla cellula (alcool per colorazione di Gram) Certe cellule si decolorano più facilmente di altre, consentendo quindi una discriminazione fra tipi cellulari. - un colorante di contrasto, un colorante basico caratterizzato da colore diverso dal primo, e che ha lo scopo di dare alla cellula eventualmente decolorata un colore diverso da quello iniziale. Pertanto, i microorganismi che risultano resistenti alla colorazione trattengono il colorante basico iniziale, mentre quelli che non lo sono assumono il colorante di contrasto. ii) ESPERIMENTO: Colorazione Sgrassare il vetrino (uno o più) portaoggetti flamandolo più volte alla fiamma del bunsen Depositare sul vetrino una piccola goccia di acqua aiutandosi con la pipetta. Siglare il vetrino con il nome del campione e del gruppo di lavoro Prelevare sterilmente con l ansa una parte di una colonia (fresca, di 18-24h, o perdono le differenze in parete) ben isolata, ottenuta dalle piastre seminate il II giorno, e risospenderla nella goccia di acqua, stendendo uniformemente sul vetrino la patina batterica Asciugare al calore della fiamma, flambando per 3 volte alla fiamma il vetrino con il lato della sospensione rivolto verso l alto (fissazione) Coprire la patina fissata con violetto di Nicolle SOTTO CAPPA (Cristal violet, colorazione basica). Attendere 3min. Rimuovere il colorante senza lavare (versarlo via su una salvietta) Immergere il vetrino in una torretta contenente Lugol (mordenzatura). Attendere 1min. Rimuovere il colorante senza lavare (versandolo via su una salvietta) Immergere il vetrino in una torretta contenente alcool a 95 C (decolorazione) Immergere il vetrino in una torretta contenente acqua (lavaggio) Immergere il vetrino in una torretta contenente Safranina (contrasto). Attendere per 3min Rimuovere il colorante senza lavare (versarlo via su una salvietta) Immergere il vetrino in una torretta contenente acqua. Asciugare all aria

3 Montare il vetrino con elvanoll (soluzione montante): depositare una goccia d montante, quindi appoggiarvi delicatamete il vetrino da un lato, lasciandolo poi cadere e premendolo in modo da far uscire le bolle d aria Osservare al microscopio ottico Parete Gram + Parete Gram

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5 2.b Colorazione Acido-resistenza (Colorazione di Ziehl-Nielsen) i) Teoria Questa è una colorazione policromatica che misura la resistenza delle cellule batteriche colorate alla decolorazione con acidi; la capacita di certi micobatteri e attinomiceti e infatticorrelabile con il loro alto contenuto di lipidi. Per poter colorare questi batteri occorre riscaldarli dopo averli uniti a coloranti a loro fortemente affini, per cui risulta difficile la successiva decolorazione. In questa colorazione si utlizzano: - carbofucsina a caldo - una soluzione decolorante a base di acido-alcool - un colorante di contrasto I batteri acido resistenti vengono decolorati più lentamente e trattengono la colorazione iniziale ii) ESPERIMENTO: Colorazione Prelevare sterilmente con l ansa una parte di una colonia ben isolata, ottenuta dalle piastre seminate il II giorno, e stemperare la patina sul vetrino per ottenere cellule isolate. Siglare il vetrino con il nome del campione e del gruppo di lavoro Far asciugare lo striscio all aria Fissare il vetrino alla fiamma come descritto per la colorazione di Gram Portare ad ebollizione dell acqua (pentole comuni) Mettere il vetrino sopra il vapore acqueo SOTTO CAPPA, colorare lo striscio appoggiandovi sopra un pezzo di carta assorbente imbibito con carbofucsina. Attendere 10min. Immergere il vetrino in una torretta contenente acqua (lavaggio) Immergere il vetrino in una torretta contenente uan miscela di Alcol etilico 95%, 2,5% HNO 3 (decolorazione). Attendere sec Immergere il vetrino in una torretta contenente acqua (lavaggio) Immergere il vetrino in una torretta contenente blu di metilene. Attendere 30sec (colorazione di contrasto) Immergere il vetrino in una torretta contenente acqua (lavaggio) e far asciugare Montare i vetrini con Elvanoll come descritto per la colorazione Gram Esaminare al microscopio ottico con obiettivo ad immersione

6 DOC. NORMAL 1/88. ALTERAZIONI MACROSCOPICHE DEI MATERIALI LAPIDEI: LESSICO Elaborato dalla Commissione NORMAL del Ministero dei Beni Culturali, Oggetto: lessico per la descrizione delle alterazioni macroscopiche dei materiali lapidei. Campo di applicazione: rilevamento dello stato di conservazione. Scopo: scelta e definizione dei termini utili ad indicare le differenti forme di alterazioni visibili ad occhio nudo; l indicazione sulla modalità della rappresentazione grafica. Avvertenza: l elencazione dei termini (ampliata rispetto alla precedente edizione) è basata sull ordine alfabetico, e non su criteri di classificazione o di collegamento dei fenomeni descritti. Nella descrizione dei singoli termini ci si riferisce, esclusivamente, a ciò che viene osservato visivamente, prescindendo dalle cause di degradazione. Nella attuale edizione, ogni termine è illustrato da una documentazione fotografica che, ovviamente, sarà ampia, ma non esauriente. Va ricordato che molto spesso si verifica il sovrapporsi di più forme di alterazione nella stessa zona. Si premette che per: alterazione si intende una modificazione del materiale che non implica, necessariamente, un peggioramento delle sue caratteristiche sotto il profilo conservativo; degradazione si intende una modificazione del materiale che implica, sempre, un peggioramento delle sue caratteristiche sotto il profilo conservativo. Alterazione cromatica. Alterazione che si manifesta attraversala variazione di uno, o più parametri che definiscono il colore: tinta (hue), chiarezza (value), saturazione (chroma). Può manifestarsi con morfologie diverse, a seconda delle condizioni, o può riferirsi a zone ampie o localizzate. Alveolizzazione. Degradazione che si manifesta con la formazione di cavità di forma e dimensioni variabili. Gli alveoli sono spesso interconnessi ed hanno distribuzione non uniforme. Nel caso particolare in cui il fenomeno si sviluppa essenzialmente in profondità, con andamento a diverticoli, si definisce con il termine cariatura. Concrezione. Deposito compatto, generalmente formato da elementi di estensione limitata, sviluppato preferenzialmente in una sola direzione, non coincidente con la superficie lapidea. Talora può assumere forma stalattitica o stalagmitica. Crosta. Strato superficiale di alterazione del materiale lapideo, o dei prodotti utilizzati per eventuali trattamenti. Ha spessore variabile; risulta dura, fragile e distinguibile dalle parti sottostanti per le caratteristiche morfologiche e, spesso, per il colore. Può distaccarsi anche spontaneamente dal substrato che, in genere, si presenta disgregato e/o polverulento. Deformazione. Variazione della forma che interessa l intero spessore del materiale, e che si manifesta, soprattutto, in elementi nastriformi. Degradazione differenziale. Degradazione da porre in rapporto ad eterogeneità di composizione, o di struttura del materiale, tale, quindi, da evidenziare, spesso gli originali motivi tessiturali o strutturali. Deposito superficiale. Accumulo di materiali estranei di varia natura quali, ad esempio: polvere, terriccio, guano,etc. Ha spessore variabile e, generalmente, scarsa coerenza ed aderenza la materiale sottostante. Disgregazione. Decoesione caratterizzata da distacco di granuli o cristalli, sotto minime sollecitazioni meccaniche. Distacco. Soluzione di continuità tra strati superficiali del materiale, sia tra loro che rispetto al substrato; prelude, in genere, alla caduta del materiale stesso. Il termine si usa, in particolare, nel caso degli intonaci o dei mosaici; nel caso di materiali lapidei naturali, le parti distaccate assumono, spesso, forme specifiche, in funzione delle caratteristiche strutturali e tessiturali: si preferiscono, allora, termini quali crosta, scagliatura, esfoliazione, etc.

7 Efflorescenza. Formazione, generalmente biancastra, di aspetto cristallino, polverulento o filamentoso, sulla superficie del manufatto. Nel caso di efflorescenze saline, la cristallizzazione può, talvolta, avvenire all interno del materiale, provocando spesso il distacco delle parti più superficiali: il fenomeno prende il nome di criptoefflorescenza o subefflorescenza. Erosione. Asportazione di materiale dalla superficie, dovuta a processi di natura diversa. Quando sono note le cause di degrado, possono essere utilizzati anche termini come abrasione o corrasione (cause meccaniche), corrosione (cause chimiche e biologiche), usura (cause antropiche). Esfoliazione. Degradazione che si manifesta con il distacco, spesso seguito da da caduta, di uno o più strati superficiali, subparalleli tra loro (sfoglie). Fatturazione o fessurazione. Degradazione che si manifesta con la formazione di soluzioni di continuità nel materiale, indipendentemente dallo spostamento reciproco delle parti. Incrostazione. Deposito stratiforme, compatto e, generalmente, aderente al substrato, composto da sostanze inorganiche o da strutture di natura biologica. Lacuna. Caduta o perdita di parti di un dipinto murale, con messa in luce degli strati più interni o del loro supporto (v. anche mancanza). Macchia. Alterazione che si manifesta con pigmentazione accidentale e localizzata della superficie, correlata alla presenza di materiale estraneo al substrato (per esempio: ruggine, sali di rame, sostanze organiche e vernici). Mancanza. Caduta e/o perdita di parti. Il termine di carattere generale si riferisce ai casi in cui tale forma di degradazione non è descrivibile con altri termini del lessico. Nel caso particolare degli intonaci, si usa di preferenza il termine lacuna. Patina. Alterazione strettamente limitata a quelle modificazioni naturali della superficie dei materiali non collegabili a manifesti fenomeni di degradazione, e percepibili come una variazione del colore originario del materiale. Nel caso di alterazioni indotte artificialmente, si usa di preferenza il termine patinatura. Patina biologica. Strato sottile, morbido ed omogeneo, aderente alla superficie, con un colore variabile, per lo più verde. E costituita, prevalentemente, da microrganismi, cui possono aderire polvere, terriccio, etc. Pellicola. Strato superficiale di sostanze coerenti tra loro, estranee al materiale lapideo. Ha uno spessore molto ridotto e può distaccarsi dal substrato che, in genere, si presenta integro. Pitting. Degradazione puntiforme che si manifesta attraverso la formazione di fori numerosi e ravvicinati. I fori hanno forma tendenzialmente cilindrica, con diametro massimo di pochi millimetri. Polverizzazione. Decoesione che si manifesta attraverso la caduta spontanea del materiale, sottoforma di polvere o granuli. Rigonfiamento. Sollevamento superficiale e localizzato del materiale, che può assumere forma e consistenza variabili. Presenza di vegetazione. Locuzione impiegata quando vi sono licheni, muschi e piante. Scagliatura. Degradazione che si manifesta attraverso il distacco totale o parziale di parti (scaglie), spesso secondo soluzioni di continuità del materiale originario. Le scaglie hanno forme e spessori irregolari, e sviluppo tridimensionale. Sono costituite, generalmente, da materiale in apparenza inalterato. Al di sotto possono essere presenti efflorescenze o patine biologiche.

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