utilizzazione di composti del carbonio

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1 utilizzazione di composti del carbonio glucosio, lattosio, saccarosio, mannitolo, inositolo, ramnosio, melibiosio amido citrato ossidazione acidi fermentazione acidi gas (CO 2, O 2 ) prodotti neutri Idrolisi a destrine, maltosio, glucosio basi test O/F mezzo con indicatore di ph Mezzo con indicatore di ph liquido solido con metodica dei dischetti test O/F Campanella di Durham in mezzo liquido fratture in mezzo solido Rilevamento acetilmetilcarbinolo test MR/ VP Reazione con iodio su agar amido Indicatore di ph in agar citrato contenente ammonio fosfato

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7 utilizzazione di composti dell azoto proteine aminoacidi Aminoacidi solforati, solfiti, tiosolfati triptofano caseina gelatina deaminazione decarbossilazione Idrolisi (peptonizzazione) idrolisi Chetoacido + NH 3 Ammina + CO 2 H 2 S indolo Chiarificazione in agar latte Liquefazione mezzo nutriente con gelatina Reazione di ac.fenilpiruvico con FeCl 3 in mezzo con fenilalanina Indicatore di ph per alcalinizzazione in mezzo con peptone o arginina Indicatore di ph in mezzo con lisina, ornitina o arginina Reazione con indicatore Pb acetato o con sali di Fe Reazione con Kovacs

8 Altri test basati su attività metaboliche Trigliceridi e fosfolipidi urea Attività catalasica Attività ossidasica Idrolisi ad acidi grassi Idrolisi a lipidi non idrosolubili NH 3 + CO 2 H 2 O 2 H 2 O + O 2 Su ammine aromatiche Reazione con CuSO 4 o con Victoria blue Precipitato in mezzo solido per idrolisi lecitina Indicatore di ph in agar con urea Reazione della coltura con H 2 O 2 Produzione composti colorati

9 Al di sopra di ph 8.3 litmus è blu, al di sotto di 4.5 è rosso

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11 Pseudomonas Bacilli Gram-, aerobi stretti, mobili per flagelli polari, ossidasi+, chemioorganotrofi. Alcune specie producono pigmenti. specie fitopatogene (P. syringae) patogene opportuniste nelle infezioni nosocomiali (P. aeruginosa) usate nel biocontrollo e nella promozione della crescita delle piante (P. fluorescens) o nel biorisanamento (P. putida, P. stutzeri) P. fluorescens bacillo Gram-, mobile, flagellato, in grado di produrre pigmenti fluorescenti chelanti il Fe +3 (siderofori) detti pioverdine. presenti negli alimenti come agenti di alterazione Pseudomonas aeruginosa produce piocianina, pigmento blu-verde con azione antibiotica e di sideroforo. patogeno opportunista (>10% infezioni nosocomiali).

12 Pseudomonas aeruginosa Preparazione dei campioni Rivitalizzazione in acqua peptonata a 30 C per 4 ore Inoculo su mezzo selettivo (cefaloridina-fucidina-cetrimide) 48 ore a 25 C 48 ore a 41 C Conferma: Gram-, ossidasi e catalasi positivo, motile, ossida glucosio in O/F test

13 Idrolisi gelatina King s agar medium

14 Enterobatteri 1. Bastoncelli ( x mm) 2. Mobili per flagelli peritrichi o immobili 3. Ossidasi negativi 4. Capaci di fermentare in assenza di O 2 carboidrati semplici Comprende: Escherichia, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Erwinia

15 Analisi degli enterobatteri: Quantificazione di Enterobacteriaceae Coliformi totali Streptococchi fecali E. coli E. coli O157:H7 Ricerca di E. coli O157:H7 Salmonella

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19 Conta enterobacteriaceae Conta coliformi totali Conta coliformi fecali e E. coli ricerca Shigella- Salmonella

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23 Conta enterobacteriaceae Conta coliformi totali Conta coliformi fecali e E. coli ricerca Shigella- Salmonella

24 Enterobatteri Fattori selettivi: Sali biliari, cristal violetto, deossicolato Fattori differenziali: indicatori - cromofori Enterobatteriacee: glucosio coliformi totali fecali E.coli: lattosio Streptococchi fecali: glucosio

25 Enterobatteriacee Cristal violetto e sali biliari + rosso neutro + glucosio (VRBGA) Cristal violetto e sali biliari + rosso neutro + lattosio (VRB(L)A o MacConkey) coliformi

26 Sali biliari + rosso fenolo + lattosio

27 Sali biliari + rosso neutro + lattosio

28 Sodio deossicolato e citrato + rosso neutro + lattosio Lattosio fermentante debole lattosio fermentante non fermentanti

29 Differenziazione di E. coli beta-glucoronidasi +: Terreno fluorogeno Con MUG (4-metilumbelliferil beta-d-glucuronide) nel mezzo alone fluorescente UV in colonie beta-glucoronidasi + Terreno cromogeno Con BCIG (5-Br-4-Cl-3-indolil-_-D-glucuronide) nel mezzo colorazione differenziale colonie beta-glucoronidasi +

30 Lettura di coliformi con differenziazione di E. coli: Lattosio e substrato per glucuronidasi

31 Lettura di coliformi con differenziazione di E. coli: Lattosio e substrati per glucuronidasi e galattosidasi

32 Controllo di qualità piante medicinali (FU) Presenza enterobatteri Rivitalizzazione brodo lattosio 2-5h Aricchimento terreno Mossel Isolamento VRBLA e VRBGA Quantificazione enterobatteri Rivitalizzazione brodo lattosio 2-5h Isolamento VRBLA e VRBGA Presenza E. coli Rivitalizzazione brodo lattosio 2-5h Aricchimento McConkey Isolamento McConkey

33 Rivitalizzazione 1:10 brodo lattosio 2-5h Incubazione di 0.1, 0.01, 0.001g in brodo soia-caseina Incubazione di 1:100 di ogni diluizione in brodo McConkey a 44 C, con piastra McConkey in parallelo Valutazione in base a tabella

34 MPN PRESUNTIVO COLIFORMI 10 ml mezzo a doppia concentrazione + 10 ml campione 10 ml mezzo a concentrazione regolare + 1 ml campione 10 ml mezzo a concentrazione regolare ml campione

35 MPN presuntivo coliformi lattosio-rosso fenolo bile-verde brillante

36 MPN presuntivo coliformi

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40 Terreni e test differenziali per enterobatteri: Endo agar Hektoen enteric agar MLGA (membrane lactose glucuronide agar) McConkey TSI (triple sugar iron) Rosso metile Voges-Proskauer Urea Citrato Indolo KCN Fenilalanina β-galattosidasi

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44 Salmonella S. typhi, S. paratyphi causano la febbre tifoide; S. choleraesuis genera setticemia e S. typhimurium e S. enteritidis originano gastroenterite Shigella causano dissenteria o shigellosi. Alcuni ceppi producono enterotossina e tossina Shiga.

45 Salmonella e Shigella Preparazione dei campioni Inoculo in acqua peptonata per rivitalizzazione 24 ore a 37 C Inoculo in mezzo di arricchimento selettivo: Selenite cistina per Shigella 24 ore a 37 C Rappaport-Vassiliadis per Salmonella 24 ore a 42 C Inoculo in piastra su terreno selettivo (brilliant green-rosso fenolo o salmonella-shigella agar) o cromogenico 24 ore a 37 C Colonie sospette strisciate su agar nutriente per conferme 24 ore a 37 C Test di conferma su colonie sospette: TSI, idrolisi urea, decarbossilaz. Lisina, ß-galattosidasi, MR- VP, indolo Conferma con gallerie API 20E o agglutinazione su vetrino o immunocattura o ibridazione con sonda (Gene-track)

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48 Altri terreni selettivi e differenziali per Salmonella

49 fermentazione acida produzione gas (CO 2 + H 2 ) fermentazione lattosio Escherichia Salmonella Shigella + - -

50 Escherichia coli Bacilli Gram- (1-2 x 3-30 µm), anaerobi facoltativi, fermentano lattosio e glucosio ad acidi. Commensali del tratto intestinale degli animali omeotermi. presenza nelle acque indica contaminazione fecale. Ceppi patogeni di Escherichia coli enterotossigeni (ETEC), enteroinvasivi (EIEC), enteroemorragici (EHEC), enteropatogeni (EPEC), enteroaggregativi (EAggEC).

51 categorie alimentari per le quali i VTEC rappresentano un pericolo per la salute pubblica: carne di manzo cruda o poco cotta o carne di altri ruminanti carne macinata carne di manzo fermentata e prodotti derivati latte crudo e prodotti a base di latte crudo prodotti freschi, in particolare semi germogliati succhi di frutta e di ortaggi non pastorizzati

52 Ricerca Escherichia coli patogeno Anche trasferimen to mediante immunocattu ra Preparazione dei campioni Inoculo in mezzo di arricchimento selettivo (modified Tryptone Soya Broth + novobiocina o acriflavina) 24 ore a 37 C Inoculo in mezzo selettivo: MacConkey s agar contenente sorbitolo 0.1% invece di lattosio 24 ore a 37 C Test di conferma sierologici su colonie sospette colonie sorbitolo -: sospette O157:H7 falsi positivi: ceppi di E. coli e altri generi non fermentanti colonie sorbitolo + (colorazione rosso porpora) falsi negativi: eventuali ceppi di O157:H7 sorbitolo fermentanti

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54 Enterobacter aerogenes Differenziazione coli-enterobacter classica con test IMViC: Indolo Rosso metile Voges Proskauer Citrato Escherichia coli Enteroacter aerogenes

55 ISO/DTS 22964: ricerca di E. sakazakii in prodotti a base di latte per bambini di età inferiore a 6 mesi. n = 30 c = 0 m = assente in 10g

56 Proteus MR + ferm latt - ferm glu acidi no gas ureasi +

57 fermentazione acida produzione gas (CO 2 + H 2 ) fermentazione lattosio Enterobacter Serratia Erwinia - - V Klebsiella Escherichia Salmonella Shigella Proteus + - -

58 Vibrio bacilli ricurvi Gram -, anaerobi facoltativi asporigeni, mobili per mezzo di un flagello polare. ossidasi +, metabolismo respiratorio e fermentativo. alcuni alofili. infezioni (o tossinfezioni) umane: contatto diretto o ingestione di alimenti e acqua contaminati. V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus

59 Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus e altre specie enteropatogene Preparazione dei campioni Inoculo in mezzo di arricchimento: Acqua peptonata alcalina Brodo salino con polimixina B 8-24 ore a 37 C Inoculo in mezzo selettivo (tiosolfato-citrato-sali biliari) ore a 37 C Colonie sospette strisciate su agar salino 3% ore a 37 C Test di conferma su colonie sospette: ossidasi, ß-galattosidasi, motilità + api 20E

60 Campylobacter C.jejuni isolato frequentemente da suini (60%) e pollame. Microaerofilo, sensibile al congelamento, inattivato dalla cottura. Può causare gastroenterite acuta.

61 Campylobacter jejuni Preparazione dei campioni Inoculo su mezzo selettivo (Exeter agar) Se carica bassa (cibi congelati) inoculo in mezzo di arricchimento selettivo 4 ore a 37 C + 44 ore a 42 C Conferma su vetrino: Gram-, motili, non sporigeni, forma bastoncellare ad S ricurva, test ossidasi, catalasi

62 Bacillus Gram-positivo, bastoncello sporigeno aerobi o anaerobi facoltativi, Cat+ motile mediante flagelli peritrichi produce enzimi extracellulari e antibiotici forma endospore resistenti subtilis - coagulans - licheniformis: alteranti termotrattati in scatola polymixa - termophilus: alteranti conserve sotto vuoto thuringiensis: patogeno artropodi cereus - anthracis patogeni uomo ufc/g

63 Bacillus cereus presente comunemente in terreno,latte,cereali, amido, erbe e spezie e altri alimenti essicati presente sulla superficie della carne, per contaminazione ambientale può essere responsabile di deterioramento di latte crudo e pastorizzato alti livelli di cellule e spore presenti in latti disidratati per lattanti >80% DNA omologia con B. anthracis, B.mycoides e B. thuringiensis Discriminato da B. anthracis per: motilità decomposizione della tirosina

64 Spore resistenza al calore: Sierotipo 1 (flagellar H antigen) D 95 C = 24 min (patogeno da alimenti) altri sierotipi D 95 C = min germinazione delle spore temperatura: 8-30 C diverse tossine prodotte, responsabili di disturbi diarroici, inattivate con 2min a 80 C emetici, inattivate con 90min a 126 C 10 5 cfu/g alimento danno già possibilità di intossicazione prevenzione: della moltiplicazione delle cellule vegetative della germinazione delle spore mediante raffreddamento degli alimenti a <7 C o mantenendoli a >55-60 C dopo il trattamento termico

65 Rilevamenti Bacillus cereus spezie Alimenti refrigerati pronto consumo Vegetali freschi farine 10 3 Tuorlo uovo pastorizzato <10 3 Prodotti da forno Latte pastorizzato Latte in polvere Formulati lattanti 1-4 spore/g MPN/g

66 Bacillus cereus Preparazione dei campioni Inoculo in mezzo selettivo (mannitolo-rooso d uovo-rosso fenolo-polimixina o piruvato-rosso d uovo-mannitolo- blu bromotimolo) ore a 30 C Colonie sospette (rosa-violette o blu con alone di precipitazione) strisciate su agar rosso d uovo e su nutrient ore a 30 C Conferma attività lecitinasica Test di conferma su colonie sospette: idrolisi gelatina, fermentaz. Glucosio, mannitolo e xilosio, riduzione nitrati, crescita in cloral idrato, idrolisi amido, MR-VP

67 isolamento e identificazione presuntiva di B. cereus: mannitol-egg yolk-polymixin (MYP) phenol red pyruvate-polymixin-egg yolk-mannitol-bromotymol blue agar (PPEMBA) test di conferma: colorazione di Gram: bastoncelli grandi, gram-positivi con spore centrali ellissoidali fermentazione anaerobia del glucosio (positiva) attività lecitinasica su rosso d uovo (positiva) fermentazione di mannitolo (negativa) riduzione del nitrato (positiva) Voges-Proskauer (positivo) utilizzazione di citrato (positiva) decomposizione della tirosina (positiva) idrolisi di gelatina e caseina (positiva) Resistenza a lisozima (resistente a 0.001%)

68 Feature B. cereus B. thuringiensis B. cereus var. mycoides B. anthracis B. megaterium Gram reaction + a Catalase Motility +/- b +/- - c - +/- Reduction of nitrate + +/ d Tyrosine decomposed + + +/- - d +/- Lysozyme-resistant Egg yolk reduction Anaerobic utilization of glucose VP reaction Acid produced from mannitol Hemolysis (sheep RBC) Known pathogenicity c d - Produces enterotoxins a +, % of strains are positive b +/-, 50-50% of strains are positive c -, % of strains are negative d -, most strains are negative Endotoxin crystals pathogenic to insects Rhizoidal growth Pathogenic to animals and humans

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70 Test Kit BCET-RPLA TD950 [Used to identify B. cereus diarrheal enterotoxin] Analytical Technique Reversed passive latex agglutination Approx. Total Test Time 1 24 h (food) 48 h (bacterial culture) TECRA Bacillus diarrheal Enterotoxin VIA [Used to detect GDE toxin and Bacillus spp. capable of producing enterotoxin] 1 Includes enrichment ELISA 4-24 h

71 botulismo: Clostridium: bastoncini sporigeni anaerobi obbligati cat- da terreno - alimenti anim/veg sopravvivono alla pastorizzazione alimentare, presenza della tossina nei cibi; infantile, (bambini <1 anno) ingestione di spore che nel tratto intestinale del bambino germinano e producono tossina; da ferita o lesione, infezione di ferite

72 Clostridium perfringens Intossicazioni alimentari Ingestione di cibi in cui sia presente la tossina (p.i. 8 a 24 ore, mediamente 12 ore) Sintomatologia: diarrea e vomito Alcuni stipiti di perfrigens sono in grado di elaborare una tossina enterotossica che si produce solo in condizioni in cui sia possibile la sporificazione. Questa tossina è infatti associata alla tunica sporale con caratteristica di super antigene. 20

73 Clostridium perfringens Preparazione dei campioni Inoculo su mezzo selettivo (solfito.ferrocitrato-cicloserina o solfito-kanamicina) 24 ore a 37 C Se carica particolarmente bassa fare conta in tubi MPN Colonie sospette (nere) strisciate su agar nitrato e agar sangue 24 ore a 37 C nitrato in anaerobiosi, sangue in aerobiosi Conferma se riducono e sono mobili in nitrato e non crescono su sangue in aerobiosi. Colorazione di Gram per conferma bastoncelli G+

74 Cl. butirrici - acetoetanolici: butiricum, bejerinkii, pasteurianum, tyrobutyricum (alterazioni conserve e formaggi)

75 Clostridium botulinum Analisi microbiologiche difficilmente eseguite, generalmente vengono saggiati gli alimenti per la ricerca delle tossine, con metodiche di immunodiagnostica Quantificazione dei clostridi solfito riduttori

76 eubatteri gram positivi basso contenuto GC Clostridium Lactobacillus Bacillus Staphylococcus Listeria Lactococcus Sporolactobacillus Streptococcus Pediococcus Enterococcus

77 Listeria monocytogenes bastoncini anaerobi facoltativi cat+ psicrofili, resistenti congelamento fermentanti senza prod. gas inibiti ph 5 tollerano a w 0.8 (alofili-osmofili) latte - carne - vegetali - acqua - foraggi forma biofilm mid: cell/g produce emolisine Listeriosi invasiva: sistema nervoso centrale e placenta - individui a rischio - dose infettiva bassa - incubazione 2-3w listeriosi gastroenterica: tratto gastrointestinale - popolazione non predisposta - incubazione 12-24h

78 Fraser broth Listeria monocytogenes Preparazione dei campioni Inoculo in brodo di arricchimento Inoculo in mezzo unico di arricchimento selettivo 22 ore a 30 C Inoculo in secondo mezzo di arricchimento selettivo 4 ore a 30 C + 24 ore a 37 C 48 ore a 35 C Inoculo in piastra su terreno selettivo (litio-antibiotici-acriflavina-mannitolo) ore a C Colonie sospette strisciate su terreno triptone-soia-estr.lievito o mezzo cromogenico ore a 30 C Osservazione colonie con illuminazione Henry (iridescenza verde-blu) Test di conferma su colonie sospette: ß-emolisi - CAMP test, fermentazione mannitolo, xilosio, ramnosio.

79 OX Agar Caratteri distintivi delle specie TEST: ß-emolisi Fermentazione di mannitolo Fermentazione di xilosio Fermentazione di ramnosio /- +/- -

80 CAMP test

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82 Alimenti pronti che permettono l accrescimento di Listeria monocytogenes (= 100 ufc/g). Questo criterio si applica se il produttore è in grado di dimostrare, con soddisfazione dell autorità competente, che il prodotto non supererà il limite di 100 ufc/g durante la shelf-life.. L operatore può fissare dei limiti intermedi durante il processo sufficientemente bassi da garantire che il limite di 100 ufc/g non sarà superato alla fine della shelf-life Alimenti che permettono l accrescimento di L. monocytogenes (assente in 25g). Questo criterio si applica ai prodotti prima che escano dal controllo diretto del produttore quando questi non sia in grado di dimostrare, con soddisfazione dell autorità competente, che il prodotto non supererà il limite di 100 ufc/g durante la shelf-life. Alimenti che non permettono l accrescimento di L. monocytogenes (= 100ufc/g). Prodotti con:. ph = 4.4. aw = 0.92,. ph = 5.0 e aw = Prodotti con una shelf-life inferiore ai 5 giorni sono automaticamente considerati appartenenti a questa categoria. Anche altri tipi di prodotti possono appartenere a questa categoria, purché vi sia una giustificazione scientifica.

83 eubatteri gram positivi alto contenuto GC basso contenuto GC Arthrobacter Micrococcus Actinomyces Staphylococcus Streptococcus Enterococcus

84 Micrococcus: cocchi cat+ NO3+ osmofili aerobi obbligati ceppi termodurici stagionature salumi e formaggi Staphylococcus: cocchi cat+ NO3+ osmofili anaerobi facoltativi ceppi saprofiti (stagionature salumi e formaggi) ceppi patogeni (coagulasi e termonucleasi+) produttori emolisine e enterotossine

85 Alimenti suscettibili alla contaminazione da Staphylococcus aureus Vie di disseminazione di Staphylococcus aureus Carne Prodotti derivati dalla carne Insalate miste Prodotti di pasticceria Prodotti lattiero-caseari Contatto diretto o indiretto con alimenti infetti Uso di strumenti per il taglio o di utensili infetti Refrigerazione inadeguata Cottura o riscaldamento inadeguato dell alimento

86 Staphylococcus aureus: è uno dei microrganismi patogeni non sporigeni più resistenti dotato di osmotolleranza dovuta all accumulo di glicina, prolina, ciolina e taurina nella cellula ha acquisito resistenza genetica ai metalli pesanti e agli agenti antimicrobici usati nelle pratiche cliniche

87 Staphylococcus aureus Preparazione dei campioni Inoculo su mezzo selettivo (Baird Parker agar) Se carica bassa inoculo in mezzo di arricchimento selettivo (tellurite-mannitologlicina) 24 ore a 37 C Colonie sospette (nere con alone di lipolisi) sottoposte a conferma: test della coagulasi e della nucleasi termoresistente

88 Strisce API Staphylococcus

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