Paola Foladori, Laura Bruni, Giuliano Ziglio Potenzialità della citometria a flusso nell analisi di matrici ambientali

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1 Quaderni del Dipartimento SAN 2 Paola Foladori, Laura Bruni, Giuliano Ziglio Potenzialità della citometria a flusso nell analisi di matrici ambientali

2 INDICE PRESENTAZIONE INTRODUZIONE PRINCIPI DI FLUORESCENZA E DI SCATTERING INTRODUZIONE LA LUCE LA DIFFUSIONE O SCATTERING DELLA LUCE Principi fisici dello scattering Distribuzione dell'intensità di scattering Il metodo di Rayleigh Il metodo di Rayleigh-Gans Il metodo di Mie LA FLUORESCENZA Introduzione La fluorescenza molecolare Il fenomeno di energy transfer CONFIGURAZIONE DEL CITOMETRO A FLUSSO INTRODUZIONE TIPI DI CITOMETRI A FLUSSO E PERCORSI OTTICI Citometri a simmetria ortogonale Citometri a flusso a epi-illuminazione SORGENTI DI LUCE SISTEMI DI INIEZIONE DEL CAMPIONE CELLE DI FLUSSO E PRINCIPI IDRODINAMICI DEL FLUSSO LIQUIDO Le celle di flusso nei citometri laser Le celle di flusso nei citometri con lampada ad arco RACCOLTA DELLA LUCE TIPOLOGIE DI FILTRI OTTICI Filtri passa banda Filtri di bordo...39

3 3.7.3 Filtri dicroici DISPOSITIVI DI RILEVAZIONE DEL SEGNALE DETECTOR E AMPLIFICATORE ESEMPI DI CITOMETRI A FLUSSO COMMERCIALI IL SORTING IDENTIFICAZIONE CITOMETRICA DELLE CELLULE BATTERICHE MEDIANTE MARCATURA CON FLUOROCROMI INTRODUZIONE INADEGUATEZZA DELLE TECNICHE DI COLTIVAZIONE PER LA QUANTIFICAZIONE DELLE CELLULE BATTERICHE IN MATRICI AMBIENTALI UTILITÀ DELLE TECNICHE DIRETTE PER L ANALISI MICROBIOLOGICA MARCATURA DELLE CELLULE TOTALI IL CONCETTO DI VITALITÀ Le funzioni cellulari legate alla vitalità Discriminazione delle cellule sulla base dell integrità di membrana Discriminazione delle cellule sulla base dell attività metabolica Confronto tra le varie tecniche di valutazione della vitalità FLUOROCROMI ACCOPPIAMENTO TRA TECNICHE DI IBRIDAZIONE MOLECOLARE IN SITU (FISH) E CITOMETRIA A FLUSSO QUANTIFICAZIONE DELLE CELLULE BATTERICHE MEDIANTE CITOMETRO A FLUSSO INTRODUZIONE TIPI DI SEGNALI ACQUISITI DAL CITOMETRO A FLUSSO Distribuzioni di frequenza (istogrammi) Analisi multiparametriche (citogrammi) Misura della concentrazione delle particelle IMPOSTAZIONE DELLO STRUMENTO PER L ACQUISIZIONE DEI SEGNALI Impostazione delle soglie Scale lineari e logaritmiche Gating Allineamento dello strumento Settaggio di riferimento LA COMPENSAZIONE DEI SEGNALI DI FLUORESCENZA PRESTAZIONI DEI CITOMETRI A FLUSSO Accuratezza dell analisi citometrica FORMATO STANDARD PER I FILE DI ANALISI MISURA DEL BIOVOLUME CELLULARE E DELLA BIOMASSA INTRODUZIONE PROBLEMATICHE ASSOCIATE ALLA CONVERSIONE TRA SEGNALE DI FORWARD- ANGLE-LIGHT-SCATTERING E LE DIMENSIONI BATTERICHE LA TEORIA DI RAYLEIGH-GANS PER LE CELLULE BATTERICHE SVILUPPO DI UNA PROCEDURA PER LA CONVERSIONE TRA SEGNALE DI FALS E LE DIMENSIONI BATTERICHE...93

4 6.4.1 Materiali per l analisi citometrica e microscopica Implementazione del modello matematico di Rayleigh-Gans Conversione del segnale di scattering in volume nel caso di particelle sintetiche CONVERSIONE DEL SEGNALE DI SCATTERING IN VOLUME NEL CASO DI CELLULE BATTERICHE DI CAMPIONI AMBIENTALI Analisi citometrica Analisi microscopica Confronto tra analisi citometrica e analisi microscopica Osservazioni sul calcolo del biovolume in presenza di aggregati batterici CALCOLO DELLA BIOMASSA CELLULARE A PARTIRE DAL BIOVOLUME APPLICAZIONE DELLA CITOMETRIA A FLUSSO A CAMPIONI AMBIENTALI: PROBLEMI E SOLUZIONI INTRODUZIONE CONCENTRAZIONI BATTERICHE NEI CAMPIONI AMBIENTALI INDICAZIONI PER LA PREPARAZIONE DEI CAMPIONI PER L ANALISI CITOMETRICA INDICAZIONI PER IL PRETRATTAMENTO DEI CAMPIONI PER L ANALISI CITOMETRICA ALTERNATIVE PER IL PRETRATTAMENTO DEI CAMPIONI AUTOFLUORESCENZA MISURA DELLA BIOMASSA ATTIVA IN IMPIANTI DI DEPURAZIONE CENNI AL PROCESSO DI DEPURAZIONE DELLE ACQUE REFLUE LA BIOMASSA CELLULARE NEI PROCESSI A FANGHI ATTIVI SVILUPPO DI UNA PROCEDURA PER LA QUANTIFICAZIONE DELLE CELLULE BATTERICHE NEI PROCESSI A FANGHI ATTIVI Materiali per l analisi citometrica e microscopica Dispersione degli aggregati batterici nei campioni Precisione ed accuratezza dell analisi citometrica DETERMINAZIONE DEL BIOVOLUME CELLULARE E DELLA BIOMASSA LA BIOMASSA CELLULARE NEGLI IMPIANTI DI DEPURAZIONE Fanghi attivi Acque reflue grezze ed acque effluenti dopo trattamento CONCLUSIONI INDAGINI MICROBIOLOGICHE SU MATRICI COMPOSTABILI CENNI SUL PROCESSO DI COMPOSTAGGIO FINALITÀ DELLE INDAGINI MICROBIOLOGICHE SULLE MATRICI COMPOSTABILI GLI IMPIANTI DI COMPOSTAGGIO MONITORATI Modalità di campionamento MATERIALI E METODI PER L INDAGINE MICROBIOLOGICA EVOLUZIONE DEL PROCESSO DI COMPOSTAGGIO PER IL COMPOST Dinamica della temperatura durante il processo di compostaggio Dinamica dell umidità e dei solidi volatili...140

5 9.6 RISULTATI DELL ANALISI CITOMETRICA (FCM) Risultati della quantificazione delle cellule vitali ANALISI COMPLESSIVA DEI RISULTATI QUANTIFICAZIONE DELLA BIOMASSA CELLULARE CONCLUSIONI QUANTIFICAZIONE DELLA CARICA BATTERICA IN CORSI D ACQUA E RECETTORI DI SCARICHI DEPURATI INTRODUZIONE METODI MICROBIOLOGICI CLASSICI LIMITI DELLA MICROBIOLOGICA CLASSICA IMPIEGO DELLA CITOMETRIA A FLUSSO PER LA QUANTIFICAZIONE BATTERICA IN MATRICI D ACQUA PROVENIENTI DA ECOSISTEMI ACQUATICI APPLICAZIONE DELLA CITOMETRIA A FLUSSO A CAMPIONI DI ACQUE SUPERFICIALI Risultati ottenuti Dalla conta batterica totale ad Escherichia coli EFFETTO DEL TELLURITO (TEO 3 2- ) SULLE CARATTERISTICHE DI CRESCITA DI RHODOBACTER CAPSULATUS INTRODUZIONE MATERIALI E METODI RISULTATI E CONCLUSIONI BACK TO THE FUTURE - THE OBSERVATION OF THE SINGLE BACTERIUM INTRODUCTION CYTOMETRY, BULK AND SINGLE CELL MEASUREMENTS TECHNICAL DEVELOPMENT OF CYTOMETRY FLOW CYTOMETRY AND SINGLE CELL SORTING SINGLE CELLS AND CLUSTERS BACK TO THE FUTURE BIBLIOGRAFIA...183

6 1 Introduzione La definizione di citometria a flusso si deduce dal nome stesso: misura (-metria) di proprietà di cellule (cito-) che vengono trasportate verso detectors fissi da un fluido vettore (flusso). La citometria a flusso nasce come disciplina, grazie allo sviluppo dei primi strumenti, a partire dagli anni 60. Tra le prime apparecchiature commerciali si annoverano quella sviluppata da Lou Kamentsky (Cytofluorograph) equipaggiata con un laser e lo strumento progettato da Dittrich e Göhde operante con lampada ad arco (Phywe ICP). Entrambi iniziarono ad essere commercializzati negli anni 70 e vennero immediatamente applicati nel campo immunologico e della biologia cellulare (Steen, 2000). Il loro impiego nel settore della microbiologia avvenne invece solo successivamente. Steen (2000) in un suo excursus tra passato e futuro della citometria a flusso, attribuisce le prime applicazioni a Paau et al. (1977) e a Bailey et al. (1977) e sottolinea come esse, nel campo della microbiologia, fossero rimaste limitate nel tempo, nonostante le enormi potenzialità che tale tecnica è in grado di offrire. A questo riguardo H.B. Steen nel ricordare i primi pionieri della citometria a flusso applicata alla microbiologia, tra cui lui stesso, scrive but that was about it. No one seemed to realise that they had hit a scientific gold mine. In fact, it seems to me that, even now, the majority of bacteriologists are not aware of the possibilities that flow cytometry offers for acquiring knowledge about bacteria which is difficult, if not impossible, to obtain by other methods (Steen, 2000). Nel tempo, le limitate applicazioni allo studio delle cellule batteriche trovano giustificazione probabilmente nei seguenti aspetti: 1) il citometro a flusso è sempre stato uno strumento molto utilizzato nell analisi di cellule eucariote; considerando le piccole dimensioni

7 delle cellule batteriche rispetto a quelle eucariote, si incontrano molte più difficoltà nell analisi delle prime rispetto alle seconde; 2) i citometri a flusso in commercio non sempre presentano una sensibilità adeguata per l analisi di cellule batteriche, per le quali è necessario disporre di rilevatori di scattering e di fluorescenza estremamente sensibili. Tali limitazioni hanno probabilmente scoraggiato negli anni chi si è approcciato all analisi batterica mediante citometria a flusso, soprattutto se provenienti da esperienze sulle più grandi cellule eucariote (Steen, 2000). Questa monografia, pubblicata in occasione del corso Potenzialità della citometria a flusso per l indagine di matrici ambientali organizzato dal Laboratorio di Ingegneria Sanitaria-Ambientale (LISA) dell Università di Trento, presenta una raccolta di contributi inerenti i principi teorici e di funzionamento della citometria a flusso, applicata al campo della microbiologia, nonché i risultati di studi e ricerche in differenti matrici ambientali. Questa monografia non vuole essere un trattato esaustivo relativamente alla tecnica citometrica, della quale vengono invece illustrati i principi fondamentali e le metodologie di interpretazione delle analisi. Sulla citometria a flusso sono disponibili testi di riferimento come Melamed et al. (1990) e Shapiro (1988) che ne forniscono in dettaglio le modalità di funzionamento. Per quanto riguarda invece le applicazioni nel campo della microbiologia è disponibile il testo di Lloyd (1993). Negli ultimi anni sono state pubblicate alcune review sulle applicazioni della citometria alla microbiologia ambientale, a partire dalle prime di Porter et al. (1996; 1997a), alle successive più recenti di Shapiro (2000). Questo testo vuole semplicemente essere d aiuto a chi, occupandosi di ingegneria e di scienze ambientali, voglia interessarsi a questa innovativa tecnica. La citometria a flusso, che trova da anni la sua più ampia applicazione nella ricerca e nella diagnostica in campo medico (ematologia, immunologia, oncologia, ), costituisce attualmente uno strumento molto promettente nel settore della microbiologia: dalle applicazioni nel settore farmacologico, per indagare gli effetti di agenti antimicrobici sulla crescita cellulare, alla microbiologia clinica, per la rapida individuazione di patogeni importanti in campo sanitario, nel settore alimentare, e nei processi di fermentazione. Nella pubblicazione a cura dell OMS Emerging Issues in Water and Infectious Disease (OMS, 2003) si accenna alle utili implicazioni della citometria a flusso nel settore della microbiologia delle acque: Flow

8 cytometry is a powerful technique [...] to quantify particles or to recognise structural features of cells [...] information can be gained that allow the rapid quantification of the organisms [...] the implications of these advances to the management of water quality and the protection of public health may be far reaching. In questa monografia verrà descritta l applicazione della citometria a flusso a nuovi campi di indagine nell ambito dei settori tipici dell ingegneria ambientale, dalla protezione dell ambiente alle tecnologie di trattamento degli effluenti. Numerose ed estremamente diversificate per ruolo e per funzione sono le popolazioni batteriche presenti nell ambiente. Frequentemente le tecniche convenzionali per l indagine microbiologica, basate tradizionalmente su metodi colturali, possono portare ad una descrizione non esatta, o comunque incompleta, della realtà ambientale studiata, causa le limitazioni legate a tali metodiche, come per esempio non coltivabilità di gran parte dei microrganismi presenti nell ambiente, lunghi tempi di processamento dei campioni mediante microscopia, ecc. Si può quindi ritenere che la conoscenza attuale sulla composizione microbica di matrici ambientali quali compost, fanghi e biofilm di depurazione, acque superficiali e sotterranee, ecc., sia limitata dai metodi di indagine disponibili. L applicazione della citometria a flusso nel campo microbiologico contribuisce certamente ad aumentare il livello di automazione delle procedure analitiche ed il livello di precisione ed accuratezza nella quantificazione del numero di cellule analizzate, rispetto a quanto è possibile fare mediante microscopia, causa il limitato numero di cellule enumerabili. Il citometro a flusso è infatti in grado di contare un numero di cellule elevato, dell ordine di (con velocità fino a 1000 cellule per secondo), che migliora la rappresentatività statistica della quantità di cellule effettivamente presente nei campioni originali; ciò permette quindi una più realistica estrapolazione e una maggiore veridicità del risultato analitico. Inoltre la citometria a flusso dà la possibilità di effettuare determinazioni a livello di singola cellula mediante analisi multiparametriche, ovvero incrociando simultaneamente misure di fluorescenza in differenti bande di lunghezza d onda con analisi di scattering di luce a diversi angoli di raccolta. Nei capitoli di questo volume verranno sviluppati diversi aspetti della citometria a flusso, dalla trattazione dei principi della fluorescenza e dello scattering (capitolo 2) e della configurazione ottica e idrodinamica del citometro a flusso (capitolo 3), all impostazione dei criteri per

9 effettuare l analisi citometrica su campioni ambientali, oggetto dei capitoli 4, 5 e 6. Infine l ultima parte del volume è dedicata alla descrizione di alcune esperienze di indagine su matrici ambientali in cui la citometria a flusso ha dato un utile e a volte decisivo supporto. In particolare nel capitolo 7 vengono presentati problemi e soluzioni che si incontrano quando si affronta l analisi citometrica di matrici ambientali, mentre i casi specifici relativi agli impianti di depurazione, agli impianti di compostaggio ed ai corsi d acqua recettori sono trattati rispettivamente nei successivi capitoli 8, 9 e 10. L indagine sulle caratteristiche di crescita di specifici ceppi batterici rappresenta un ulteriore campo di indagine per la citometria a flusso, ed una applicazione è oggetto del capitolo 11. Infine, il capitolo 12, ultimo della monografia, ma non certo per l importanza, è riservato ad una eccellente presentazione della citometria a flusso, attraverso il passato, il presente ed il futuro nel campo della microbiologia. Il titolo emblematico, parte dal punto di vista del single bacterium per creare una nuova prospettiva nell indagine dei batteri. Non dall insieme per definire il singolo, ma dal singolo per capire la composizione dell insieme di popolazioni. A G. Nebe-von-Caron, autore di tale intervento, si devono interessanti contributi sulle applicazioni della citometria a flusso, soprattutto per quanto riguarda il concetto di vitalità delle cellule batteriche, definizione a cui gli Autori hanno fatto più volte riferimento in questo volume.