Confronto dei metodi di tipizzazione molecolare per la caratterizzazione di ceppi di Listeria monocytogenes circolanti in Italia
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1 Confronto dei metodi di tipizzazione molecolare per la caratterizzazione di ceppi di Listeria monocytogenes circolanti in talia Progetto ricerca corrente MSRCTE0212 Patrizia Centorame Laboratorio Nazionale di Riferimento Listeria monocytogenes Teramo,9 giugno 2015
2 Report 2 gennaio 2015 di EFSA e ECDC, Premessa Riduzione del numero di campioni non conformi per la presenza di L. monocytogenes in RTE (limite 100 cfu/g). casi di listeriosi umana sono aumentati rispetto al report precedente.
3 Perché è importante caratterizzare un ceppo di Listeria monocytogenes? Disegnare la distribuzione di Lm in outbreaks e nei casi sporadici umani. dentificare gli alimenti e i fattori ambientali da cui hanno avuto origine i focolai d infezione. Determinare le «fonti di contaminazione» nelle filiere di produzione alimentari.
4 Obiettivi Caratterizzare ceppi isolati in talia nel corso degli ultimi anni da casi di listeriosi, da alimenti e dall ambiente selezionati in base alla similarità di profili molecolari. Valutare la distribuzione di specifici ceppi di Listeria e l esistenza di fattori genetici coinvolti nella patogenicità quali: fattori di virulenza, antibiotico resistenza, ecc.,
5 Descrizione degli esperimenti ed unità operative 1 Fase (U.O.1: Laboratorio Nazionale di Riferimento per Listeria monocytogenes. Resp. Giacomo Migliorati, U.O.6 Facoltà di Medicina Univ. Milano, Resp. Prof.ssa Mirella Pontello) Analisi di ceppi clinici di Listeria monocytogenes isolati da casi di listeriosi, negli ultimi anni mediante PFGE e MLST. 2 Fase (U.O.1: Laboratorio Nazionale di Riferimento per Listeria monocytogenes. Resp. Giacomo Migliorati, U.O.6 Facoltà di Medicina Univ. Milano, Resp. Prof.ssa Mirella Pontello) Selezione di ceppi di Listeria monocytogenes presenti nel nostro database isolati da ambiente ed alimenti aventi profili molecolari simili in PFGE agli isolati umani ed analisi mediante MLST. 3 Fase (U.O.3 Reparto ricerca e Sviluppo Biotecnologie, Resp. Dott. Cesare Cammà) Sequenziamento dell intero genoma attraverso «NGS» dei ceppi selezionati e analisi bioinformatiche.
6 Metodo di caratterizzazione basato sull analisi dei frammenti di DNA Pulsed-field gel-electrophoresis (PFGE) considerato il gold standard per la caratterizzazione di Listeria monocytogenes. Prevede la frammentazione del DNA mediante endonucleasi di restrizione (Apa e Asc) e la separazione di questi frammenti (elettroforesi in campo pulsato) per poterne misurare il numero e le dimensioni; il pattern che ne deriva può essere utilizzato come fingerprint per riconoscere un batterio. (Pulsenet 2013, EURLm 2011). solato A solato B Pattern 22 Pattern 150
7 Metodi di caratterizzazione basati sul sequenziamento del DNA Multi Locus Sequence typing (MLST) (Multi-locus Sequence Typing) valuta un singolo polimorfismo (SNPs) in frammenti di bp di ciascuno dei sette geni housekeeping presi in considerazione (abcz,bgla,cat,dape,dat,ldh,nka). La variazione di un solo nucleotide determina l assegnazione di un specifico allele, la combinazione di questi sette alleli identificherà uno specifico sequence type (Haase et al. 2013). Next generation sequencing (NGS) di recente introduzione in ZS AM con il metodo «llumina»
8 Risultati MLSTCMP Asc +Apa PFGE Asc PFGE Apa Asc Apa Sequence Type Clonal Complex hu 4 b GX6A GX6A CC29 C163 PASTA ALMENTARE C170 SPEDN MPANAT 4 b GX6A GX6A CC29 311hu 73.0 C161 TAMPONE ATTREZZ GX6A GX6A CC 19hu C164 GORGONZOLA GX6A GX6A CC C192 30hu GX6A GX6A CC C194 C169 TAMPONE ATTREZZ GX6A GX6A CC C195 PROSCUTTO COTTO C171 CC C C173 CC C19 3a C175 CC C199 CARNE C176 CC C200 C177 CC C210 C17 CC C hu C CC CC C213 C215 PROSCUTTO COTTO 3a C13 TAMPONE AMBENTALE GX6A CC C12 C14 GX6A CC C217 C15 GX6A CC C13 TAMPONE AMBENTA. C16 GX6A CC C14 C11 GX6A CC C15 C17 PROSCUTTO COTTO GX6A CC C C1 C19 PROSCUTTO COTTO PROSCUTTO COTTO GX6A GX6A CC CC C11 C17 PROSCUTTO COTTO C190 GX6A CC C1 PROSCUTTO COTTO C12 GX6A CC C19 PROSCUTTO COTTO 209hu 19hu GX6A GX6A CC CC C hu C192 GX6A CC1 245hu 4b C194 GX6A CC1 C170 SPEDN PANAT 4b C195 PROSCUTTO COTTO GX6A CC7 C C197 C19 C199 CARNE 3 a GX6A GX6A GX6A CC7 CC7 CC7 C172 C173 C175 C200 GX6A CC7 C176 C210 GX6A CC7 C C212 C215 PROSCUTTO COTTO 3 a GX6A GX6A CC7 CC7 C17 233hu. C217 GX6A CC3 C161 TAMPONE ATTREZZ C213 3 a GX6A CC3 C164 GORGONZOLA C hu PASTA ALMENTARE GX6A GX6A GX6A GX6A CC3 CC3 30hu. C169 TAMPONE ATTREZZ Concordanza p= 41,5 % (l.c.i.27,7% l.c.s. 56,7%)
9 ST7 100% prodotti ittici 1 ST1 Risultati della distribuzione di ST (MLST) in ZS A&M database % da prodotti e ambienti lattiero caseari ST ST29 3% prodotti ittici 57% prodotti a base di carne 5% tampone ambientale ST
10 Confronto tra i due metodi PFGE Costi non elevati (Pulsenet 25Euro, EURL 6 Euro). Protocolli sperimentali possono differire e rendere difficile la standardizzazione del metodo tra i laboratori. nterpretazioni soggettive possono condurre a risultati significativamente differenti quindi minore accuratezza dei risultati. Non immediata comparazione intra e inter laboratorio. Evidenzia le variazioni, lungo tutto il genoma, in particolari siti di taglio di determinati enzimi di restrizione. Capacità di risoluzione elevata per investigare un focolaio. Maggiore potere discriminante (Catinelli et al. (2013). nappropriato per studi filogenetici MLST Costi elevati (0 Euro). Differenti protocolli sperimentali non ostacolano la standardizzazione del metodo. Accuratezza dei risultati mmediata comparazione intra e inter laboratorio. Determina tutte le variazioni genetiche, che si accumulano lentamente, all interno di 7 specifici geni housekeeping. Capacità di risoluzione in una indagine molecolare più bassa. Ottimo per investigare relazioni filogenetiche. Conferma l appartenenza ad uno dei quattro lineage (-V) risultati possono essere trasmessi elettronicamente portando ad un ampliamento dei rispettivi database comuni internazionali.
11 CONCLUSON PFGE discriminante MLST. risultati mostrano un alta prevalenza di pulsotipi e ST da alimenti e ambienti di lavoro corrispondenti a quelli isolati da casi clinici umani. Nonostante il numero non elevato di ceppi analizzati si segnala una corrispondenza tra pulsotipi e ST matrice dipendenti. Bassa concordanza tra i due metodi.
12 GRAZE A TUTT PER L ATTENZONE!! Grazie a Vicdalia Acciari Federica Di Simone Antonella Pompei Marina Torresi Romolo Salini E tutto il personale del reparto di giene e tecnologie degli Alimenti e del Laboratorio LNR Lm
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