Per vedere questa immagine occorre QuickTime e un decompressore Animation.

Transcript

1 Per vedere questa immagine occorre QuickTime e un decompressore Animation.

2 Trascrizione Un sistema enzimatico converte l informazione l genetica di un segmento di DNA a doppia elica in una catena di RNA che avrà una sequenza di basi complementare a una delle due eliche di DNA. Vengono prodotti tre tipi principali di RNA: RNA messaggero (mrna( mrna) RNA transfer (trna( trna) RNA ribosomale (rrna)

3 L RNA è sintetizzato dalle RNA polimerasi (Thermus aquaticus) (Saccharomyces cerevisiae) La somiglianza tra le strutture rivela che gli enzimi hanno una comune origine evolutiva e hanno in comune molte caratteristiche del loro meccanismo d azione. d

4 La RNA polimerasi La RNA polimerasi DNA dipendente necessita di: stampo di DNA i quattro ribonucleosidi 5 trifosfato (ATP, GTP, UTP e CTP) Mg 2+ La reazione complessiva è: (NMP) n + NTP RNA polimerasi + NTP (NMP) n+1 + PP i RNA RNA allungato La RNA polimerasi allunga la catena aggiungendo unità ribonucleotidiche al terminale 3 -ossidrilico3 della catena di RNA (sintesi in direzione 5 3 ) 5 Il gruppo ossidrilico in 3 3 agisce da nucleofilo,, attaccando il fosfato α del ribonucleoside trifosfato successivo.

5 La RNA polimerasi (b) Ogni nucleotide dell RNA neosintetizzato viene scelto secondo le regole di Watson e Crick di appaiamento delle basi; residui di uridilato (U) vengono inseriti nell RNA in posizione opposta ai residui di adenilato del DNA stampo. La RNA polimerasi non ha bisogno di un primer per iniziare la sintesi. L inizio avviene solo quando l RNA l polimerasi si lega in corrispondenza di specifiche sequenze di DNA chiamate promotori. Il gruppo trifosfato in 5 5 del primo residuo di una catena nascente non viene scisso per liberare pirofosfato,, ma resta intatto durante la trascrizione.

6 Bolla di trascrizione (circa 17 coppie di basi) Catena Non-stampo RNA polimerasi Avvolgimento Disavvolgimento Ibrido RNA-DNA (8 coppie di basi) Sito attivo Catena stampo Direzione della trascrizione Trascrizione da parte della RNA polimerasi di E. coli

7 Superavvolgimenti negativi Superavvolgimenti positivi Direzione della trascrizione I problemi topologici determinati dalla trascrizione sono risolti i grazie all azione azione delle topoisomerasi.

8 Catena non-stampo (codificante) di DNA Catena stampo di DNA Trascritto di RNA

9 Genoma dell adenovirus La catena codificante di un determinato gene può essere situata su entrambi i filamenti di un cromosoma.

10 L RNA polimerasi di E. coli. La RNA polimerasi diretta da DNA di E. coli è un enzima grande e complesso costituito da un nucleo di 5 subunità (α 2 ββ ω; M r = ), e da una sesta subunità, chiamata σ. La subunità σ funziona solo per il riconoscimento del promotore e non è presente durante la fase di allungamento della trascrizione. Differenti tipi di σ riconoscono diverse sequenze regolatorie. Il sito attivo per la sintesi dell RNA è probabilmente costituito dalle subunità β e β. Non è nota la funzione della subunità ω; almeno in vitro non è necessaria per l attività dell enzima Le RNA polimerasi non possiedono un attività di proofreading esonucleasica 3 5 (1 errore ogni ribonucleotidi incorporati nell RNA).

11 La RNA polimerasi si lega a specifiche sequenze del DNA chiamate promotori Sequenze di cinque promotori riconosciute dall oloenzima della RNA polimerasi contenente σ 70. L elemento UP, legato dalla subunità α dell RNA polimerasi, è presente solo in alcuni promotori e stimola fortemente la trascrizione del gene.

12 Le subunità σ della RNA polimerasi riconoscono i siti promotori La subunità σ contribuisce a determinare la specificità trascrizione: dell inizio della a) La subunità σ diminuisce di 10 4 volte l affinitl affinità della RNA polimerasi per regioni aspecifiche del DNA; b) La subunità σ permette alla RNA polimerasi di riconoscere la sequenza 5 -TATAAT 5 della regione -10 dei siti promotori. L oloenzima si lega al DNA a doppia catena e si sposta lungo la doppia elica a in cerca di un promotore, formando legami idrogeno transitori. La ricerca r è più veloce perché l enzima scivola lungo il DNA invece di legarsi e separarsi ripetutamente. Il sito promotore viene incontrato mediante uno scorrimento casuale ale in una singola dimensione, invece che in un sistema tridimensionale. La subunità σ si stacca quando la catena di RNA in formazione raggiunge una lunghezza di nucleotidi.

13 E. Coli contiene numerosi fattori σ,, diversi tra loro, in grado di riconoscere vari tipi di sequenze di promotori presenti nel suo DNA σ 70 σ 32 σ 54 La subunità σ ha un ruolo fondamentale nella determinazione del punto dove la RNA polimerasi deve iniziare la trascrizione

14 Struttura della subunità σ 70 di E. coli. La subunità σ presenta sulla sua superficie una struttura ad α-elica,, coinvolta nel riconoscimento della sequenza 5 -TATAAT 5 della regione -10

15 Reazioni dell inizio della trascrizione da parte della RNA polimerasi di E. coli.

16

17

18 Termine della trascrizione ρ-indipendente in E. coli. Segnale di terminazione La trascrizione di alcuni geni termina in corrispondenza di un ripiegamento r a forcina dell RNA, seguito da alcuni residui di uracile.

19 Termine della trascrizione ρ-indipendente in E. coli. Pausa UUUUUUUU Superamento Isomerizzazione UUUUUUUU Dissociazione Termine

20 Termine della trascrizione ρ-dipendente in E. coli. In alcuni geni la terminazione della trascrizione richiede la proteina Rho (ρ). I terminatori ρ-dipendenti non possiedono la sequenza di adenilati ripetuti nello stampo, ma di solito hanno una breve sequenza che porta alla formazione della forcina. La proteina ρ si associa all RNA in corrispondenza di un sito di legame specifico (sequenza ricca in G-C) G e migra in direzione finchè non raggiunge il complesso di trascrizione fermo al terminatore, e quindi contribuisce al rilascio del trascritto di RNA L attività ATPasica di ρ permette alla proteina di tirare la catena di RNA in formazione, mentre insegue la RNA polimerasi. Quando ρ raggiunge la RNA polimerasi a livello della bolla di trascrizione, si ha la separazione dell elica elica ibrida RNA-DNA; la proteina si comporta come una RNA-DNA elicasi.

21 Differenze tra l inizio della trascrizione nei procarioti e negli eucarioti: 1) Nei batteri vi è 1 RNA polimerasi; negli eucarioti 3. 2) l RNA polimerasi batterica è in grado di iniziare la trascrizione senza l aiuto di altre proteine; le RNA polimerasiche eucariotiche richiedono l aiuto di altre proteine dette Fattori trascrizionali generali (GTF). 3) Le proteine che regolano la trascrizione negli eucarioti (repressori e attivatori) possono influenzare l inizio della trascrizione anche quando legate al DNA a grande distanza. Le sequenze regolative dei batteri sono vicine all inizio della trascrizione. 4) Il DNA di una cellula eucariotica è organizzato nella cromatina.

22 Differenze tra la trascrizione nei procarioti e negli eucarioti: Procarioti Eucarioti Numero di Polimerasi: 1 3 Capacità della Polimerasi di iniziare la trascrizione senza l aiuto l di altre proteine: Si No Presenza dei nucleosomi: No Si Azione a distanza delle proteine che regolano la trascrizione: No Si

23 Polimerasi presenti in una cellula eucariotica: RNA Polimerasi I: RNA ribosomali (5.8S, 18S, 28S); 50-70% dell attività RNA-polimerasica della cellula; localizzata nel nucleolo. RNA Polimerasi II: RNA che codificano per le proteine (mrna) e alcuni piccoli RNA nucleari;(20-40% dell attività RNA-polimerasica della cellula); localizzata nel nucleoplasma. - Le 3 subunità più grandi di Pol II presentano omologia con le subunità β, β e α dei batteri. - La subunità maggiore di Pol II presenta alla propria estremità C-terminale una serie di ripetizioni in tandem della sequenza YSPTSPS (52 nell uomo, 43 in Drosophila, 26 nel lievito), nota come sequenza CTD. RNA Polimerasi III: trna, RNA 5S e piccoli RNA nucleari (10% dell attività RNA-polimerasica della cellula); localizzata nel nucleoplasma. * Le 3 polimerasi eucariotiche hanno più subunità (8-14), 5 delle quali sono comuni a tutti gli enzimi.

24 RNA polimerasi II L RNA polimerasi II eucariotica è un enzima costituito da 12 subunità e richiede altre proteine, chiamate fattori di trascrizione,, per poter formare il complesso attivo della trascrizione. Fattori di trascrizione di base o generali (GTF), richiesti da qualsiasi promotore della RNA polimerasi II (comunemente indicati con TFII e con una lettera) Attivatori Repressori Co-attivatori Co-repressori

25 L RNA polimerasi II richiede per la sua attività molti altri fattori proteici

26 La struttura di un gene eucariotico Sequenze regolative (enhancer/silencer) Promotore Gene bp Distanza 1-30kb 200bp TATAa/tAa/t -30 TATA box +1 Py 2 CAPy 5-3/+5 Initiator

27 Sequenze comuni di promotori riconosciute dalla RNA polimerasi II degli eucarioti Varie sequenze regolarorie

28 Il complesso di pre-inizio della trascrizione (PIC) A TFIID B CTD F Pol II E H TATA

29 I fattori trascrizionali generali (GTF) (o basali) TFIID. Primo fattore a legare il promotore in corrispondenza della sequenza TATA (TATA box), e unico tra i GTF in grado di legare in maniera specifica il DNA. Composto da TATA binding protein (TBP) e da 8-12 TBP associated factors (TAFs). TFIIA Importante per stabilizzare il legame di TBP al DNA. TFIIB Interagisce con TFIID, TFIIF e PolII, questi contatti sono importanti per il corretto posizionamento dellla Pol II nel sito di inizio della trasrizione. TFIIF Associato a Pol II è importante per il corretto posizionamento di Pol II nel complesso di inizio (anche per interazione con TFIIB); è dotato di attività elicasica ATP-dipendente che separa inizialmente la doppia elica di DNA per consentire alla polimerasi di operare; 2 subunità. Perché il complesso di inizio possa iniziare a trascrivere con successo è necessaria l associazione di almeno altri due GTF: TFIIH e TFIIE. TFIIH Presenta un attività chinasica in grado di fosforilare CTD e un attività di DNA elicasi ATP dipendente (2 subunità ERCC2 e ERCC3); 8 subunità. TFIIE Stimola la reazione di fosforilazione di CTD da parte di TFIIH e ne regola l attività di ATPasi/elicasi; 2 subunità La fosforilazione di CTD è il segnale del passaggio dall inizio della trascrizione alla fase di elongazione.

30 Il primo passaggio nella formazione del complesso di pre-inizio è il reclutamento di TFIID TATA I R TFIID TFIID TATA I R

31 Struttura di TBP legata al DNA

32 Struttura di TBP legata al DNA La proteina TBP legata alla sequenza TATA box rappresenta il cuore del complesso di inizio Il legame di TBP induce notevoli cambiamenti conformazionali nel DNA La superficie a forma di sella della TBP contiene i siti di legame per altri componenti del complesso di inizio della trascrizione.

33 TBP associated factors (TAF) - Servono come siti di legame per gli attivatori (co-attivatori) -Mediano il riconoscimento della regione core del promotore. es.: dtaf II 150 e dtaf II 250 interagiscono con la sequenza initiator -Sono provviste di attività catalitiche: es.: htaf II 150 e ytaf II 145 hanno attività di acetiltransferasi che riconoscono gli istoni

34 TATA I R TFIID TFIID TATA A B A TFIID B TATA La TBP viene legata dal fattore TFIIA e poi dal TFIIB. Il fattore TFIIA stabilizza il complesso TFIIB-TBP TBP sul DNA.

35 Complesso ternario costituito da TBP, da TFIIA e dal DNA

36 A TFIID B Pol II/F E H Promotore PIC

37 La fosforilazione del CTD di Pol II è importante per l inizio l della trascrizione A TFIID B CTD F Pol II E H TATA ATP H E B F A TFIID CTD Pol II TATA

38 L ipotesi dell oloenzima oloenzima. Mediator (SRBs) B F CTD E Pol II H A TFIID TATA

39

40

41 Per vedere questa immagine occorre QuickTime e un decompressore Animation.

42 L allungamento delle catene di RNA da parte della RNA polimerasi sia nei batteri che negli eucarioti viene inibito dall antibiotico actinomicina D e dall acridina.

43 La porzione planare dell actinomicina D si inserisce nel DNA a doppia elica tra appaiamenti G C consecutivi e deforma il DNA.

44 La rifampicina è un antibiotico che inibisce la sintesi di RNA legandosi specificamente alla subunità β delle RNA polimerasi batteriche e impedendo così la fase di distacco dal promotore.

45 L α-amanitina, un componente tossico del fungo velenoso Amanita phalloides, blocca la sintesi di RNA da parte della RNA polimerasi II, e, a concentrazioni più alte, della RNA polimerasi III; non ha invece alcun effetto sulla trascrizione nei batteri.

46 Fattori trascrizionali: Proteine necessarie per l inizio della trascrizione che non sono parte integrante dell enzima RNA polimerasi.

47 ?Y? X SP1 CTF POLII + GTF -200 GC box -90 CAAT box -75 TATA -30 Inr +1

48 Livelli di Trascrizione A TFIID TATA B CTD F Pol II E H + Attivatore A TFIID TATA B CTD F Pol II E H

49 Dominio di interazione con il DNA Dominio di attivazione

50 CAP La proteina CAP, una proteina che regola l espressione genica nei batteri, ha due domini: - Il dominio più piccolo lega il DNA; - Il dominio più grande lega l AMP ciclico

51 GAL4 LexA (aa ) (aa 1-147) Domini di interazione con il DNA (aa 1-87) Sequenza DNA bersaglio UAS G LexA OP Proteina chimerica LexA-GAL4 LexA (aa 1-87) ON NO OFF LexA P Promotore Gene Reporter UAS G Promotore Gene Reporter

52 I domini di interazione con il DNA dei Fattori trascrizionali eucariotici 1) Helix-turn helix Omeodominio 2) I domini che legano lo zinco Domini zinc finger classici o 2 cisteine/2 istidine Domini zinc finger del tipo 4 cisteine (proteine GATA) Gal4 I recettori degli ormoni steroidei 3) I domini leucine zipper Jun/fos

53 Gruppi funzionali nel DNA per legare le proteine

54

55 Il motivo strutturale elica ripiegamento elica Il motivo che lega il DNA del repressore LAC

56 Zinc finger I tre zinc finger presenti nella proteina zif 268

57 Omeodominio Omeodominio della proteina Ultrabitorax

58 Leucina zipper

59 Leucina zipper della proteina di lievito GCN4

60 Elica-ansa-elica Il fattore di trascrizione umano Max

61 Come funzionano gli attivatori trascrizionali? A) Gli attivatori possono interagire con il complesso di inizio della trascrizione facilitandone la formazione ( recruitment ). Pol II+ GTF

62 AD TBP + Pol II + TAFs + GTF Trascrizione DBD Attivatore TBP TATA I R TBP + Pol II + TaFs + GTF DBD TBP TATA I R + DBD TBP + Pol II + TAFs + GTF DBD TBP TATA I R

63 TBP associated factors (TAF) - Servono come siti di legame per gli attivatori (co-attivatori) -Mediano il riconoscimento della regione core del promotore. es.: dtaf II 150 e dtaf II 250 interagiscono con la sequenza initiator -Sono provviste di attività catalitiche: es.: htaf II 150 e ytaf II 145 hanno attività di acetiltransferasi che riconoscono gli istoni

64 La funzione dei TBP associated factors (TAFs) TFIID Pol II + GTF Livelli di trascrizione Attivatore TATA Attivatore TBP TATA Pol II + GTF + TAFs Attivatore TBP TATA Pol II + GTF

65 Co-attivatore Attivatore Pol II+ GTF

66 Attivatore TAFs Target: TBP A B H TFIID TFIIA TFIIB TFIIH Risultato interazione: Facilita il reclutamento nel complesso di inizio Facilita il reclutamento nel complesso di inizio e quindi stabilizza il legame TBP/DNA Facilita il reclutamento nel complesso di inizio; questo favorisce il legame di PolII Stimola l attività chinasica; quindi favorisce l inizio della trascrizione. Attivazione

67 I nucleosomi inibiscono il legame di TFIID al DNA TFIID X TATA box

68

69 B) Gli attivatori trascrizionali possono alterare la struttura della cromatina per favorire il legame di TFIID e dell intero complesso di inizio della trascrizione (anti-repressione) reclutando un complesso che modifica la cromatina. Complesso che modifica la cromatina ATP ADP + P i TFIID Attivatore Nucleosom a

70 ATP AP + P i ATP AP + P i TFIID Attivatore

71

72 Dominio basico Histone fold NH 2 COOH SGRGKQGGKARAKAKSRSSRAGLQ - [25-129] H2A PEPAKSAPAPKKGSKKAVTKTQKKGDKKRKK - [32-125] H2B ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPTGGVKKPH - [40-135] H SGRGKGGKGLLKGGAKRHRKVLRDNIQGITK - [32-105] H

73

74 L acetilazione degli Istoni NH 3 + CH 2 CH 3 C=O H S S CH 3 CoenzimaA HAT CoenzimaA C=O NH CH 2 (CH 2 ) 3 (CH 2 ) 3 -X-Lys-X-Istone CH 3 HDAC H 2 O -X-Lys-X-Istone C=O OH

75 Ac. Ac. Ac. Ac. Ac. Ac. Acetilazione Deacetilazione

76 C) Gli attivatori trascrizionali possono alterare la struttura della cromatina mediante il reclutamento di una o più acetiltransferasi Complesso che acetila gli istoni Ac. Ac. Attivatore Ac. Ac. TFIID

77 Acetiltransferasi che acetilano gli Istoni: Fattori trascrizionali basali: TAFII250 Co-attivatori: 1) GCN5 2) P300/CBP 3) P/CAF

78 Acetiltransferasi (HAT) tipo A Nucleari Substrati potenziali Possibile effetto Gcn5 p300/cbp PCAF SRC-1/NCoA-1 pcip ACTR Coattivatori Istoni Fattori trascrizionali (Es.: p53, GATA-1, TFIIE,TFIIF) Alterazioni della struttura della cromatina Legame al DNA TAF II 250 Fattore associato a TBP Acetiltransferasi (HAT) tipo B Citoplasmatiche HAT1p Istoni neosintetizzati Assemblaggio della cromatina

79 Modificazioni degli Istoni Acetilazione Metilazione Fosforilazione ADP-ribosilazione Ubiquitinazione (solo H2A e H2b)

80 Ogni fattore può avere più di un target e funzionare in modi diversi Più fattori con targets diversi hanno effetto cooperativo 1) Alcuni fattori solo recruitment 2) Altri fattori sia recruitment che anti-repressione 3)Altri ancora specializzati come antirepressori (GAGA)

81 Stato di attivazione di un gene Struttura del gene Stato attivato Legame dei Fattori trascrizionali e del PIC Attivazione genica Stato derepresso (attivabile) Attivazione Antirepressione Cromatina in parte decondensata; DNA accessibile ai Fattori Trascrizionali Stato basale inattivo Filamento di cromatina di 30nm; inaccessibile alla Polimerasi

82 Meccanismo d azione d dei repressori attivatore a) repressore Gene ON OFF b) X OFF

83 Meccanismo d azione d dei repressori c) repressore OFF d) OFF

84 Alcuni repressori trascrizionali possono funzionare reclutando un complesso che deacetila gli istoni Complesso che deacetila gli istoni TATA box TFIID X TATA box

85 Deacet ilasi istoniche (HDAC) negli eucar ioti superiori Classe I HDAC 1 HDAC 2 Omolog he a Rpd3 HDAC 3 Classe II HDAC 4 HDAC 5 Omolog he a Hda1 HDAC 6

86 La struttura di un gene eucariotico Sequenze regolative (enhancer/silencer) Promotore Gene bp Distanza 1-30kb 200bp TATAa/tAa/t -30 TATA box +1 Py 2 CAPy 5-3/+5 Initiator

87 ? Enhancer 1-30 kb Promotore PIC

88 Enhancer Loop PIC Promotore

89 Il locus delle β-globine Insulator Enhancer (LCR) Insulator ε Gγ Aγ δ β

90 CTCF e l attivitl attività di enhancer-blocking insulator (1) Il locus delle β-globine Sito FII Sito FII sia necessario che sufficiente per l attività di enhancer-blocking

91 X Promotore 2 non attivato Enhancer Promotore 1 Attivato

92 Insulator Enhancer I Insulator Promotore X OFF I ON Insulator Enhancer Promotore

93 Enhancer-blocking insulator E PROMOTORE 2 PROMOTORE 1 I

94 CTCF e l attivitl attività di enhancer-blocking insulator (2) Il locus imprinted Igf2/H19 Mat Igf2 CTCF H19 ICR Enh Pat Igf2 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 H19 ICR Enh

95 L attività dei fattori trascrizionali può essere controllata A) Forma Inattiva NO Sintesi proteica Forma attiva Esempio Omeoproteine B) Fosforilazione HSTF C) Attacco del ligando Recettori degli steroidi D) Nucleo Citoplasma Rilascio dell inibitore NF-kB E) Cambio di partner HLH (MyoD/ID)

96 Nucleo Citoplasma DNA hnrna mrna 1 2 mrna Proteine 4 5 Proteine attive o inattive Controllo della trascrizione Controllo della maturazione dell hnrna Controllo della traduzione Controllo post-traduzionale Poro nucleare 3 Controllo del trasporto nel citoplasma

97 FINE