PROTEINE RICOMBINANTI
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- Annibale Salvatore
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1 PROTEINE RICOMBINANTI
2 PROTEINE RICOMBINANTI
3 TRASFORMAZIONE IN LIEVITO
4 VETTORI SHUTTLE
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7 PROTEINE RICOMBINANTI
8 Colture cellulari = propagazioni di cellule fuori dall organismo vantaggi: 1) l ambiente extracellulare puo essere manipolato 2) uso di un tipo cellulare ben definito 3) grandi quantita di cellule 4) studio di varie funzioni cellulari Due tipi di colture cellulari: 1) colture primarie 2) linee cellulari
9 Colture primarie cellule derivate direttamente da un tessuto Tecnica messa a punto nel 1907: 1 g Espianto di midollo spinale + Fluido linfatico Cellule con assoni che si sviluppano in coltura! Numero di divisioni limitato senescenza replicativa
10 Neuroni in vitro con prolungamenti
11 Linee cellulari Possono derivare da varie fonti: cellule trasformate in vitro (p.e. espressione di oncogene) espianti tumorali (posti in coltura crescono indefinatamente)
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13 differentiating muscle cell line = C2C12
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15 Vettore di espressione per cellule animali in coltura
16 Piccolo introne
17 G418 - GENETICIN Blocca la traduzione in tutti gli organismi
18 LIPOFEZIONE Si utilizzano liposomi caricati con i vettori di espressione
19 BACULOVIRUS Virus che infetta le larve di insetto Il promotore virale della poliedrina è molto potente! Virioni appena formati
20 DOMANDA FREQUENTE: QUALE E LA FUNZIONE DI UNA CERTA PROTEINA? OVERESPRESSIONE DELLA PROTEINA ESPRESSIONE ECTOPICA CON UN VETTORE DI ESPRESSIONE ABOLIZIONE DELLA ESPRESSIONE DELLA PROTEINA INTERFERENZA A RNA (RNAi) SI AUMENTA O SI DIMINUISCE L ESPRESSIONE DELLA PROTEINA ALLA RICERCA DI EVENTUALI VARIAZIONI FENOTIPICHE!
21 sirna Possibilità di modulare negativamente l espressione di specifici geni Somministrazione sperimentale di sirna FORTE RIDUZIONE DELL ESPRESSIONE DELLA PROTEINA
22 PROTEINE TERAPEUTICHE RICOMBINANTI DI PRIMA GENERAZIONE Proteine identiche a quelle naturali INSULINA ERITOPOIETINA G-CSF FATTORI ANTIEMOFILICI VACCINI RICOMBINANTI DI SECONDA GENERAZIONE Proteine che sono state manipolate (muteine) p.e. tpa, insulina ecc. VACCINI RICOMBINANTI ANTICORPI
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25 SIERI BOVINI O EQUINI Immunoglobuline da sieri di animali immunizzati con uno specifico antigene Siero antitetanico: animali trattati con la tossina del batterio Clostridium tetani
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27 Cellule tumorali (linfoma) immortale IBRIDOMA immortale
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29 Mouse Chimeric Humanized
30 Catena Leggera Catena Pesante
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34 ANTICORPI IN TERAPIA Blocco di interazioni ligando-recettore (p.e. estrogeni) Blocco di funzioni proteiche (p.e. oncogeni) Stimolo di segnalazione intracellulare (p.e. apoptosi) (sia anticorpi interi che frammenti) Reclutamento di componenti del sistema immunitario a seguito del binding (stimolo immunità cellulare) (anticorpi interi)
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39 MODELLI ANIMALI OVERESPRESSIONE DI UNA PROTEINA NORMALE O ESPRESSIONE DI UNA VERSIONE MUTATA (p.e. proto-oncogene attivato) Trasfezione di cellule in coltura Animali transgenici ABOLIZIONE DELL ESPRESSIONE DI UNA PROTEINA (p.e. malattie genetiche, oncosoppressori) RNAi in colture cellulari o in C.elegans Topi knock out MODELLI PER RICERCHE DI BASE MODELLI PER MALATTIE UMANE
40 ANIMALI TRANSGENICI POSSIBILI APPLICAZIONI PRODUTTIVE espressione di proteine ricombinanti nel latte di mammiferi (capre, bovini) Vettore con promotore tessuto-specifico per la ghiandola mammaria (CASEINA)
41 BLASTOCISTI TRASFEZIONE
42 Creazione del costrutto per la ricombinazione omologa Cellule ES Staminali embrionali: anipolazione in vitro (trasfezione) Inserimento nella blastocisti Topi chimerici 1 incrocio per genotipo -/+ 2 incrocio per genotipo -/-
43 RICOMBINAZIONE OMOLOGA Distruzione (interruzione) del gene bersaglio TRASCRIZIONE Inattiva attiva
44 Resistenza al G418
45 INCROCIO TRA CHIMERICO E BIANCO I TOPI NERI SONO ETEROZIGOTI KO ED ETEROZIGOTI B/N ( B recessivo ) 25% -/- B/N +/- 50% +/- 25% +/+ B/N +/-
46 INCROCIO TRA CHIMERICO E BIANCO I TOPI NERI SONO ETEROZIGOTI KO ED ETEROZIGOTI B/N ( B recessivo ) H = -
47 TECNICHE BIOCHIMICHE Western blot con IgG specifiche ANALISI DEL FENOTIPO ANALISI IMMUNOISTOCHIMICA con IgG specifiche
48 PROMOTORE DI VIRUS VEGETALE PIANTE TRANSGENICHE
49 CLONAGGIO DI ANIMALI Non è una tecnologia del DNA ricombinante
50 RIASSUMENDO
CLASSICHE GENETICA BIOTECNOLOGIE MODERNE BIOLOGIA CELLULARE TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE INGEGNERIA GENETICA
CLASSICHE BIOTECNOLOGIE GENETICA MODERNE BIOLOGIA CELLULARE TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE INGEGNERIA GENETICA BIOLOGIA MOLECOLARE BIOCHIMICA CREAZIONE A FINI MEDICI DI MICRO-ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI
DOMANDA FREQUENTE: QUALE E LA FUNZIONE DI UNA CERTA PROTEINA? SI AUMENTA O SI DIMINUISCE L ESPRESSIONE DELLA PROTEINA
DOMANDA FREQUENTE: QUALE E LA FUNZIONE DI UNA CERTA PROTEINA? OVERESPRESSIONE DELLA PROTEINA ESPRESSIONE ECTOPICA CON UN VETTORE DI ESPRESSIONE ABOLIZIONE DELLA ESPRESSIONE DELLA PROTEINA INTERFERENZA
Cromosoma del batterio donatore Trasferimento della ORF nel vettore di espressione PRODUZIONE DELLA PROTEINA RICOMBINANTE Abbondante e facilmente purificabile Contiene una ORF continua!! 5 NT non tradotto
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