OPPIACEI urinari in GC-MS Cod. GC45010 (Morfina, Diidrocodeina, Codeina, Etilmorfina, 6-Monoacetilmorfina) Metodo di conferma in GC-MS

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1 OPPIACEI urinari in GC-MS Cod. GC45010 (Morfina, Diidrocodeina, Codeina, Etilmorfina, 6-Monoacetilmorfina) Metodo di conferma in GC-MS INTRODUZIONE L Eroina è un alcaloide con una lunga storia di uso ed abuso. La sua determinazione di screening nei liquidi biologici (soprattutto in urina) viene generalmente effettuata usando tecniche immunometriche con l ausilio di anticorpi monoclonali e successiva marcatura con vari reagenti. Poiché tali tecniche non possono escludere falsi positivi, le positività allo screening devono essere confermate con tecnica alternativa, generalmente con tecnica cromatografica sia Gassosa (GC) che Liquida (LC) entrambe accoppiate con detector specifici e selettivi (UV, Fluorescenza, MS). Il presente metodo consente di determinare la Morfina urinaria (il maggiore metabolita della Eroina), la Diidrocodeina, la Codeina, la Etilmorfina e la 6-Monoacetilmorfina previa estrazione SPE e lettura in GC-MS. EUREKA srl LAB DIVISION VAT N info@eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi Chiaravalle (AN) ITALY Tel Fax Release N 011 Oppiacei urinari in GC/MS Settembre

2 Principio del metodo : CARATTERISTICHE DEL KIT Il presente metodo consente di determinare la Morfina (il maggiore metabolita dell Eroina), la Diidrocodeina, la Codeina, l Etilmorfina e la 6-Monoacetilmorfina urinarie previa estrazione SPE e lettura in GC-MS. Recupero del Metodo : > 95 % Sensibilità del Metodo : < 10,0 ng/ml Range dinamico del Metodo : ng/ml Valore di cut-off: Morfina 100 ng/ml Diidrocodeina n.d. Codeina 100 ng/ml Etilmorfina n.d. 6-Monoacetilmorfina 100 ng/ml Contenuto della Confezione : Reagente A Enzima di idrolisi, 2 x 1 ml Reagente B Soluzione Tampone per idrolisi, 1 x 25 ml Reagente C Soluzione Condizionamento 1 e Lavaggio 3, 1 x 450 ml Reagente D Soluzione Condizionamento 2, 1 x 200 ml Reagente E Soluzione Tampone, 1 x 200 ml Reagente F Soluzione Lavaggio 1, 1 x 200 ml Reagente G Soluzione Lavaggio 2, 1 x 200 ml Reagente H Soluzione Eluente, 1 x 100 ml Reagente I Soluzione Diluente, 1 x 50 ml Rif. Procedure applicative del procedimento n.99/cu 30 ottobre 2007 Tutti i reagenti sono pronti all uso e stabili 3 anni a 2 8 C. Da ricostituire con 9,0 ml di Reagente B. Quando ricostituito, l enzima è stabile 1 anno a 2 8 C. Reagente N Soluzione Test, 1 x 0,5 ml Reagente R Soluzione Test 6-MAM, 1 x 0,5 ml Reagente P1 Livello 1, 1 x 5 ml Reagente P2 Livello 2, 1 x 5 ml Reagente P3 Livello 3, 1 x 5 ml Reagente P4 Livello 4, 1 x 5 ml Reagente P5 Livello 5, 1 x 5 ml Reagente Q1 6-MAM Livello 1, 1 x 5 ml Reagente Q2 6-MAM Livello 2, 1 x 5 ml Reagente Q3 6-MAM Livello 3, 1 x 5 ml 2

3 Reagente Q4 6-MAM Livello 4, 1 x 5 ml Reagente Q5 6-MAM Livello 5, 1 x 5 ml Reagente M Soluzione Derivatizzante, 1 x 5 ml (5 ampolle da 1 ml) Colonne di Clean-up, 100 pz Dotazione strumentale minima richiesta : Dotazione opzionale : Strumento GC-MS Computer gestionale Autocampionatore Modalità di prelievo urinario : Prelevare 10 ml urina Stabile per circa 3 mesi a 20 C Release N 011 Oppiacei urinari in GC/MS Settembre

4 PROCEDURA PREANALITICA: FASE 1 : In una provetta di vetro con tappo in teflon pipettare : 450 µl di Reagente I Sol. Diluente 50 µl di Reagente N Soluzione Test (o Reagente R Soluzione Test 6-MAM) Al vortex per 20 secondi FASE 2 : Portare a secco l eluato con l ausilio di un flusso elio o azoto FASE 3 : Riprendere con 50 µl di Reagente M - Soluzione Derivatizzante FASE 4: Porre in stufa a 70 C per 20 minuti Al vortex per 20 secondi Raffreddare a Temperatura ambiente FASE 5 : Trasferire tutto il campione in vials con riduttore di volume NOTA : Prima di iniziare la seduta analitica è consigliabile iniettare 2 µl di questa soluzione in GC per identificare il tempo di ritenzione degli Oppiacei che deve essere simile a quello riportato in Fig. 1. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. PROCEDURA ANALITICA: FASE 1 : Ricostituzione dell enzima Aggiungere al Reagente A enzima di idrolisi (contenente 1 ml) 9 ml di Reagente B Soluzione Tampone per idrolisi. Agitare per inversione Release N 011 Oppiacei urinari in GC/MS Settembre

5 FASE 2 : Idrolisi enzimatica dei campioni Fare la Curva di Calibrazione su 5 punti: P1 + Q1 P2 + Q2 Reagente P1 Livello 1 Reagente Q1 6-MAM Livello 1 Reagente P2 Livello 2 Reagente Q2 6-MAM Livello 2 Reagente P3 Livello 3 Reagente Q3 6-MAM Livello 3 Reagente P4 Livello 4 Reagente Q4 6-MAM Livello 4 Reagente P5 Livello 5 Reagente Q5 6-MAM Livello 5 Campione P3 + Q3 P4 + Q4 P5 + Q5 Campione Controlli + Controlli 6-MAM 1,0 ml Controlli Controlli 6- MAM Reagente A Enzima ricostituito 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl Controllare che il ph sia 5,0 Eventualmente correggerlo Al vortex per 20 secondi Release N 011 Oppiacei urinari in GC/MS Settembre

6 N.B. I valori dei Calibratori Morfina, Codeina, Diidrocodeina, Etilmorfina e 6-MAM mixati insieme avranno come concentrazione la META di quella riportata nella tabella delle Avvertenze!!! FASE 3 : Porre in stufa a 50 C per 3 ore. FASE 4 : Condizionamento delle colonne di Clean-up Versare in colonna 1,5 ml di Reagente C Soluzione di Condizionamento 1 e Lavaggio 3 Scartare l eluato Versare in colonna 2 ml di Reagente D Soluzione di Condizionamento 2 Scartare l eluato FASE 5 : Preparazione del Campione Dispensare in provetta : idrolizzato Livello µl idrolizzato Livello 1 idrolizzato Livello 2 idrolizzato Livello 3 idrolizzato Livello 4 idrolizzato Livello 5 Campione idrolizzato Controlli idrolizzati Reagente E Sol. Tampone idrolizzato Livello µl idrolizzato Livello µl idrolizzato Livello µl idrolizzato Livello µl Campione 1200 µl Controlli 1200 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl Agitare al Vortex FASE 6 : Versare tutto il campione ed il precedentemente preparati nelle colonne di Clean-up e scaricare ad un flusso di 1 ml/ minuto. FASE 7 : Lavaggio delle colonne di Clean-up: Lavare con 2 ml di Reagente F Soluzione di Lavaggio 1 Scartare l eluato Lavare con 2 ml di Reagente G Soluzione di Lavaggio 2 Scartare l eluato Lavare con 3 ml di Reagente C Soluzione di Condizionamento 1 e Lavaggio 3 Scartare l eluato e portare a secco con un leggero flusso d aria FASE 8 : Eluizione rigorosamente in provette di vetro con tappo in pyrex Eluire con 1 ml di Reagente H Soluzione di Eluizione Raccogliere l eluato in provette di vetro ed agitare al vortex Release N 011 Oppiacei urinari in GC/MS Settembre

7 FASE 9 : Portare a secco l eluato con l ausilio di un flusso elio o azoto FASE 10 : Riprendere con 50 µl di Reagente M - Soluzione Derivatizzante Al vortex per 20 secondi FASE 11: Porre in stufa a 70 C per 20 minuti Raffreddare a Temperatura ambiente FASE 12 : Trasferire tutto il campione in vials con riduttore di volume INIEZIONE : Iniettare 2 µl della soluzione nel GC Release N 011 Oppiacei urinari in GC/MS Settembre

8 OPPIACEI urinari - Avvertenze REAGENTE N: SOLUZIONE TEST Morfina Diidrocodeina Codeina Etilmorfina circa ng/ml circa ng/ml circa ng/ml circa ng/ml REAGENTE R: SOLUZIONE TEST 6-MAM 6-Monoacetilmorfina circa ng/ml REAGENTE P1-P2-P3-P4-P5 : CALIBRATORI LIOFILI URINARI Lot.001 Morfina Diidrocodeina Codeina Etilmorfina 6-Monoacetilmorfina Modalità d uso e Ricostituzione: i Calibratori devono essere usati per calibrare il sistema GC. Aggiungere esattamente 5 ml di H 2 O di grado HPLC e agitare delicatamente per 20 min. fino a quando tutto il materiale non è dissolto. Prima del campionamento rimescolare gentilmente per assicurarne l omogeneità. Conservazione e stabilità: i Calibratori sono stabili 36 mesi se conservati a 2 8 C. Una volta ricostituiti 7 giorni se conservati a 2 8 C e 1 mese a 20 C. Non usarli dopo la data di scadenza. Confezionamento : 1 x 5 x 5 ml Precauzioni: questo calibratore in matrice umana deve essere trattato con cura e considerato come potenzialmente infettivo. N.B.: una volta ricostituiti i calibratori vanno stoccati separatamente. Liv. 1 Liv. 2 Liv. 3 Liv. 4 Liv. 5 REAGENTE Q1-Q2-Q3-Q4-Q5 : CALIBRATORI LIOFILI URINARI 6-MAM Lot Monoacetilmorfina Modalità d uso e Ricostituzione: i Calibratori devono essere usati per calibrare il sistema GC. Aggiungere esattamente 5 ml di H 2 O di grado HPLC e agitare delicatamente per 20 min. fino a quando tutto il materiale non è dissolto. Prima del campionamento rimescolare gentilmente per assicurarne l omogeneità. Conservazione e stabilità: i Calibratori sono stabili 36 mesi se conservati a 2 8 C. Una volta ricostituiti 7 giorni se conservati a 2 8 C e 1 mese a 20 C. Non usarli dopo la data di scadenza. Confezionamento : 1 x 5 x 5 ml Precauzioni: questo calibratore in matrice umana deve essere trattato con cura e considerato come potenzialmente infettivo. N.B.: una volta ricostituiti i calibratori vanno stoccati separatamente. Liv. 1 Liv. 2 Liv. 3 Liv. 4 Liv. 5 REAGENTE M: SOLUZIONE DERIVATIZZANTE Una volta aperta un ampolla trasferire tutto il contenuto, 1 ml, in una vial di vetro. Chiudere bene il tappo e conservare a 2-8 C. 8

9 SETTAGGIO DEL GAS-CROMATOGRAFO : Colonna VF-5ms 30 m x 0,25 mm, 0,25 µm (condizionata) Temperatura iniettore 280 C Rapporto di Splittaggio Inizio: ON split 20 0 min: OFF 1 min: ON split min: ON split 20 Temperatura 120 C x 3,25 minuti + 20 C/min fino a 250 C x 1 minuto + 40 C/min fino a 300 C x 3 minuti (corsa 15 minuti) Gas Elio 1 ml/min SETTAGGIO DETECTOR DI MASSA (4000) : Range di Massa Temperatura della Massa: 180 C; Temperatura Transfer Line: 270 C; Temperatura Manifold: 80 C Filamento on: 3 minuti CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA VF-5 MS E DELLA SIRINGA Lavare la siringa prima dell iniezione con ACETONE. Per la colonna seguire le prescrizioni del costruttore. Non condizionare la (le) colonna/e se attaccata al Detector di Massa. PULIZIA DELLA COLONNA Disconnettere il detector. Tenerla alla massima temperatura per il tempo consigliato. ( Vedi istruzioni del costruttore ) PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE CC45016 per Oppiacei urinari 2 x 5 x 5 ml CC45017 Controllo per Oppiacei urinari Livello 1 6 x 5 ml CC43018 Controllo per Oppiacei urinari Livello 2 6 x 5 ml CC43019 Controllo per Oppiacei urinari Livelli 1 e 2 2 x 6 x 5 ml Z Vial standard di vetro da 2 ml con tappo a vite 1 x 144 Pz S Riduttori di volume per vials da 2 ml 1 x 100 Pz 9

10 Oppiacei urinari (Cromatogrammi/Spettri di riferimento GC-MS) MCounts s o l. tes t.s m s 50 : : M Counts cal 1.000ngm l.sms 50: : Area: DIIDROCODEINA-TMS ng/ml min Area: ETILMORFINA-TMS ng/ml min Area: CODEINA-TMS ng/ml min Area: MORFINA-TMS 359.0ng/ml min Area: MAM-TMS ng/ml min Area: 1.101e+6 DIIDROCODEINA-TMS 1101 RF min Area: MAM-TMS RF min Area: 1.732e+6 ETILMORFINA-TMS 1732 RF min Area: 1.475e+6 CODEINA-TMS 1475 RF min Area: 2.520e+6 MORFINA-TMS 2520 RF min minutes minutes Fig. 1 : Soluzione Test Fig. 2 : urinario R.T DIIDROCODEINA R.T DIIDROCODEINA 1000 ng/ml R.T CODEINA R.T CODEINA 1000 ng/ml R.T ETILMORFINA R.T ETILMORFINA 1000 ng/ml R.T MORFINA R.T MORFINA 1000 ng/ml R.T MONOACETILMORFINA R.T MONOACETILMORFINA 1000 ng/ml 10

11 Oppiacei urinari (Cromatogrammi/Spettri di riferimento GC-MS) M Counts urina 400ngm l.sms 50: : % Spectrum 1A BP: min, Scan: 821, 50:1000, Ion: 17 us, RIC: 9.048e+6, BC Area: MORFINA-TMS ng/ml min 75% Area: DIIDROCODEINA-TMS ng/ml min Area: CODEINA-TMS ng/ml min Area: ETILMORFINA-TMS ng/ml min Area: MAM-TMS ng/ml min 50% 25% % minutes m/z Fig. 3 : Campione urinario Fig. 4 : Spettro di Massa del Test Morfina R.T DIIDROCODEINA 400 ng/ml IONE MOLECOLARE : 429 R.T CODEINA 400 ng/ml R.T ETILMORFINA 400 ng/ml R.T MORFINA 400 ng/ml R.T MONOACETILMORFINA 400 ng/ml 11

12 Oppiacei urinari (Cromatogrammi/Spettri di riferimento GC-MS) 100% Spectrum 1A BP: m in, S c a n: 84 4, 5 0 :10 0 0, Io n: 79 u s, R IC : e +6, B C % Spectrum 1A BP: m in, S c a n: 81 0, 5 0 :10 0 0, Io n: 39 u s, R IC : e +6, B C % % % % % % % 0% m/z m/z Fig. 5 : Spettro di Massa del Test 6-Monoacetilmorfina Fig. 6 : Spettro di Massa del Test Codeina IONE MOLECOLARE : 399 IONE MOLECOLARE :

13 Oppiacei urinari (Cromatogrammi/Spettri di riferimento GC-MS) 100% Spectrum 1A BP: min, Scan: 793, 50:1000, Ion: 53 us, RIC: 3.522e+6, BC % Spectrum 1A BP: min, Scan: 819, 50:1000, Ion: 37 us, RIC: 4.779e+6, BC % % % % % % % 0% m/z m/z Fig. 7 : Spettro di Massa del Test Diidrocodeina Fig. 8 : Spettro di Massa del Test Etilmorfina IONE MOLECOLARE : 373 IONE MOLECOLARE :