La standardizzazione nella pratica quotidiana della citometria a flusso: limiti e vantaggi di un approccio leggero

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1 La standardizzazione nella pratica quotidiana della citometria a flusso: limiti e vantaggi di un approccio leggero C. Ortolani (Venezia), M.C. Sanzari (Padova) 1 QUANTI SONO I MODELLI APPLICATIVI DI CITOMETRIA A FLUSSO? ALMENO DUE 2

2 MODELLO NUMERO UNO E quasi esclusivamente finalizzato alla quantizzazione E applicato principalmente alla monitorizzazione delle principali sottopopolazioni linfocitarie circolanti nell infezione da HIV 3 MODELLO NUMERO UNO E applicato anche alla monitorizzazione della mobilizzazione dei precursori emopoietici, attività complicata dalla presenza di problemi suppletivi legati alle dinamiche dell analisi dell evento raro, ma peraltro rigidamente normata (protocollo ISHAGE) 4

3 MODELLO NUMERO UNO Misura un limitato numero di antigeni (in genere CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56 e CD45) Analizza generalmente antigeni la cui numerosità varia secondo un range ridotto e la cui distribuzione è discreta 5 DISTRIBUZIONI DISCRETE CD8 CD8 CD4 CD3 6

4 MODELLO NUMERO UNO Analizza generalmente antigeni i cui range di riferimento sono noti ed importanti ai fini della presa delle decisioni Gode della disponibilità di controlli di qualità interni per tutti gli antigeni analizzati 7 MODELLO NUMERO UNO Fornisce risultati il cui valore non dipende dal giudizio dell operatore Riconosce come valore principale l accuratezza, intesa come vicinanza tra il valore ottenuto e il valore vero 8

5 Gazzetta Ufficiale n. 299 del IL MINISTRO DELLA SANITA' DECRETO 21 ottobre 1999 Definizione dei casi di AIDS conclamato o di grave deficienza immunitaria per i fini di cui alla legge 12 luglio 1999, n. 231 IL MINISTRO DELLA SANITA' di concerto con IL MINISTRO DELLA GIUSTIZIA decreta: La grave deficienza immunitaria ricorre <omissis> quando <omissis> la persona presenti <omissis> numero di linfociti T CD4+ pari o inferiore a 100/mmc, come valore ottenuto in almeno due esami consecutivi effettuati a distanza di quindici giorni. 9 MODELLO NUMERO UNO Applicato ad altri contesti genera mostri CD3+: 79% CD4+: 50% CD5+: 80% CD8+: 31% CD11c+: 5% CD16+: 7% CD19+: 10% CD20+: 10% CD24+: 5% CD25+: 5% CD75+: 5% CD103+: 5% 10

6 MODELLO NUMERO DUE E quasi esclusivamente finalizzato alla produzione di informazioni qualitative sulla natura di popolazioni circolanti presenti in un dato comparto, generalmente sangue periferico o midollare E applicato principalmente alla diagnosi delle neoplasie ematologiche 11 MODELLO NUMERO DUE Produce risultati traducibili graficamente, che devono essere interpretati sulla base delle tecniche di riconoscimento di pattern. 12

7 CONFRONTO DI PATTERN TRA FL (SX) E HCL (DX) * * 13 MODELLO NUMERO DUE Misura un elevato numero di antigeni Analizza generalmente antigeni la cui numerosità può variare secondo un range molto ampio e la cui distribuzione spesso è continua 14

8 DISTRIBUZIONI CONTINUE CD117 CD13 SSC CD34 CD16 CD45 CD11b CD11b CD13 CD16 CD14 CD64 15 MODELLO NUMERO DUE Analizza generalmente antigeni i cui range di riferimento non esistono, e con alcune eccezioni non sono importanti ai fini della presa delle decisioni Non gode della disponibilità di controlli di qualità interni per tutti gli antigeni analizzati 16

9 Kluin-Nelemans, J., E. van Wering, et al. (1996). "Pitfalls in the immunophenotyping of leukaemia and leukaemic lymphomas: survey of 9 years of quality control in The Netherlands. Dutch Cooperative Study Group on Immunophenotyping of Haematological Malignancies (SIHON)." Br J Haematol 95(4): It appeared that the major faults were caused by suboptimal antibody selection and erroneous interpretation of the results obtaines, rather than by technical errors. 17 MODELLO NUMERO DUE Fornisce risultati che dipendono dal giudizio dell operatore, in quanto ciò che si vedrà dipenderà dalla scelta dei pannelli, e quindi dall operatore; ciò che si saprà dipenderà dal giudizio complessivo dei dati prodotti, e quindi ancora dall operatore 18

10 MODELLO NUMERO DUE Riconosce come valore principale la plausibilità, intesa come vicinanza tra la diagnosi formulabile sulla base dei risultati ottenuti, e la diagnosi vera 19 Which B-cell disorders can you diagnose using only flow cytometry? 2.1 Follicular Lymphoma 2.2 Diffuse Large B-cell Lymphoma 2.3 Burkitt Lymphoma 2.4 B-cell Chronic Lymphocytic Leukaemia 2.5 Mantle Cell Lymphoma 2.6 CD5+/CD23- LPD NOS 2.7 Systemic Marginal Zone Lymphoma 2.8 Extranodal Marginal Zone Lymphoma 2.9 Hairy Cell Leukaemia 2.10 CD5 negative B-cell LPD NOS 3.1 Multiple Myeloma 3.2 Monoclonal Gammopathy of Uncertain Signficance 3.3 Plasmacytoma of Bone 3.4 Soft Tissue Plasmacytoma 3.5 Monoclonal Deposition Disease 3.6 Primary Amyloidosis Rawstron A, mod. 20

11 21 MODELLO NUMERO UNO CD3+: 79% CD4+: 50% CD5+: 80% CD8+: 31% CD11c+: 5% CD16+: 7% CD19+: 10% CD20+: 10% CD24+: 5% CD25+: 5% CD75+: 5% CD103+: 5% 22

12 MODELLO NUMERO DUE Il 50% di tutti i B linfociti, che costituiscono il 10% dei linfociti presenti nel campione, dimostra parametri fisici aumentati ed espressione del fenotipo CD19+ brillante, CD20+ brillante, CD11c+ brillante, CD24+ debole, CD25+, CD75+, CD103+. Il dato è coerente con diagnosi di leucemia a cellule capellute. 23 Interpretation of Results The stand alone report limited to a simple description of phenotypic changes is discouraged since this information by itself is seldom adequate for patient management. Everyone supported the view that the final FCM report always should include a written interpretation of the results obtained and an explanation of their significance. There was general agreement that the following essential elements should be included in the report: (1) a statement indicating whether an abnormal population is identified, (2) a qualitative description of the phenotype of the abnormal population(s), (3) a differential diagnosis consistent with the FCM results; if clinical, morphologic or other laboratory information is available, a definite diagnosis should be rendered if at all possible, and (4) if no abnormal population is identified, a statement of the relative proportion of the normal cells in the sample. 24

13 Report on the First Latin American Consensus Conference for Flow Cytometric Immunophenotyping When pertinent, the multimodal (most commonly bimodal) expression of a certain antigen should also be stated in the report. It is also important to describe the coexpression of several antigens on the neoplastic cells because, in many instances, this information may be the cornerstone of classification. The interpretation of the immunophenotype should always be stated, preceeded by the word compatible or consistent with, e.g., Compatible with B-cell line acute lymphoblastic leukemia. 25 Diagnostic conclusions. It is always recommended that a diagnostic conclusion is given, when applicable. 26

14 IN SINTESI La qualità nella citometria a flusso delle neoplasie ematologiche dipende fortemente dall operatore è fortemente influenzata dalle caratteristiche proprie della fase preanalitica e postanalitica 27 DI CONSEGUENZA La completa standardizzazione è raggiungibile solo al prezzo di linee guida particolarmente complesse elevato rischio di mancata compliance 28

15 MA COSA SUCCEDEREBBE SE Spostassimo l enfasi dalla accuratezza alla plausibilità? Spostassimo l attenzione dal controllo di qualità interno alla verifica delle prestazioni strumentali? Creassimo un corpus di nozioni separate (Good Cytometry Practice!) da anteporre alle linee guida e da trasformare in oggetto di formazione separata? 29 GOOD CYTOMETRY PRACTICE! la scelta degli antigeni da studiare nell analisi delle diverse forme; la scelta dei cloni irrinunciabili, decisa allo scopo di evitare disomogeneità di risultato in tutti quei casi in cui esistano provate differenze di comportamento tra clone e clone; la scelta dei fluorocromi obbligati, da adottare nei casi in cui il risultato dell analisi dipenda dall efficienza della molecola fluorescente; le modalità di refertazione. 30

16 GOOD CYTOMETRY PRACTICE! CD19 APC CD19 PE-CY7 CD5 FITC CD5 APC 31 MA COSA SUCCEDEREBBE SE Graduassimo i livelli di intervento e definissimo livelli minimi di utilità clinica da garantire in ogni laboratorio? 32

17 LIVELLI MINIMI DI UTILITA CLINICA riconoscere la presenza di una popolazione di elementi immaturi; effettuare l attribuzione di linea di una popolazione di elementi immaturi 33 LIVELLI MINIMI DI UTILITA CLINICA riconoscere popolazioni di B linfociti maturi ristretti per una catena leggera; riconoscere popolazioni di T linfociti maturi con fenotipo aberrante; caratterizzare una B-CLPD per i principali antigeni CLPD-rilevanti. 34

18 EMATOGONI 35 HES CON POPOLAZIONE T ABERRANTE 36

19 MA COSA SUCCEDEREBBE SE Creassimo un approccio leggero che permetta il raggiungimento di questi obiettivi senza compromettere la qualità globale e la compliance? 37 RISULTATI PRELIMINARI 38

20 CARATTERIZZAZIONE DELLE B-CLPD Si considera irrinunciabile lo studio delle catene leggere delle immunoglobuline e degli antigeni CD5, CD10, CD11c, CD19, CD20, CD23, CD45 e CD CARATTERIZZAZIONE DELLE CLPD T/NK Si considera irrinunciabile lo studio degli antigeni CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD16, CD25, CD45, CD56, CD57, HLA- DR, nonché della TdT e del TCR gamma/delta. 40

21 RICONOSCIMENTO DI POPOLAZIONI B RISTRETTE Si considera irrinunciabile procedere alla ricerca di popolazioni B ristrette mediante la valutazione contemporanea della espressione delle catene leggere kappa e lambda, e dell espressione degli antigeni CD19 e CD RICONOSCIMENTO DI POPOLAZIONI IMMATURE Si considera irrinunciabile procedere alla valutazione dell entità di espressione di CD45 vs SSC, eventualmente perfezionata dalla valutazione di CD34, CD117 e HLA-DR. 42

22 RICONOSCIMENTO DELLA LINEA DI POPOLAZIONI IMMATURE Si considera irrinunciabile procedere al riconoscimento della linea di popolazioni immature mediante la valutazione dell entità di espressione di CD45 vs SSC, accompagnata dalla consensuale valutazione degli antigeni CD7, CD19 e CD13 e/o CD VANTAGGI E LIMITI 44

23 VANTAGGI Maggiore agilità, maggiore compliance, maggiore omogeneità Enfatizzazione della responsabilità finale dell operatore e del suo ruolo consulenziale 45 LIMITI Necessità di attivare un motore di formazione specifica continua 46

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