Metodi biochimici rapidi per identificazione microbica

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1 Metodi biochimici rapidi per identificazione microbica

2 utilizzazione di composti del carbonio glucosio, lattosio, saccarosio, mannitolo, inositolo, ramnosio, melibiosio amido citrato ossidazione acidi fermentazione acidi gas (CO 2, O 2 ) prodotti neutri Idrolisi a destrine, maltosio, glucosio basi test O/F mezzo con indicatore di ph Mezzo con indicatore di ph liquido solido con metodica dei dischetti test O/F Campanella di Durham in mezzo liquido fratture in mezzo solido Rilevamento acetilmetilcarbinolo test MR/ VP Reazione con iodio su agar amido Indicatore di ph in agar citrato contenente ammonio fosfato

3 utilizzazione di composti dell azoto proteine aminoacidi Aminoacidi solforati, solfiti, tiosolfati triptofano caseina gelatina deaminazione decarbossilazione Idrolisi (peptonizzazione) idrolisi Chetoacido + NH 3 Ammina + CO 2 H 2 S indolo Chiarificazione in agar latte Liquefazione mezzo nutriente con gelatina Reazione di ac.fenilpiruvico con FeCl 3 in mezzo con fenilalanina Indicatore di ph per alcalinizzazione in mezzo con peptone o arginina Indicatore di ph in mezzo con lisina, ornitina o arginina Reazione con indicatore Pb acetato o con sali di Fe Reazione con Kovacs

4 Discriminazione generi enterobatteri

5 Produzione di acidi da fermentazione del glucosio (test rosso metile) Produzione di actil-metilcarbinolo da fermentazione del glucosio (test VP)

6 Produzione di ammoniaca da utilizzazione del citrato in mezzo con ammonio fosfato e blu di bromotimolo Idrolisi dell amido dopo trattamento della piastra con KI

7 Produzione di gas in test ossidazionefermentazione da clostridi butirrici - acetoetanolici: butiricum, bejerinkii, pasteurianum, tyrobutyricum (alterazioni conserve e formaggi) Produzione di acidi, di gas, di solfuri, in tubi contenenti glucosio, indicatore di ph e sali di ferro

8 Esempi diagnostici

9 Identificazione di Proteus: Fermentazione lattosio Test rosso metile + Gas da glucosio ± Ureasi + Colonie sciamanti

10 Identificazione di Pseudomonas Colonie pigmentate ± Pigmento fluorescente ± Gelatinasi + Riduzione dei nitrati a N2 + King s agar medium

11 Identificazione di Salmonella Colonie porpora su mezzo cromogenico Test motilità + Produzione di solfuri +

12 Presenza e conta di clostridi solfito riduttori colonie nere in anaerobiosi in mezzo contenente cisteina

13 Differenziazione coli-enterobacter classica con test IMViC: Indolo Rosso metile Voges Proskauer Citrato Escherichia coli Enteroacter aerogenes

14 Identificazione di Listeria monocytogenes TEST: ß-emolisi Fermentazione di mannitolo Fermentazione di xilosio Fermentazione di ramnosio / /- CAMP test

15 Specie di Bacillus segnalate come causa di infezione nell uomo Gruppo 1 - Gram-positive, formano spore centrali o alle estremità, di forma ellissoidale o cilindrica, senza dilatazione dello sporangio. Bacillus anthracis Bacillus cereus Bacillus megaterium Bacillus mycoides Bacillus thuringiensis Gruppo 2 - Gram-variabile con spore ellissoidali, centrali o sub-terminali, senza dilatazione dello sporangio. Bacillus alvei Bacillus brevis Bacillus circulans Bacillus coagulans Bacillus licheniformis Bacillus macerans Bacillus pumilus Bacillus subtilis Gruppo 3 - Gram-variabile con spore sferiche, terminali o sub-terminali e dilatazione dello sporangio. Bacillus sphaericus Altre specie sono raramente associate ad infezione nell uomo.

16 Caratterizzazione delle specie di Bacillus

17 Capacità di produrre cellule sciamanti correlata a patogenicità swimming

18 Gruppo cereus o B. cereus sensu lato B. cereus B. thuringiensis B. cereus var. mycoides B. anthracis B. wehienstephanensis Isolati patogeni uomo Produce endotossina cristallina, entomopatogeno Crescita rizoidale Patogeno umano/animale Isolati patogeni uomo Inserito recentemente: B. cytotoxicus

19 Feature B. cereus B. thuringiensis B. cereus var. mycoides B. anthracis B. megaterium Gram reaction + a Catalase Motility +/- b +/- - c - +/- Reduction of nitrate + +/ d Tyrosine decomposed + + +/- - d +/- Lysozyme-resistant Egg yolk reduction Anaerobic utilization of glucose VP reaction Acid produced from mannitol Hemolysis (sheep RBC) Known pathogenicity c d - Produces enterotoxins a +, % of strains are positive b +/-, 50-50% of strains are positive c -, % of strains are negative d -, most strains are negative Endotoxin crystals pathogenic to insects Rhizoidal growth Pathogenic to animals and humans

20 Individuazione di B. anthracis presunto per invio a lab di riferimento (ISS)

21 Emolisi con alone omogeneo e con alone discontinuo (B. anthracis e B. cereus) Mezzo cromogenico per B. cereus

22 Identificazione di Staphylococcus aureus Attività della nucleasi termoresistente (mezzo contenente DNA) Attività della coagulasi in plasma

23 Metodi biochimici miniaturizzati

24 Esempio di preparazione delle strisce API: API 20 NE (per Gram- non enterici) prima serie di provette, attività enzimatiche

25 Preparazione delle strisce API: seconda serie di provette, assimilazioni

26 API 20 NE (per Gram- non enterici): reazioni enzimatiche

27 API 20 NE (per Gram- non enterici): assimilazioni

28 API 20 NE (per Gram- non enterici): raccolta dei risultati Aggiunta del risultato del test dell ossidasi Ricerca del codice di 7 cifre in manuale o database per ottenere identificazione della specie

29 Altri sistemi miniaturizzati: analisi degli acidi grassi cellulari Ad es. MICROBIAL IDENTIFICATION SYSTEM (MIS): analisi gas-cromatografica della composizione in acidi grassi del campione e ricerca dei profili più simili presenti in database. Il metodo può identificare i microorganismi a livello di specie o di ceppo. Official Methods of Analysis for the confirmation of Bacillus anthracis (Anthrax).

30 Altri sistemi miniaturizzati: analisi del profilo fisiologico con piastre BIOLOG Preparazione delle piastre multiwell per G- o G+ GRAM- GRAM+ Strisciati (G+ con sodio tioglicollato) e incubati 4-24h a 30 C Dalla piastra preparare sospensione cellulare in soluzione fisiologica (0.85% NaCl) fino a raggiungere torbidità pari a circa 52% del bianco Dalla piastra preparare sospensione cellulare in sol.fisiologica + sodio tioglicollato fino a torbidità pari a circa 28% del bianco Inoculare immediatamente le piastre GN2 con 150µl di sospensione per pozzetto Inoculare immediatamente le piastre GP2 con 150µl di sospensione per pozzetto Coprire le piastre ed incubare 16-24h: non enterici a 30 C enterici a C Coprire le piastre ed incubare 16-24h: bastoncelli sporigeni a 30 C cocchi o bast. non sporigeni a C

31 Lettura dei risultati: sviluppo di colore per produzione di sali di formazano in presenza di crescita microbica iodo-nitro-phenyl-tetrazolium Formazano (violetto di tetrazolio)

32 Sistemi di lettura automatizzata dell assorbanza dei pozzetti valutazione quantitativa

33 Esempio composizione piastre per G- (GN2)

34 Esempio composizione piastre per G+ (GP2)

35 Uso del Biolog per valutare aggressività di batteri/funghi sui reperti Es. con composti presenti in piastra ECO

36 Uso dei test biochimici per la selezione di isolati microbici utili 1. Selezione di microrganismi probiotici 2. Selezione di batteri utili per la conservazione dei prodotti freschi (colture protettive) 3. Selezione di colture starter per l industria lattiero-casearia o per la produzione di insaccati/salumi

37 1. Selezione di microrganismi probiotici Criteri generali di selezione dei probiotici Origine umana Accurata identificazione tassonomica GRAS (Generally Recognized As Safe), non tossico, non patogeno Assenza di resistenza agli antibiotici (QPS_EFSA 2003) Capacità di sopravvivere, proliferare e di svolgere attività metaboliche in vivo a livello del sito target Resistenza agli acidi Resistenza alla bile Capacità di adesione e potenziale capacità di colonizzazione (anche transitoria)

38 1. Selezione di microrganismi probiotici Batteri utilizzati o potenzialmente utilizzabili negli alimenti probiotici: Lactobacillus acidophilus Lactobacillus casei Lactobacillus plantarum Lactobacillus salivarius Lactobacillus bulgaricus Streptococcus thermophilus Lactococcus lactis Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Leuconostoc mesenteroides Bifidobacterium spp. Pediococcus acidilactici Sporolactobacillus inulinus Propionibacterium freudenreichii Ceppi commerciali esistenti: Lb. acidophilus La5, Lb. acidophilus NCFB1748 Lb. plantarum 299v Lb. casei Shirota, Lb. casei Immunitass Lb. rhamnosus GG Lb. fermentum KLD Lb. paracasei F19 Lb. reuteri SD2112 Lb. johnsonii La1 Lb. salivarius UCC118 Bf. lactis (bifidum) Bb12 Bf. longum, BB536 Bf. bifidum Bf. infantis Bf. breve Bf. adolescentis Bf. animalis

39 2. Selezione di batteri utili per la conservazione dei prodotti freschi Colture protettive Coltura in grado di esercitare azioni antimicrobiche nei confronti di microrganismi indesiderati batteriocine Proteine biologicamente attive o complessi proteici in grado di esercitare attività battericida nei confronti di altre specie batteriche, ma non sul microrganismo produttore Es. Nisina: peptide contenente 34 aminoacidi (3354 Da), prodotta da ceppi di Lactococcus lactis subsp. lactis. Attiva contro altri batteri lattici e patogeni (Listeria monocytogenes e Clostridium botulinum) uso consentito per aumentare i tempi di conservazione di latte e derivati, conserve vegetali, prodotti carnei freschi e fermentati e prodotti ittici

40 2. Selezione di batteri utili per la conservazione dei prodotti freschi Specie batteriche utilizzati o potenzialmente utilizzabili per la conservazione dei prodotti freschi (isolati produttori di batteriocine) Lactobacillus plantarum Lactobacillus delbrueckii Streptococcus thermophilus Lactococcus lactis Lactococcus cremoris Enterococcus mundtii Enterococcus faecalis Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc carnosum Bifidobacterium spp.

41 3. Selezione di colture starter Colture starter Definizione preparazioni che contengono microrganismi vivi utilizzazione del metabolismo microbico per il raggiungimento di obiettivi tecnologici Classificazione Colture starter con ceppi misti: colture a composizione indefinita (substrati fermentati risultanti da lavorazioni precedenti) Colture starter a singolo ceppo Colture starter a ceppi multipli, di una o più specie

42 3. Selezione di colture starter Colture starter: perchè si usano? garantiscono decorsi fermentativi più regolari determinano più efficacemente la riduzione e la progressiva scomparsa dei microrganismi indesiderati possono ridurre i tempi di stagionatura consentono produzioni qualitativamente più costanti

43 3. Selezione di colture starter Caratteri di colture starter e/o protettive gli organismi usati non devono essere dotati di attività patogena o tossica devono essere in grado di competere con la microflora autoctona e di svolgere le attività metaboliche per le quali sono stati selezionati nelle condizioni di processo la propagazione degli organismi starter deve essere economicamente conveniente la coltura starter deve poter essere conservata allo stato congelato o liofilizzato senza perdita delle peculiarità metaboliche le proprietà metaboliche devono essere stabili per molti mesi nelle condizioni di stoccaggio manipolazione e impiego devono essere semplici

44 3. Selezione di colture starter Formaggi: attività dei microrganismi durante maturazione/stagionatura uso acido lattico da parte di lieviti, muffe e batteri propionici; idrolisi dei trigliceridi in acidi grassi liberi; idrolisi delle caseine in peptidi, aminoacidi e composti aromatici; modificazioni del ph e dell attività dell acqua; ammorbidimento della pasta; formazione della crosta; modifica dell aspetto; sviluppo dell aroma e del sapore del formaggio; colonizzazione microbica della crosta. Batteri: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc ed Enterococcus, micrococchi e stafilococchi, propionibatteri, corinebatteri. batteri alterativi (clostridi, bacilli, coliformi) e patogeni (L. monocytogenes, Salmonella e altri) Lieviti: Debaryomyces hansenii, Kluyveromyces marxianus, Yarrowia lipolytica (metabolismo lattato e lipolisi) Muffe: in formaggi a crosta fiorita (Penicillium candidum) ed erborinati (Penicillium roqueforti), inoculate come colture selezionate

45 3. Selezione di colture starter Esempi di mo. presenti in diversi formaggi

46 Colture starter standardizzazione aromi

47 Da lipidi e proteine i mo. producono composti che partecipano alla composizione dell aroma degli alimenti migliori proprietà sensoriali se conserviamo flora microbica indigena

48 3. Selezione di colture starter Microrganismi che intervengono nella fermentazione e stagionatura degli insaccati lattobacilli omofermentanti facoltativi (LAB) pediococchi micrococcaceae catalasi positive lieviti muffe

49 3. Selezione di colture starter Caratteristiche considerate nella selezione di Batteri lattici per l'industria degli insaccati Capacità di processi metabolici anche a basse temperature Capacità di crescita in condizioni di microaerofilia Potere acidificante Capacità di crescita in presenza di Sodio cloruro fino a 6% Capacità di crescita in presenza di Sodio o Potassio nitrato fino a 600 mg/kg Capacità di crescita in presenza di Sodio o Potassio nitrito fino a 150 mg/kg Attività fermentativa (omo- o etero- lattica) Stereoisomero dell'acido lattico prodotto Attività nitrato-reduttasica Attività catalasica Attività aromatizzanti Attività proteolitiche Attività lipolitiche Produzione di perossidi Produzione di ammine biogene Proprietà sinergiche con altri microrganismi utili Attività antagonista verso microrganismi indesiderati Incapacità di produrre mucillagini

50 3. Selezione di colture starter

51 3. Selezione di colture starter Legislazione: nella preparazione degli insaccati carnei, la cui tecnologia produttiva non comporti trattamenti con il calore, è consentito l impiego di colture di avviamento starter microbici : Lactobacillus Pediococcus Micrococcus Staphylococcus (S. xylosus, S. simulans, S. carnosus) Debaryomices Al fine di assicurare l azione delle colture è ammesso l impiego di: Saccarosio max. 1% Destrosio max. 0,5% Miscela dei due zuccheri Trattamento di superfici con colture di miceti: Penicillium chrysogenum Penicillium nalgiovense

52 3. Selezione di colture starter Perché i nitriti? Inibiscono lo sviluppo di clostridi Inibiscono lo sviluppo di Brocothrix Parziale controllo di Listeria Parziale controllo di enterobatteri Conservazione del colore

53 3. Selezione di colture starter Produzione di ammine biogene, tossiche per l organismo umano, da parte dei batteri lattici

54 3. Selezione di colture starter Riduzione rischio ammine biogene Attività decarbossilasica dei mo. correlata a produzione di ammine: controllo proprietà decarbossilasiche di ceppi microbici usati come starter Test: incubazione in terreno decarbossilasico (contenente lisina) 3 gg. a 37 C Prodotti carnei freschi Prodotti carnei fermentati Prodotti non fermentati e stagionati Ammina Putrescina Cadaverina Putrescina Tiramina Istamina Cadaverina Putrescina Tiramina Microorganismi con attività decarbossilasica Enterobacteriaceae Proteus mirabilis Pseudomonas spp Lactobacillaceae Micrococcaceae Pediococcus spp Pseudomonas spp Staphylococcus Lactobacillaceae Micrococcaceae Lieviti

55 3. Selezione di colture starter Legislazione: limiti critici delle ammine biogene negli alimenti ISTAMINA Prodotti della pesca 100 mg kg -1 Vino 2 mg l -1 TIRAMINA mg kg -1 Ph-ETILAMMINA 30 mg kg -1 AMMINE TOTALI <1000 mg kg -1