CONFRONTO FRA DUE PROCEDIMENTI PER L ESECUZIONE DEL TEST D EMBRIOTOSSICITÀ CON I GAMETI DEL RICCIO DI MARE PARACENTROTUS LIVIDUS (LAMARCK 1835)

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1 Biol. Mar. Medit. (6), 13 (1): Centro Interuniversitario di Biologia Marina ed Ecologia Applicata (CIBM), Viale N. Sauro, Livorno, Italia. CONFRONTO FRA DUE PROCEDIMENTI PER L ESECUZIONE DEL TEST D EMBRIOTOSSICITÀ CON I GAMETI DEL RICCIO DI MARE PARACENTROTUS LIVIDUS (LAMARCK 1835) COMPARISON BETWEEN TWO PROCEDURES TO PERFORME THE TEST OF EMBRYO TOXICITY WITH PARACENTROTUS LIVIDUS (LAMARCK 1835) SEA URCHIN GAMETES Abstract Two procedures to perform the test of embryo-toxicity with gametes of Paracentrotus lividus (Lamarck 1835) are compared. In the first method the sperm is exposed for one hour to a reference toxicant and to the solution wich has been tested, before its contact with eggs. In the second method, the zygotes are exposed. In the following hours we applied the same control procedure in both methods. The first experimental procedure appears more sensitive than the second one. Key-words: Paracentrotus lividus, embryo toxicity, sperm, zygotes, EC 5. Introduzione Il test d embriotossicità con Paracentrotus lividus può essere eseguito seguendo due procedure molto simili. Il primo procedimento, prevede l esposizione dello sperma per un intervallo di tempo stabilito al tossico di riferimento e alle sostanze testate prima dell aggiunta delle uova. Fecondazione e sviluppo per le 48 o 72 ore successive avvengono quindi a contatto con tali soluzioni. Il secondo procedimento, prevede la fecondazione in acqua di mare non contaminata e la successiva esposizione degli embrioni (zigoti) al tossico di riferimento ed alle sostanze testate (EPA 1995, ASTM 1995). La differenza tra queste due procedure è evidente considerando il materiale biologico che è impiegato nell esperimento ed esposto alle sostanze esaminate. Da una parte lo sperma, (2 µm) rappresentato da una cellula preservata dalla sottile membrana cellulare e dall altra lo zigote (1- µm) protetto dalla membrana di fecondazione. La sensibilità naturale dello sperma dipende da numerosi fattori esterni ed interni. Lo sperma è ritenuto un indicatore molto sensibile alla presenza di sostanze nocive nell ambiente marino ed è impiegato nei test di spermiotossicità. Nel caso in cui lo sperma è esposto prima del suo contatto con le uova alle sostanze tossiche, il risultato della fecondazione e del successivo sviluppo sarà differente dal risultato della fecondazione e sviluppo avvenuti in un ambiente pulito. Nel primo procedimento viene stimato lo sviluppo che porta a termine la fecondazione che avviene in una unica provetta contenente la soluzione tossica. Nel secondo procedimento al contrario è valutato soltanto l effetto sugli embrioni ottenuti dalla fecondazione avvenuta in acqua pulita ed in seguito esposti alla

2 186 soluzione tossica. Questo lavoro cerca di rintracciare le possibili differenze tra i due procedimenti, riguardo alla loro sensibilità verso un tossico di riferimento e alcune sostanze naturali testate (elutriati). Materiali e metodi Le singole prove di confronto sono state eseguite con lo stesso pool di animali. I ricci dopo la raccolta manuale e dopo il trasporto sono stati stabulati in acquario alla temperatura di 16±1 C in condizioni controllate per un minimo di sette giorni. La loro alimentazione era composta da alghe provenienti dal sito di prelievo ed inoltre da Codium sp. L emissione dei gameti maschili e femminili è stata provocata tramite l iniezione di,5 ml di 1 M KCl nella cavità celomatica o con la stimolazione elettrica. Lo sperma è stato recuperato a secco e conservato a 4 C fino al suo uso entro 3-5 ore dal suo prelievo. La raccolta delle uova è stata realizzata per ogni femmina in un becher contenente 5 ml di acqua marina naturale (NSW) filtrata, capovolgendo l animale con il poro anale verso l acqua. Dopo la valutazione della maturità (mancanza del nucleo) forma e colore, le uova sono state unite in un becher e lavate tre volte. Alla fine, diluite ad una densità di uova/ml e conservate a 18 C per 3-5 ore. 5 µl di sperma non diluito sono stati bloccati in 1 ml d acqua dolce. La concentrazione dello sperma è stata stabilita in conformità al conteggio nella camera di Thoma. La diluizione finale è stata preparata un istante prima dell esposizione. Il rapporto uovo/sperma era stabilito a 1/15. L esperimento prevedeva quattro diluizioni del tossico di riferimento Cu(NO 3 ) 2 3H 2 O (16, 32, 46,64 µg/l) e tre diluizioni degli elutriati (EPA 1998) a diversa contaminazione (1,5 e 25%), tutto in tre repliche. Come controllo negativo è stata usata l acqua di mare naturale filtrata ( µm). 1 procedimento. Lo sperma è stato esposto per un ora alle concentrazioni previste del tossico di riferimento, elutriati ed acqua di mare naturale filtrata (controllo negativo) in provette di vetro borosilicato in un volume di 9 ml. Le uova (1 ml della soluzione finale/ogni provetta) sono state aggiunte dopo un ora. Dopo 48 o 72 ore il test è stato bloccato mediante l aggiunta di 1ml di formaldeide (37%). 2 procedimento. Alla soluzione delle uova ( uova/ml) è stato aggiunto lo sperma diluito in NSW ad una concentrazione che garantiva il rapporto uovo/ sperma di 1/15. Dopo venti minuti 1 ml della soluzione (contenente uova fecondate) è stato trasferito nelle provette contenenti 4 diluizioni del tossico di riferimento, tre diluizioni degli elutriati (1, 5 e 25%) e controllo negativo (NSW), il tutto in tre repliche. Il test è stato bloccato mediante l aggiunta di 1 ml di formaldeide (37%) dopo 48/72 ore. Le provette sono state conservate a 5 C fino alla loro valutazione. Al microscopio sono stati contati cento embrioni e calcolata la percentuale dei plutei in ciascun campione ed in ciascuna replica. I risultati sono stati sottoposti a correzione dell Abott. EC 5 è stato calcolato con metodo Trimmed Spearman-Karber 1,5 e le risposte sottoposte all analisi statistica ANOVA.

3 Esecuzione del test d embriotossicità con i gameti del riccio di mare Paracentrotus lividus 187 Risultati La qualità delle uova risultava buona riguardo alla loro forma, colore e maturità. L osservazione microscopica (42 ) dello sperma aveva confermato la sua ottima vitalità e capacità fecondativa, confermata dalle prove preliminari di fecondazione. Nel controllo (NSW) non sono state osservate differenze significative all interno delle singole prove tra le due metodiche applicate. Le percentuali finali dei plutei in tutti gli esperimenti non erano significativamente differenti (p=,345-,669 ANOVA). Da questa osservazione risulta, che in NSW pulita, la cellula di partenza non è rilevante per il successivo sviluppo. 45 Valori dell'ec 5 (mg/l) μ EC 5(mg/l) μ 35 3 sperma 48 ore sperma 72 ore embrio 48 ore embrio 72 ore numero d'esperimento Fig. 1 - Valori dell EC 5 ottenuti durante le cinque prove di confronto. Values of EC 5 (μg/l) obtained in five comparative experiments. Nel caso dell esposizione dello sperma (prima metodica) agli elutriati a diversa contaminazione per 48 o 72 ore, si osserva la disuguaglianza nella percentuale finale dei plutei. La durata dello sviluppo per 48/72 ore invece non influenza la quantità dei plutei a condizione che vengono applicati gli zigoti (seconda metodica). Dai valori dell EC 5 si può notare la sensibilità superiore dello sperma (48/72) verso il tossico di riferimento (Fig. 1.) Questo evento si conferma anche nelle prove eseguite con gli elutriati a tutte le loro concentrazioni (Figg. 2, 3, 4 e 5). Percentuale dei plutei nel campione num.1 cellule di partenza/tempo di sviluppo contr campione 1.(1%) campione 1. (5%) campione 1.(25%) Fig. 2 - Percentuale dei plutei nel campione 1. Percentage of pluteus in sample 1.

4 188 Percentuale dei plutei nel campione num. 2 cellule di partenza/tempo di sviluppo controllo campione 2.(1%) campione 2.(5%) campione 2.(25%) Fig. 3 - Percentuale dei plutei nel campione 2. Percentage of pluteus in sample 2. Percentuale dei plutei nel campione num.3 cellule di partenza/durata di sviluppo controllo campione 3.(1%) campione 3.(5%) campione 3.(25%) Fig. 4 - Percentuale dei plutei nel campione 3. Percentage of pluteus in sample 3. Percentuale dei plutei in campione num sperma cellule di partenza /durata di sviluppo embrio controllo campione 4(1%) campione 4(5%) campione 4(25%) Fig. 5 - Percentuale dei plutei nel campione 4. Percentage of pluteus in sample 4.

5 Esecuzione del test d embriotossicità con i gameti del riccio di mare Paracentrotus lividus 189 In un lavoro separato saranno riportati e confrontati i risultati ottenuti nelle prove successive e sarà approfondita la significatività delle differenze riscontrate tra le due metodiche, riguardo alla loro sensibilità verso il tossico di riferimento e le sostanze naturali. Conclusioni La sensibilità al tossico di riferimento dimostrata dal primo metodo è leggermente maggiore di quella evidenziata dal secondo metodo. Le prove effettuate con gli elutriati confermano quest osservazione. Bibliografia ASTM (1995) - Standard Guide for Conducting Static Acute Toxicity Tests with Echinoid Embryos. American Standard testing Materials. E : EPA (1995) - Short-term Methods for Estimating the Chronic Toxicity of Effluents and Receiving Waters to West Coast Marine and Estuarine Organisms. /R-95: 136. EPA (1998) - Evaluation of Dredged Material Proposed for Discharge in Waters of the U.S. Testing Manual 823-B-98-4.