4. Risultati e discussione 4. RISULTATI E DISCUSSIONE

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1 4. RISULTATI E DISCUSSIONE 61

2 4.1 Analisi delle tecnologie di produzione Sono stati campionati complessivamente 29 formaggi appartenenti alle tre tipologie considerate, 8 caprini, 12 pecorini e 9 caciotte, di cui 2 da latte bovino e 7 da latte misto (bovino ed ovino). Di questi, le produzioni ottenute con latte crudo locale (19 campioni) sono state prelevate presso caseifici artigianali distribuiti nelle varie province della regione Marche, mentre i formaggi a latte pastorizzato aggiunto di colture starter commerciali (10 campioni) sono stati acquistati presso supermercati della provincia di Ancona. Alcuni dei formaggi oggetto di studio sono risultati essere caratterizzati da tratti peculiari del loro processo di caseificazione, come ad esempio l impiego di caglio d origine vegetale (estratto acquoso di Cynara cardunculus), l aggiunta di ingredienti caratteristici (erbe aromatiche, olio d oliva, buccia di limone grattugiata), la stagionatura in botte o all interno di fosse tufacee. Parallelamente al campionamento, per ciascuna di queste produzioni, identificate con un codice alfanumerico, sono state raccolte informazioni relative agli ingredienti utilizzati, alla tecnologia di lavorazione ed alle condizioni di stagionatura (Tabella 4.1). Il tempo di maturazione dei formaggi analizzati è risultato essere variabile a seconda del tipo di formaggio in questione (morbido, semiduro o duro). In particolare, le caciotte sono risultate essere caratterizzate da un minor tempo di maturazione (2-4 settimane), come riportato per i formaggi della stessa tipologia (Ottogalli, 2001), mentre i formaggi appartenenti alle tipologie pecorino e caprino sono risultati essere caratterizzati da tempi di maturazione molto diversi che vanno da 2 settimane a 7 mesi (Ottogalli, 2001). 62

3 Tipologia di formaggio Caciotta Pecorino Caprino Tipo di latte utilizzato Latte crudo ovino e/o bovino Latte pastorizzato bovino ed ovino Latte crudo ovino Latte pastorizzato ovino Latte crudo caprino Latte pastorizzato caprino Codice del Stagionatura campione (in settimane) a1ca 4 - a2ca 3 Ingredienti e caratteristiche peculiari A latte bovino; aggiunta di olio d oliva di varietà Raggia (tipica della provincia di Ancona) alla cagliata a3ca 2 - a4ca 4 - a5ca 2 A latte bovino; aggiunta di olio d oliva di varietà Raggia (tipica della provincia di Ancona) alla cagliata i1ca 4 - i2ca 4 - i3ca 4 Casciotta d Urbino (prodotto DOP) Impiego di caglio d origine i4ca 3 vegetale (estratto acquoso di Cynara cardunculus) a1pe 16 - a2pe 16 - a3pe 8 - a4pe 2 - a5pe 28 - a6pe 3 - a7pe 28 a8pe 28 Conciato con erbe aromatiche e stagionato in barrique Stagionatura all interno di fosse tufacee i1pe 16 - i2pe 6 - i3pe 24 Stagionatura all interno di fosse tufacee Salatura a secco con sale i4pe 4 mischiato a buccia di limone grattugiata a1cp 28 Stagionatura all interno di fosse tufacee a2cp 2 - a3cp 28 Stagionatura all interno di fosse tufacee a4cp 20 - a5cp 32 Stagionatura all interno di fosse tufacee a6cp 2 - i1cp 28 - i2cp 28 - Tabella 4.1. Informazioni relative ai campioni di formaggio: ingredienti utilizzati, tecnologia di lavorazione e condizioni di stagionatura. 63

4 4.2 Analisi chimico-fisiche e microbiologiche I valori di ph ed attività dell'acqua (a w ) sono riportati in Tabella 4.2. Per quanto riguarda i valori di a w registrati, non sono state riscontrate differenze significative (P <0,05) fra i vari formaggi analizzati, indipendentemente dalla tipologia considerata o dalla tecnologia di produzione (impiego di latte crudo o pastorizzato), mentre valori di ph significativamente più alti sono stati osservati in un formaggio a latte crudo appartenente alla tipologia caprino (campione a2cp), dato correlabile al ridotto tempo di maturazione che caratterizza il prodotto stesso (2 settimane circa). I dati relativi alla composizione chimica dei formaggi sono riportati nella stessa Tabella 4.2. In generale, non sono emerse differenze significative tra le produzioni a latte crudo ed a latte pastorizzato ed i valori ottenuti sono risultati comparabili a quelli riportati da altri autori per formaggi appartenenti alle medesime tipologie (Beresford et al., 2001; Coda et al., 2006). In dettaglio, i valori relativi al contenuto proteico per le tipologie caciotta, pecorino e caprino sono risultati compresi, rispettivamente, fra 10,67-25,91, 9,76-29,98 e 14,59-31,89 g/100 g di prodotto. Il contenuto in NaCl è risultato piuttosto uniforme per tutti i formaggi analizzati e compreso fra 0,46-3,51 g/100 g. Infine, il contenuto lipidico di caciotte, pecorini e caprini è risultato compreso, rispettivamente, fra 19,19-29,01, 20,68-44,14 e 20,01-34,92 g/100 g di prodotto. 64

5 Codice campione ph a w NaCl (g su 100g di formaggio) Proteina grezza (g su 100g di formaggio) Lipidi (g su 100g di formaggio) N perossidi nella sostanza grassa (meqo 2 /Kg) a1ca 5.57 ±0.07 gh 0.93 ±0.02 ghij 1.85 ±0.01 hij ±2.73 ijkl ±0.54 ghijk 1.67 ±1.53 c a2ca 5.34 ±0.04 ij 0.98 ±0.01 abc 1.93 ±0.34 ghi ±0.45 jkl ±0.41 no 3.00 ±1.00 ab a3ca 5.26 ±0.01 jk 0.97 ±0.01 abcd 1.56 ±0.01 jkl ±0.02 kl ±0.01 mn 0.00 ±0.00 d a4ca 5.34 ±0.02 ij 0.98 ±0.00 abc 1.81 ±0.01 ij ±0.01 ijk ±0.01 jkl 0.00 ±0.00 d a5ca 5.72 ±0.011 f 0.97 ±0.00 abcd 1.95 ±0.00 ghi ±0.01 l ±0.01 p 0.00 ±0.00 d i1ca 5.36 ±0.05 ij 0.93 ±0.01 ghij 1.95 ±0.13 ghi ±2.26 hij ±0.17 hijk 2.00 ±0.00 bc i2ca 6.01 ±0.01 bc 0.94 ±0.01 efgh 1.87 ±0.01 ghij ±0.01 efg ±0.01 fghijk 0.00 ±0.00 d i3ca 5.57 ±0.01 gh 0.97 ±0.01 abcd 1.56 ±0.01 jkl ±0.01 hij ±0.01 efg 0.00 ±0.00 d i4ca 5.10 ±0.01 lm 0.98 ±0.01 abc 0.82 ±0.03 n ±0.53 n ±0.13 ijk 0.00 ±0.00 d a1pe 5.30 ±0.01 j 0.91 ±0.01 ijkl 2.04 ±0.04 efghi ±0.77 fg ±0.99 cd 3.67 ±0.58 a a2pe 5.55 ±0.01 gh 0.96 ±0.00 bcde 2.15±0.01 defgh ±0.01 ghi ±0.01 ef 0.00 ±0.00 d a3pe 5.38 ±0.02 ij 0.97 ±0.01 abcd 1.76 ±0.01 ijk ±0.01 def ±0.01 ghijk 0.00 ±0.00 d a4pe 5.54 ±0.01 gh 0.96 ±0.01 cdef 2.45 ±0.01 bcd ±0.01 fgh ±0.01 hijk 0.00 ±0.00 d a5pe 5.28 ±0.02 jk 0.90 ±0.01 kl 1.43 ±0.10 klm ±0.03 abc ±0.13 a 0.00 ±0.00 d a6pe 5.87 ±0.03 cde 0.98 ±0.01 ab 1.33 ±0.02 lm ±0.06 ijk ±0.34 op 0.00 ±0.00 d a7pe 5.89 ±0.04 bcde 0.89 ±0.01 l 3.51 ±0.23 a ±0.05 fg ±0.33 b 0.00 ±0.00 d a8pe 5.78 ±0.05 ef 0.92 ±0.00 hijk 1.41 ±0.10 lm ±0.04 cde ±0.01 bc 0.00 ±0.00 d i1pe 5.68 ±0.01 fg 0.93 ±0.00 ghij 2.51 ±0.13 bc ±0.00 efg ±0.32 lmn 0.00 ±0.00 d i2pe 5.48 ±0.00 hi 0.95 ±0.00 defg 1.97 ±0.01 fghi ±0.06 efg ±0.02 ghijk 0.00 ±0.00 d i3pe 5.30 ±0.02 j 0.93 ±0.02 fghi 2.19 ±0.05 cdefg ±0.12 jkl ±0.05 b 0.00 ±0.00 d i4pe 4.98 ±0.02 m 0.99 ±0.01 a 1.98 ±0.04 fghi 9.76 ±0.26 n ±0.05 jk 0.00 ±0.00 d a1cp 5.82 ±0.19 def 0.90 ±0.00 kl 1.43 ±0.11 klm ±1.47 ab ±3.45 fgh 3.67 ±0.58 a a2cp 6.52 ±0.01 a 0.98 ±0.00 abc 3.41 ±0.01 a ±0.01 m ±0.01 op 0.00 ±0.00 d a3cp 5.14 ±0.02 kl 0.91 ±0.01 jkl 2.31 ±0.01 bcdef ±0.03 a ±0.01 klm 0.00 ±0.00 d a4cp 5.95 ±0.01 bcd 0.91 ±0.01 jkl 0.46 ±0.01 o ±0.01 a ±0.01 fghi 0.00 ±0.00 d a5cp 5.89 ±0.04 bcde 0.92 ±0.00 hijk 2.32 ±0.04 bcde ±0.01 cde ±0.13 de 0.00 ±0.00 d a6cp 6.03 ±0.04 b 0.98 ±0.01 ab 1.12 ±0.13 mn 2014 ±0.33 jkl ±0.19 mn 0.00 ±0.00 d i1cp 5.57 ±0.08 gh 0.91 ±0.01 jkl 1.79 ±0.26 ij ±1.10 bcd ±0.81 b 3.67 ±0.58 a i2cp 5.28 ±0.02 jk 0.94 ±0.00 efgh 2.59 ±0.01 b ±0.01 jkl ±0.01 fghij 0.00 ±0.00 d Tabella 4.2: Risultati delle analisi chimico-fisiche. I dati sono espressi come valore medio ± la deviazione standard. All interno di ogni dato riferito a ciascun formaggio, i valori indicati con una stessa lettera(e) non sono significativamente diversi tra loro (P < 0.05). Tutte le produzioni in studio sono risultate conformi agli standard legislativi attualmente in vigore per i parametri igienico-sanitari considerati (D.P.R. 14/01/1997, n. 54). L assenza di Salmonella, Lysteria monocitogenes ed enterotossine stafilococciche è stata confermata sia nei formaggi a latte pastorizzato 65

6 che nei formaggi a latte crudo, rivelando che anche per questi ultimi il processo produttivo è avvenuto nel rispetto delle corrette prassi igieniche. I risultati delle conte vitali di lattobacilli, lattococchi mesofili e cocchi termofili e le relative deviazioni standard sono riportati nella Tabella 4.3; i valori ottenuti sono in accordo con quanto riportato per formaggi appartenenti alle medesime tipologie (De Angelis et al., 2001; Poznanski et al., 2004; Psoni et al., 2006; Dolci et al., 2008; Rantsiou et al., 2008; Alegrìa et al., 2009; Randazzo et al., 2010). Dall analisi ANOVA effettuata su questi dati è emerso che la tecnologia di produzione (impiego di latte crudo o pastorizzato) non influisce notevolmente sulla carica microbica del formaggio. In generale, le conte vitali di lattobacilli, lattococchi mesofili e cocchi termofili, alla fine del tempo di maturazione, sono risultate comprese fra 1,99-9,08, 3,01-10,39 e 3,26-9,19 log 10 CFU/g, rispettivamente. Più in dettaglio, differenze significative riguardo alla relativa abbondanza di ogni specifico gruppo microbico considerato sono state osservate per uno dei 29 formaggi analizzati (campione a3cp), che è risultato essere il più povero in carica microbica. Tale dato è correlabile con il lungo tempo di maturazione che caratterizza questo formaggio, corrispondente a circa 7 mesi, di cui gli ultimi 3 hanno luogo all interno di fosse tufacee. 66

7 Conte vitali (log 10 CFU/g) Codice campione Lattobacilli Lattococchi mesofili Cocchi termofili a1ca 8.45 ±0.05 abcd 9.01 ±0.20 bcd 7.79 ±0.34 cdef a2ca 8.00 ±1.32 bcdef 8.57 ±0.72 de 6.29 ±0.61 ghi a3ca 7.10 ±0.09 fgh 9.52 ±0.04 bc 9.19 ±0.04 a a4ca 7.21 ±0.09 efgh 8.97 ±0.04 bcd 5.54 ±0.02 ij a5ca 9.05 ±0.03 ab 9.13 ±0.03 bcd 7.87 ±0.13 bcdef i1ca 5.95 ±0.53 ij ±0.37 a 6.15 ±1.12 hi i2ca 5.53 ±0.30 j 9.18 ±0.06 bcd 4.64 ±0.01 jk i3ca 8.05 ±0.07 abcdef 9.44 ±0.21 bc 8.96 ±0.05 abc i4ca 9.02 ±0.08 ab 8.96 ±0.10 cd 9.17 ±0.10 a a1pe 8.14 ±0.30 abcdef 7.53 ±0.40 fgh 8.17 ±0.46 abcde a2pe 6.00 ±0.04 ij 8.17 ±0.09 ef 8.51 ±0.01 abcd a3pe 8.42 ±0.04 abcd 9.19 ±0.01 bcd 8.50 ±0.06 abcd a4pe 8.37 ±0.01 abcd 9.42 ±0.01 bc 8.05 ±0.05 abcdef a5pe 8.09 ±0.08 abcdef 7.36 ±0.12 gh 7.12 ±0.13 efgh a6pe 8.38 ±0.21 abcd 9.11 ±0.10 bcd 5.12 ±0.13 ij a7pe 7.17 ±0.15 fgh 8.12 ±0.13 efg 6.88 ±0.20 fgh a8pe 6.53 ±0.19 hij 3.15 ±0.13 k 3.48 ±0.21 kl i1pe 7.30 ±0.10 efgh 6.81 ±0.15 h 7.51 ±0.25 defg i2pe 8.24 ±0.02 abcde 7.49 ±0.13 fgh 8.44 ±0.02 abcd i3pe 6.00 ±0.05 ij 5.36 ±0.11 i 5.22 ±0.20 ij i4pe 9.08 ±0.18 a 9.38 ±0.15 bc 9.09 ±0.08 ab a1cp 6.48 ±0.79 hij 6.76 ±0.40 h 4.38 ±1.26 jkl a2cp 7.91 ±0.06 cdefg 9.76 ±0.11 ab 8.36 ±0.01 abcd a3cp 1.99 ±0.02 k 3.01 ±0.01 k 3.26 ±0.26 l a4cp 7.48 ±0.05 defgh 8.09 ±0.01 efg 7.73 ±017 def a5cp 6.63 ±0.10 hi 4.47 ±0.20 j 7.87 ±0.09 bcdef a6cp 8.65 ±0.12 abc 9.34 ±0.10 bcd 8.20 ±0.20 abcde i1cp 7.22 ±0.33 efgh 6.78 ±0.67 h 6.04 ±0.48 hi i2cp 6.94 ±0.02 ghi 5.70 ±0.14 i 6.15 ±0.11 hi Tabella 4.3: Risultati delle analisi microbiologiche. I dati sono espressi come valore medio ± la deviazione standard. All interno di ogni dato riferito a ciascun formaggio, i valori indicati con una stessa lettera(e) non sono significativamente diversi tra loro (P < 0.05). 67

8 4.3 Analisi PCR-DGGE Costruzione del ladder Al fine di identificare preliminarmente le specie microbiche presenti nei campioni di formaggio in esame, è stato costruito un ladder di riferimento. Tre colture pure di batteri lattici, ascritti alle specie Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactobacillus brevis e Streptococcus thermophilus, i cui ampliconi ottenuti con i primer U968-f e L1401r hanno prodotto su gel profili costituiti da una singola banda, sono stati selezionati per la preparazione di questo ladder di identificazione (Figura 4.1). Figura 4.1 Profili DGGE degli ampliconi ottenuti dalle 3 colture pure di riferimento. L-Ladder mix; 53-St. thermophilus DSMZ 20617; 20- Lc. lactis ssp. lactis DSMZ 20729; 15-Lb. brevis NCIMB Analisi PCR-DGGE dei formaggi Al fine di ottenere un quadro globale dell ecologia microbica dei 29 formaggi analizzati, nel presente studio è stata impiegata la tecnica PCR-DGGE, che consente di separare frammenti di DNA di pari lunghezza ma con differente sequenza nucleotidica, quali sono gli ampliconi della porzione compresa tra le regioni variabili V6 e V8 del gene batterico per il 16S rrna. A tal fine, è stato applicato l approccio polifasico proposto per la prima volta da Ercolini e collaboratori (2001), relativo allo studio dell ecologia microbica di siero-innesti destinati alla produzione di Mozzarella di Bufala, un formaggio tipico del sud Italia, protetto da marchio DOP e prodotto con latte crudo, caglio e siero derivante da produzioni precedenti. In tale indagine, il DNA microbico è stato estratto sia dai bulk delle colonie sviluppatesi su appropriati terreni selettivi, sia dai campioni di siero-innesto. La regione V3 del gene per il 16S rrna è stata amplificata mediante PCR; gli ampliconi sono stati, quindi, separati mediante elettroforesi in gradiente denaturante (DGGE). 68

9 Nonostante le grandi potenzialità di tale duplice approccio nello studio della diversità microbica presente nelle produzioni lattiero-casearie, questo è stato applicato soltanto in un numero abbastanza limitato di ricerche relative all ecologia microbica di formaggi tradizionali (Ercolini et al., 2003; Ercolini et al., 2004; Van Hoorde et al., 2008). Nella maggior parte di questi studi, inoltre, l analisi PCR-DGGE dei bulk di colonie batteriche si è limitata alla raccolta della patina batterica sviluppatasi nelle sole piastre contabili (corrispondenti solitamente alle diluizioni seriali 10-6 o 10-7 ) (Ercolini et al., 2003; Ercolini et al., 2004), mentre soltanto in un caso l analisi è stata condotta anche sulla patina batterica sviluppatasi sulle piastre corrispondenti alla diluizione 10-1 (Van Hoorde et al., 2008). In Tabella 4.4 sono riportati i risultati dell analisi DGGE effettuata sugli ampliconi ottenuti a partire dal DNA estratto direttamente da matrice e dai bulk di colonie di batteri lattici raccolti dai diversi terreni selettivi. 69

10 St. thermophilus Lc. lactis Lc. raffinolactis Lb. casei sensu latu Lb. rhamnosus Lb. coryniformis Lb. brevis Lb. fermentum Lb. plantarum Lb. acidophilus Lb. sakei/curvatus Lb. homoiochii Lb. delbrueckii M. caseolyticus E. italicus St. macedonicus Leu. mesenteroides Lb. zeae E. faecium/faecalis Carnobacterium sp. Latte crudo Latte pastorizzato Caciotta Latte crudo Latte pastorizzato Pecorino Latte crudo Latte pastorizzato Caprino Tabella 4.4. Mappa dell ecologia microbica dei formaggi in studio, valutata attraverso l analisi PCR-DGGE sia del DNA estratto da matrice che del DNA estratto dai pool di colonie sviluppatesi su opportuni mezzi colturali. 70

11 I campioni di formaggio sottoposti ad analisi hanno mostrato, in generale, profili DGGE molto diversi fra loro; ciò è indice della grande variabilità nella composizione della popolazione microbica che li caratterizza. Soltanto poche specie sono state individuate in quasi tutti i campioni, suggerendo così l importanza della loro presenza nelle fasi di produzione e maturazione del formaggio. Come atteso, le specie Streptococcus thermophilus e Lactococcus lactis sono risultate dominare la popolazione microbica dei formaggi prodotti con latte pastorizzato aggiunto di colture starter commerciali; la specie St. thermophilus, tradizionalmente utilizzata per la formulazione di starter caseari, è stata spesso identificata in colture naturali di latte o siero, dato questo che dimostra l effettiva selezione di specie termofile e termotolleranti nel latte termizzato. Le medesime specie sono state individuate comunque anche in quasi tutte le produzioni a latte crudo, a conferma della loro presenza sia nel latte crudo che negli ambienti di caseificazione. La presenza di Lc. lactis e di St. thermophilus nei vari formaggi analizzati, indipendentemente dal luogo di campionamento e dalla tecnologia di produzione applicata, indica che il processo produttivo e le condizioni nelle quali avviene la stagionatura ci consentono in ogni caso di individuare tali specie nel prodotto finito (Coppola et al., 1988; Cogan et al., 1997; Beresford et al., 2001; Andrighetto et al., 2002; Lombardi et al., 2004; Pacini et al., 2006; Randazzo et al., 2006, 2008). Inoltre, anche le specie appartenenti al gruppo Lb. casei sensu latu, vale a dire Lb. casei, Lb. paracasei e Lb. rhamnosus, che non possono essere distinte mediante analisi PCR-DGGE (Felis e Dellaglio, 2007; Chen et al., 2008), sono risultate dominanti sia nelle produzioni a latte crudo che in quelle a latte pastorizzato. I rappresentanti del genere Lactobacillus contribuiscono significativamente alla caratterizzazione del profilo aromatico dei formaggi, grazie alla produzione di brevi peptidi, acidi grassi e amminoacidi liberi (Albenzio et al., 2001). In particolare, la specie Lb. casei e le specie ad essa correlate sono importanti nella fase di maturazione, grazie all elevata attività peptidasica ed alla capacità di metabolizzare amminoacidi con produzione di composti aromatici. Nei formaggi a latte crudo appartenenti a ciascuna delle tre tipologie considerate sono state individuate la specie Lb. brevis e specie appartenenti al genere Enterococcus. Mentre la specie St. thermophilus è tradizionalmente impiegata per la formulazione di starter caseari, più dibattuto è l impiego di rappresentanti del genere Enterococcus nelle trasformazioni casearie (Giraffa, 2003). Il loro ruolo nel processo di fermentazione e maturazione del formaggio non è comunque da sottovalutare, in quanto questi microrganismi sono caratterizzati da un elevato potere proteolitico. Essendo molto resistenti al sale 71

12 e diffusi nell ambiente, gli enterococchi sono stati spesso isolati da produzioni casearie artigianali e tipiche dei Paesi mediterranei (Sarantinopoulos et al., 2001; Giraffa, 2003; Fortina et al., 2004, 2008), compresi formaggi caprini (Arizcun et al., 1997; Suzzi et al., 2000). Oltre alle specie microbiche finora citate, ne sono state identificate numerose altre. In dettaglio, le specie Leuconostoc mesenteroides e Lc. raffinolactis sono state ritrovate nelle produzioni a latte crudo di caciotta. Specie microbiche differenti sono state individuate nelle caciotte a latte pastorizzato, corrispondenti a Lb. sakei/curvatus, Lb. acidophilus, Lb. delbrueckii e Lb. zeae. La specie Lb. delbrueckii, insieme alla specie Lb. casei, caratteristiche dell ambiente di caseificazione (Randazzo et al., 2002; Coppola et al., 2003; Florez e Mayo, 2006) sono già state precedentemente isolate dal formaggio Castelmagno DOP prodotto con latte crudo bovino (Dolci et al., 2008), mentre la specie Lc. raffinolactis è stata individuata, mediante analisi PCR-DGGE, nel siero-innesto naturale utilizzato per la produzione del Caciocavallo Silano DOP (Ercolini et al., 2008). Relativamente alle produzioni di pecorino, oltre alla presenza di Lc. lactis, St. thermophilus e Lb. casei sensu latu, rilevate anche nelle produzioni a latte crudo e pastorizzato appartenenti alle altre due tipologie considerate, sono emerse alcune interessanti differenze nella composizione della popolazione microbica. In particolare, i pecorini a latte crudo sono risultati caratterizzati dalla presenza di specie lattiche non starter (NSLAB), rappresentate da Lb. brevis, St. macedonicus, Lb. plantarum, Lb. fermentum, Lb. coryniformis, Leu. mesenteroides ed E. faecium/faecalis. Nell industria lattiero-casearia, la specie Leu. mesenteroides viene spesso utilizzata in colture miste o in colture a composizione definita per la produzione di creme fermentate e formaggi, in associazione con Lc. lactis. La presenza di Leu. mesenteroides nel formaggio può determinare una lieve occhiatura, grazie alla produzione di CO 2 attraverso la fermentazione degli zuccheri e del citrato. Riguardo alla specie Lb. plantarum, questa è già stata isolata in precedenza da produzioni di pecorino a latte crudo della regione Marche (Aquilanti et al., 2007) e da altre produzioni italiane di pecorino (De Angelis et al., 2001; Coda et al., 2006; Randazzo et al., 2006; Babini et al., 2008); studi recenti hanno dimostrato la capacità di colture aggiuntive di Lb. plantarum di intensificare l aroma del formaggio (Antonsson et al., 2003). La specie St. macedonicus è stata isolata per la prima volta dal formaggio greco a fermentazione naturale Kasseri (Tsakalidou et al., 1998) e successivamente da altri formaggi (Callon et al., 2004; Lombardi et al., 2004). L esatto ruolo svolto da questa specie nel processo di fermentazione e maturazione del formaggio 72

13 non è ancora del tutto chiaro. Studi condotti su ceppi di St. macedonicus ne hanno rivelato la limitata capacità acidificante e proteolitica, pertanto essa è stata indicata come poco adatta per la formulazione di starter caseari (Georgialaki et al., 2002). Tuttavia, grazie alla notevole attività lipolitica e peptidasica (Georgialaki et al., 2002), la capacità di produrre esopolisaccaridi (Vincent et al., 2001) e batteriocine ad ampio spettro di azione (Georgialaki et al., 2002), questa specie è stata proposta da alcuni autori per la formulazione di colture aggiuntive. Nelle produzioni di pecorino a latte pastorizzato, sono state identificate le specie Leu. mesenteroides, Lb. zeae, M. caseolyticus e Lb. rhamnosus. Le due specie Lb. fermentum e Lb. rhamnosus, riscontrate, rispettivamente, nelle produzioni a latte crudo e pastorizzato di pecorino, sono state frequentemente individuate nei formaggi d origine italiana e spagnola prodotti con latte ovino (De Angelis et al., 2001; Abriouel et al., 2008; Martin Platero et al., 2008; Randazzo et al., 2010). Riguardo alle otto produzioni di formaggi a latte caprino analizzate, anche per esse sono state riscontrate comunità microbiche costituite da specie differenti. Come atteso, oltre alle specie Lc. lactis, St. thermophilus e Lb. casei sensu latu, le produzioni a latte crudo di caprino sono risultate essere caratterizzate da numerose specie lattiche non starter, tra cui Lb. brevis, Lb. fermentum, Lb. homoiochii, M caseolyticus, St. macedonicus, Leu. mesenteroides ed Enteorcoccus faecium / faecalis; i caprini a latte pastorizzato sono risultati invece caratterizzati dalle specie Lc. lactis e St. thermophilus e dalle specie appartenenti al gruppo Lb. casei sensu latu. La maggior parte delle specie lattiche identificate nei formaggi appartenenti alla tipologia caprino sono già state precedentemente individuate in vari formaggi prodotti con latte di capra: la specie Leu. mesenteroides è stata rilevata mediante PCR-DGGE nel Bukuljac (Nikolic et al., 2008), un formaggio della tradizione serba prodotto artigianalmente con latte di capra termizzato senza aggiunta di colture starter, mentre le specie St. thermophilus, Lb. brevis, Lb. casei e Lc. lactis sono state rilevate nelle produzioni sia artigianali che industriali di formaggio Feta (Rantsiou et al., 2008). In particolare, la specie Lc. lactis, ampiamente diffusa nei prodotti lattiero-caseari, è già stata precedentemente isolata da formaggi a latte di capra, come l Avenato (Hatzikamari et al., 1999) ed una caciotta tipica dell isola di Capraia (Cerri et al., 2006). I risultati ottenuti sono in linea con quanto riportato in precedenti studi relativi alla caratterizzazione microbiologica di formaggi tradizionali prodotti con latte crudo o pastorizzato, nei quali sono state rilevate popolazioni microbiche alquanto complesse. Nei formaggi a latte crudo, la presenza di NSLAB è 73

14 dovuta principalmente alla naturale contaminazione del latte, mentre nei formaggi a latte pastorizzato, la loro presenza potrebbe essere ricondotta ad una contaminazione ambientale del latte successiva alla pastorizzazione o alla sopravvivenza dei batteri dovuta alla scarsa efficacia della pastorizzazione stessa (Beresford et al., 2001). In generale, il numero di specie lattiche non starter è risultato essere più elevato nei formaggi a latte crudo ed in quelli caratterizzati da lunghi tempi di stagionatura (McSweeney, 2004) a conferma dell elevata complessità microbica di tali produzioni, spesso caratterizzate da una flora avventizia non starter, importante, in fase di maturazione, per la produzione di composti aromatici (Albenzio et al., 2001); tuttavia, la presenza di numerose specie NSLAB in tutti i formaggi oggetto di studio, sia a latte crudo che a latte pastorizzato, conferma il buon livello di adattamento di questi microrganismi all ambiente di caseificazione, caratterizzato da elevate concentrazioni saline, bassi valori di ph e carenza di nutrienti (De Angelis et al., 2001; Coda et al., 2006). Complessivamente, il duplice approccio di analisi PCR-DGGE sul DNA estratto da matrice e dai bulk di colonie raccolte alle diverse diluizioni è risultato estremamente utile per meglio definire le componenti della popolazione filo-casearia delle produzioni in studio. La popolazione dei microrganismi coltivabili, è risultata essere, infatti, più ricca rispetto a quella determinata tramite l approccio coltura indipendente. Questo potrebbe essere giustificato dall effetto mascherante del DNA estratto da matrice in cui soltanto poche specie sono predominanti e quindi dalla competizione tra i templati durante la fase di amplificazione; ciò determina la mancata visualizzazione delle specie presenti in minore quantità nel prodotto, che possono invece essere rilevate dall analisi del DNA estratto dai pool di colonie sviluppatesi su diversi terreni selettivi (Ercolini et al., 2004). In linea con la recente evoluzione degli obiettivi delle ricerche volte ad investigare l ecologia microbica e le dinamiche di popolazione negli alimenti fermentati, il presente lavoro testimonia l elevata potenzialità della PCR-DGGE nella definizione della diversità microbica delle produzioni in studio. I risultati ottenuti sottolineano inoltre l importanza dell uso di un approccio polifasico, basato sia su metodi colturadipendenti che -indipendenti, per lo studio di specifici ecosistemi alimentari. 74

15 4.4 Analisi SPME-GC Analisi delle soluzioni standard L analisi gas-cromatografica delle soluzioni in N-esano dei singoli composti standard ha permesso di individuare il tempo di ritenzione di ciascuno di essi (Tabella 4.5). In Figura 4.2 è riportato, a titolo di esempio, il cromatogramma della soluzione di acido caprico. Composto Tempo di ritenzione Etilacetato 3 Acetone 4 Etanolo 4 Acido acetico 17 Acido butirrico 21 Acido caproico 27 Acido enantico 29 Acido caprilico 32 Acido pelargonio 34 Acido caprico 36 Acido undecanoico 38 Acido undecenoico 39 Acido laurico 40 Tabella 4.5 Tempi di ritenzione corrispondenti a ciascuno dei composti presi in esame. Figura 4.2 Cromatogramma dell acido caprico iniettato singolarmente. 75

16 4.4.2 Analisi del profilo aromatico dei formaggi L analisi SPME-GC applicata nel presente studio, è stata effettuata al fine di valutare la presenza e la relativa abbondanza di etilacetato, acetone, etanolo e di 10 differenti acidi grassi nei 29 campioni di formaggio considerati. Tale tecnica è stata impiegata anche in precedenti studi per la caratterizzazione del profilo volatile di diversi formaggi europei (Favaro et al., 2005; Coda et al., 2006; Poveda e Cabezas, 2006; Randazzo et al., 2008). Da tale analisi è emersa un evidente variabilità fra le tre tipologie di formaggio in studio, ottenute a partire da materie prime differenti e con diverse tecnologie di produzione. Per ciascun composto volatile è stata effettuata una valutazione semi-quantitativa, ottenuta calcolando il valore medio di tre misurazioni indipendenti dell area dei picchi relativi ad un determinato composto, visibili nei cromatogrammi ottenuti dai vari campioni di formaggio. Come atteso, il quantitativo di composti volatili è risultato essere superiore nei formaggi a latte crudo, indipendentemente dalla tipologia considerata (Figura 4.3) (Buchin et al., 1998) e notevolmente diverso da un campione all altro. Ciò può essere ricondotto ad alcune differenze nel processo di caseificazione (ingredienti utilizzati, tempi di stagionatura e condizioni nelle quali questa avviene), al tipo di latte utilizzato (Poveda e Cabezas, 2006), così come ai microrganismi presenti nel formaggio stesso (Pinho et al., 2003). Per tali motivi, i formaggi a latte crudo hanno un aroma più intenso ma decisamente meno uniforme rispetto ai formaggi a latte pastorizzato (Beuvier, 1990). Peak area ,00 50*10 5 ethylacetate Etilacetato ,00 45*10 5 acetone/ethanol Acetone/Etanolo acetic Acido acid acetico ,00 40*10 5 butyric Acido acid butirrico ,00 35*10 5 caproic Acido acid caproico Peak area ,00 30* ,00 25* ,00 20* ,00 15* ,00 10* ,00 5*10 5 0,00 Latte raw milk crudo pasteurized Latte milk Latte raw milk crudo pasteurized Latte milk Latte raw milk crudo pasteurized Latte milk pastorizzato pastorizzato pastorizzato Caciotta cheeses Pecorino cheeses Caprino cheeses Caciotta Pecorino Caprino enanthic Acido enantico acid caprylic Acido acid caprilico pelargonic Acido pelargonico acid capric Acido acid caprico undecanoic Acido undecanoico acid undecenoic Acido undecenoico acid lauric Acido acid laurico Figura 4.3: valutazione semi-quantitativa dei composti volatili identificati mediante analisi SPME-GC. 76

17 In dettaglio, i formaggi appartenenti alla tipologia caprino sono risultati caratterizzati dal più alto contenuto in composti volatili, contrariamente alle caciotte, per le quali sono stati rilevati quantitativi di composti volatili decisamente più bassi. Gli acidi butirrico, caproico, caprilico e caprico sono risultati essere i più abbondanti in assoluto nei formaggi analizzati, in accordo con quanto riportato da altri autori (Pinho et al., 2001; Coda et al., 2006; Randazzo et al., 2008, 2010). L acido butirrico, che è stato individuato in ciascuno dei 29 campioni sottoposti ad analisi, conferisce al formaggio un aroma particolarmente forte e penetrante e gioca un ruolo fondamentale nella frazione volatile di molti formaggi come il Camembert, il Cheddar, il Grana Padano, il Pecorino Ragusano e il Roncal (Curioni e Bosset, 2002). L acido caproico è un composto volatile caratteristico del Grana Padano, mentre gli acidi caprilico e caprico sono annoverati tra i composti aromatici più importanti del formaggio Roncal (Curioni e Bosset, 2002). Oltre a tali composti, anche se in quantità minori, ciascuna delle tre tipologie di formaggio, sia a latte crudo che a latte pastorizzato, è risultata essere caratterizzata dalla presenza dell acido undecenoico. Acetone, etanolo e piccole quantità di acido acetico sono stati riscontrati in tutte e tre le tipologie di formaggi a latte crudo e in due delle tre tipologie a latte pastorizzato (pecorino e caprino); l etanolo, già precedentemente riscontrato in altri formaggi pecorini della regione Marche (Coda et al., 2006), è un composto associato ad una nota alcolica e floreale, mentre l acido acetico conferisce un tipico odore di aceto ed è uno dei principali composti aromatici dei formaggi Cheddar, Gruyère, Roncal ed Emmenthal (Curioni e Bosset, 2002). L acido undecanoico è stato rilevato, peraltro in modeste quantità, soltanto nei formaggi caprini a latte crudo, mentre l acido laurico, comunemente associato al tipico aroma di grasso (Sablé e Cottenceau, 1999), è risultato caratterizzare soltanto le caciotte a latte crudo. Infine, l acido pelargonico, che è stato ritrovato in quantità elevate esclusivamente nei campioni di caprino a latte crudo, contribuisce fortemente all insorgenza del tipico odore di capra caratteristico di tali produzioni (Le Quéré et al., 1996). Ogni composto volatile determina, nel prodotto finito, una caratteristica nota odorosa: per questo motivo contribuisce direttamente alla definizione dell aroma tipico del formaggio; tuttavia, in alcuni casi, se presente in concentrazioni eccessive, può causare l insorgenza di odori sgradevoli (ad esempio, di rancido) (Sablé e Cottenceau, 1999). I composti volatili possono conferire direttamente un aroma caratteristico al prodotto stesso o essere a loro volta precursori di altri composti aromatici (ad esempio composti carbonilici, alcoli, alcani ed esteri) (Forss, 1979). 77

18 Gli acidi grassi liberi (FFA) derivano generalmente da eventi lipolitici, determinati dalle lipasi presenti nel latte stesso (nel caso di formaggi a latte crudo) o dall azione delle lipasi di origine microbica presenti nelle muffe e nei batteri lattici, soprattutto NSLAB (Molimard e Spinnler, 1996; McSweeney e Sousa, 2000; Curioni e Bosset, 2002). Poiché l analisi PCR-DGGE ha rivelato la presenza di NSLAB in tutti i formaggi in studio, a prescindere dalla tipologia considerata e dall impiego di latte crudo o pastorizzato, la presenza di quantitativi maggiori di composti volatili nelle produzioni a latte crudo analizzate è probabilmente dovuta sia all azione delle lipasi indigene del latte stesso che alle specie lattiche non starter, incluse quelle del genere Enterococcus, che sono state individuate esclusivamente nei formaggi a latte crudo e sono note per la loro intensa attività lipolitica. Sebbene la presenza degli enterococchi nei prodotti lattiero-caseari sia considerata indice di condizioni igienico-sanitarie carenti, è stato dimostrato che essi rappresentano spesso una componente rilevante delle comunità microbiche delle produzioni artigianali e determinati ceppi, in alcuni formaggi, possono contribuire positivamente allo sviluppo dell aroma nel corso del processo di maturazione (Giraffa, 2003; Morandi et al., 2006). 4.5 Analisi statistica: PCA (Principal Component Analysis) e PLS-DA (Partial Least Squares-Discriminant Analysis) In tutti i casi in cui le variabili sono numerose e talvolta anche correlate tra loro, l utilizzo dei metodi chemiometrici può aiutare a fornire una visione globale del sistema analizzato, evidenziando le relazioni tra le variabili considerate e l importanza relativa di ciascuna di esse, e può inoltre mettere in evidenza le relazioni tra i campioni in base alla loro distribuzione nello spazio multi-dimensionale descritto dall insieme delle variabili. Il mancato utilizzo di questi metodi può causare la perdita di parte dell informazione che può essere estratta dai dati in nostro possesso, in quanto non vengono considerati gli effetti multivariati, sinergici ed antagonisti che possono essere messi in evidenza solo utilizzando tecniche di analisi multivariata, come la PCA (Principal Component Analysis) e la PLS-DA (Partial Least Squares-Discriminant Analysis). In particolare, queste tecniche di analisi sono finalizzate ad estrarre la massima informazione possibile contenuta in una struttura di dati multivariati, sintetizzandola in poche combinazioni lineari delle variabili stesse. Questi metodi vengono frequentemente impiegati nella prima fase di elaborazione dei dati e servono a dare una visione generale del problema, a capire le relazioni tra gli oggetti e/o le classi 78

19 considerate ed a fornire un indicazione preliminare sul ruolo delle variabili, mettendo eventualmente in luce la possibilità di eliminarne alcune che, essendo strettamente correlate tra loro, portano informazioni simili e possono quindi essere considerate ridondanti. Dal punto di vista geometrico, la PCA consiste in un processo di rotazione dei dati originali, effettuato in modo che il primo nuovo asse (che costituirà la prima componente principale) sia orientato nella direzione di massima varianza dei dati, il secondo sia perpendicolare al primo e sia nella direzione della successiva massima varianza dei dati, e così di seguito per tutti i nuovi assi. Il numero di questi nuovi assi (le componenti principali, PC) sarà quindi pari al numero di variabili originali. Poiché le componenti principali sono gli assi relativi alle direzioni di massima varianza, in ordine via via decrescente, la prima componente principale sarà in grado di spiegare la maggior percentuale di varianza, la seconda ne spiegherà un po meno, la terza ancora meno e così via, fino a che le ultime componenti contribuiranno a spiegare poco o nulla della variabilità presente nei dati in esame. In questi casi è quindi possibile eliminare parte della variabilità residua (e quindi anche parte del rumore che accompagna l informazione rilevante) prendendo in considerazione solo un numero di componenti minore del numero delle variabili originali. Un aspetto di grande rilevanza nell analisi multivariata riguarda la possibilità di vedere graficamente i dati. Nel caso specifico, i dati ottenuti mediante analisi chimico-fisiche, microbiologiche e gascromatografiche sono stati sottoposti ad analisi PCA (Principal Component Analysis) e PLS-DA (Partial Least Squares-Discriminant Analysis) con le seguenti finalità: esplorazione iniziale dei dati; evidenziazione dell esistenza di gruppi omogenei di campioni non classificati a priori (cluster analysis); evidenziazione di variabili utili ai fini della identificazione /discriminazione delle diverse tipologie di formaggio (caciotta, pecorino, caprino); identificazione di marcatori chimico-fisici, microbiologici, o aromatici utili ai fini della caratterizzazione delle produzioni oggetto di studio. E stato possibile visualizzare il risultato di tale elaborazione statistica sia attraverso uno score plot, nel quale ogni punto rappresenta un singolo campione di formaggio, sia attraverso un loading plot, nel quale ogni punto rappresenta una singola variabile; quest ultimo tipo di analisi permette l individuazione delle variabili che determinano la separazione e/o il raggruppamento dei campioni fra loro ed inoltre consente 79

20 di verificare quali variabili incidono maggiormente nella eventuale clusterizzazione osservata per i campioni analizzati. L analisi multivariata mediante PCA ha prodotto un modello a due componenti che spiega il 31,5% della varianza. Attraverso l analisi dello score plot t1/t2, le tre tipologie di formaggio sono risultate ben separate fra loro; al contrario, non è stato possibile separare i formaggi sulla base del processo produttivo (impiego di latte crudo o pastorizzato) indipendentemente dalla tipologia considerata (caciotta, pecorino e caprino) (Figura 4.4). Caprini stagionati in fossa Caprini Pecorini Caciotte Figura 4.4 PCA score plot Anche l analisi PLS-DA ha prodotto un modello a due componenti che spiega il 28,3% della varianza. Dall analisi dello score plot t1/t2 le tre tipologie di formaggio sono risultate ben separate fra loro, in maniera ancora più netta rispetto a quanto osservato mediante l analisi PCA (Figura 4.5). Anche in tal caso, non è stato comunque possibile separare i formaggi sulla base del processo produttivo. 80

21 Caprini stagionati in fossa Caprini Pecorini Caciotte Figura 4.5 PLS-DA score plot In entrambi i casi (PCA e PLS-DA score plots) si è potuto osservare che due formaggi appartenenti alla tipologia caprino (campioni a1cp ed a3cp) si sono posizionati lontano rispetto a tutti gli altri campioni (Figure 4.4 e 4.5). Questa loro disposizione potrebbe essere attribuita alla loro notevole abbondanza in composti volatili, aspetto verosimilmente correlato alle particolari condizioni di stagionatura a cui questi due caprini sono stati sottoposti: la fase finale del loro processo di maturazione ha luogo, infatti, all interno di fosse tufacee, periodo durante il quale si ha lo sviluppo, visibile a livello della crosta, di una peculiare flora eumicetica, caratterizzata, come noto, da una maggiore attività lipolitica rispetto alla microflora lattica (Malacarne et al., 2006; Quinto et al., 2007). Dall analisi del loading plot di PCA e PLS-DA è stato possibile, in entrambi i casi, evidenziare tre gruppi di variabili; nello specifico, le variabili relative al profilo aromatico sono risultate responsabili della distinzione dei formaggi appartenenti alla tipologia caprino ; quelle relative a conte microbiche, proprietà chimico-fisiche e composizionali hanno permesso di separare i formaggi appartenenti alla tipologia caciotta ; infine, le variabili relative all ecologia microbica sono risultate utili per discriminare i formaggi appartenenti alla tipologia pecorino (Figure 4.6 e 4.7). 81

22 Variabili relative al profilo aromatico Variabili relative alla composizione della microflora fermentante Figura 4.6 PCA loading plot Variabili relative a conte microbiche, proprietà chimico-fisiche e composizionali Variabili relative al profilo aromatico Variabili relative alla composizione della microflora fermentante Figura 4.7 PLS-DA loading plot Variabili relative a conte microbiche, proprietà chimico-fisiche e composizionali 82

23 Nel loading plot corrispondente all analisi PLS-DA (Figura 4.7), la distribuzione triangolare delle tre variabili fittizie (in rosso all interno del grafico) era attesa, sulla base della natura 0/1 della maggior parte delle variabili considerate. Inoltre, in tale grafico è stato possibile notare che una serie di descrittori relativi alla definizione della frazione volatile, in particolare acetone, etanolo, acido acetico, butirrico, caproico, enantico, caprilico, caprico, undecanoico ed undecenoico (cerchiati in verde), si sono disposti in prossimità di una delle tre variabili fittizie. Come noto, i descrittori vicini a tali variabili contribuiscono fortemente alla formazione dei gruppi osservata nello score plot. Una stima quantitativa del potere discriminante di tali variabili è effettuabile osservando il VIP plot (variable influence on projection), dove emerge che differenti variabili relative a differenti proprietà hanno un influenza più o meno forte sulla clusterizzazione dei formaggi analizzati. Le analisi PCA e, in misura maggiore, PLS-DA sull insieme dei dati ottenuti dalle analisi microbiologiche, chimico-fisiche e relative al profilo aromatico hanno dunque portato ad una netta distinzione delle tre tipologie di formaggio considerate ma non hanno permesso una separazione delle produzioni in studio sulla base del processo di caseificazione (impiego di latte crudo o pastorizzato). L approccio polifasico utilizzato ha comunque permesso, nel complesso, di raggiungere una caratterizzazione esaustiva dei formaggi considerati, nonché di identificare marcatori utili per una loro discriminazione oggettiva. 4.6 Consumer test I profili sensoriali risultanti dal Consumer test condotto su una parte delle produzioni in studio sono mostrati nei grafici rappresentati in Figura 4.8 a,b,c,d e derivano dalla media dei risultati ottenuti per i parametri valutati per ciascun formaggio. Caprino Relativamente all aspetto globale, le due produzioni messe a confronto non hanno mostrato discrepanze significative; viceversa, per i parametri gradevolezza globale dell odore e gradevolezza globale al gusto, la produzione a latte pastorizzato ha ottenuto punteggi maggiori rispetto a quella a latte crudo, nella quale sono stati percepiti più intensamente i descrittori odore di capra e odore di acido ; quest ultimo dato non sembra essere correlato all effettivo contenuto in acido caprilico e caproico, rinvenuti entrambi in quantità elevate attraverso le analisi SPME-GC. Nella produzione a latte crudo, inoltre, sono stati percepiti con maggiore intensità i descrittori salato, amaro, acido e piccante : 83

24 mentre per i primi due descrittori non è possibile effettuare correlazioni con i dati compositivi ed aromatici, la maggiore percezione della nota piccante nella produzione a latte crudo potrebbe verosimilmente essere legata al suo maggior contenuto in acido acetico, di solito responsabile dell aroma pungente nelle produzioni casearie (Pérès et al., 2001). Di contro, nella produzione a latte pastorizzato è risultata leggermente maggiore l intensità del sapore dolce, comunemente associato alla presenza di acido undecanoico (Pérès et al., 2001). E probabile che il forte profilo sensoriale del caprino a latte crudo abbia portato l 84,7% dei giudici non addestrati a preferire la produzione a latte pastorizzato, caratterizzata da un profilo meno aggressivo. a) Caprino industriale Caprino artigianale Aspetto globale. 2. Gradevolezza globale dell odore. 3. Gradevolezza globale al gusto. 4. Odore di animale (capra). 5. Odore di acido. 6. Persistenza del sapore in bocca. 7. Percezione del sapore dolce. 8. Percezione del sapore salato. 9. Percezione del sapore amaro. 10. Percezione del sapore acido. 11. Sensazione di piccante. 6 Figura 4.8a Comparazione dei profili sensoriali risultanti dal Consumer test svolto su produzioni a latte crudo e pastorizzato di Caprino. Pecorino. L elaborazione statistica dei dati ha portato ad individuare una notevole somiglianza dei profili di valutazione dei due formaggi (a latte crudo e pastorizzato) nei quali non sembrano essere state percepite rilevanti differenze per la maggior parte degli attributi sottoposti a giudizio dei consumatori. I due formaggi, infatti, hanno ottenuto valori comparabili in merito all impatto visivo, al grado di apprezzamento di odore e gusto ed all intensità dei descrittori dolce e salato. Relativamente a 84

25 quest ultimo descrittore, la percezione del consumatore rispecchia l effettiva similarità nel contenuto in sale delle due produzioni (compreso nell intervallo 2-2,5 g/100 g di prodotto); per quanto riguarda il descrittore dolce, l identica percezione nelle due produzioni potrebbe essere legata all assenza in entrambi i formaggi di acido undecanoico (analisi SPME-GC). Al contrario, per i descrittori persistenza del sapore in bocca, intensità dell odore di animale, sapore amaro e sapore acido, la produzione a latte crudo ha ottenuto punteggi significativamente più elevati; è interessante sottolineare come la diversa percezione del sapore acido non sia direttamente correlabile né a differenze significative nei valori di ph misurati nelle due produzioni, né a differenze nel contenuto in acido caproico, comunemente associato alla nota acido. Viceversa, per il descrittore piccante, la maggiore percezione del consumatore nella produzione a latte crudo è in accordo al maggiore contenuto nella stessa di acido acetico, come noto associato alla nota pungente (Pérès et al., 2001). In considerazione del fatto che, nel complesso, i responsi non hanno portato ad un netto orientamento dei giudici verso una delle due produzioni, è possibile ipotizzare che nessuno degli attributi evidenziati come significativamente differenti abbia influenzato altrettanto significativamente il livello di apprezzamento finale di uno dei due formaggi. b) b) Pecorino industriale 1 Pecorino artigianale Aspetto globale. 2. Gradevolezza globale dell odore. 3. Gradevolezza globale al gusto. 4. Odore di animale (pecora). 5. Persistenza del sapore in bocca. 6. Percezione del sapore dolce. 7. Percezione del sapore salato. 8. Percezione del sapore amaro. 9. Percezione del sapore acido. 10. Sensazione di piccante. 6 Figura 4.8b Comparazione dei profili sensoriali risultanti dal Consumer test svolto su produzioni a latte crudo e pastorizzato di Pecorino. 85

26 Caciotta. Per le due produzioni a latte misto sono stati evidenziati due profili sensoriali notevolmente differenti: punteggi significativamente più elevati sono stati assegnati alla produzione a latte crudo per l aspetto globale, la gradevolezza globale dell odore e la gradevolezza globale del gusto, nonché per l intensità dell odore di animale, dei descrittori salato e acido ed, infine, per la persistenza del sapore in bocca. Mentre per il descrittore acido, la maggiore percezione del consumatore di questo descrittore nella produzione a latte crudo può essere correlata al maggiore contenuto in acido caproico, come evidenziato dalle analisi SPME-GC, non sembra esistere una diretta relazione tra la diversa percezione del descrittore salato ed effettive differenze nel contenuto in sale (per entrambe compreso nell intervallo 1,84-2,1 g/100 g). La produzione a latte pastorizzato, al contrario, è stata percepita come più dolce rispetto alla produzione a latte crudo, sebbene quest ultima fosse caratterizzata da un più elevato contenuto in acido undecanoico. Verosimilmente, la maggiore complessità sensoriale della produzione a latte crudo ha determinato la preferenza, espressa dal 70,8 % dei giudici non addestrati, verso tale prodotto. c) c) Caciotta industriale Caciotta artigianale Aspetto globale. 2. Gradevolezza globale dell odore. 3. Gradevolezza globale al gusto. 4. Odore di animale (pecora). 5. Persistenza del sapore in bocca. 6. Percezione del sapore dolce. 7. Percezione del sapore salato. 8. Percezione del sapore amaro. 9. Percezione del sapore acido. 10. Aroma lattico. 6 Figura 4.8c Comparazione dei profili sensoriali risultanti dal Consumer test svolto su produzioni a latte crudo e pastorizzato di Caciotta. 86

27 Caserotto. I profili sensoriali delle due produzioni a latte vaccino differiscono significativamente in tutti i parametri considerati, fatta eccezione per il descrittore amaro. In particolare, la produzione a latte crudo ha ottenuto punteggi più elevati per la gradevolezza globale dell aspetto, gradevolezza globale dell odore e gradevolezza globale del gusto, ed è stata percepita come più salata e acida. La maggiore intensità di questi due ultimi descrittori nella produzione a latte crudo potrebbe essere legata all aggiunta, in caldaia, di olio di oliva (varietà Raggia, tipica della provincia di Ancona). La notevole diversità del profilo sensoriale delle due produzioni in studio rende particolarmente difficoltosa l individuazione degli attributi che possono avere guidato la preferenza del 68,1 % dei giudici non addestrati verso la produzione a latte crudo, sicuramente caratterizzata da un profilo sensoriale più forte e caratteristico. d) Formaggio da latte vaccino 1 industriale 9 Caserotto Aspetto globale. 2. Gradevolezza globale dell odore. 3. Gradevolezza globale al gusto. 4. Persistenza del sapore in bocca. 5. Percezione del sapore dolce. 6. Percezione del sapore salato. 7. Percezione del sapore amaro. 8. Percezione del sapore acido. 9. Aroma lattico. 5 Figura 4.8d Comparazione dei profili sensoriali risultanti dal Consumer test svolto su produzioni a latte crudo e pastorizzato di Caserotto. In linea generale, i consumatori si sono naturalmente orientati verso le produzioni a latte crudo; appare interessante sottolineare come tale scelta non sia stata influenzata da strategie di marketing, generalmente implementate per promuovere i prodotti artigianali e tipici. Nel caso del caprino, viceversa, è stata riscontrata una netta preferenza verso la produzione a latte pastorizzato, verosimilmente a causa di una maggiore propensione dei consumatori per prodotti caratterizzati da qualità sensoriali poco aggressive. 87