Il protocollo. Pag 1 di 5

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1 Il protocollo MATERIALE a) 1 piastra per la coltivazione dei batteri (contenente TYR) b) Una confezione di anse sterili c) 1 tubino da microcentrifuga da 1.5 ml d) Un pestello (va bene anche il tappo di una penna) e) Acqua ossigenata al 3% f) Alcool denaturato PER I SEMI DI PISELLO E LA CRESCITA DELLE PIANTINE: a) 100 semi di pisello; b) Acqua ossigenata al 3% ; c) 12 buste di crescita per piante; d) Una scatola per alloggiare le buste; e) Un tubo con tappo a vite da 50ml contenente una soluzione salina per piante (Jensen); f) 18 pipette da 2 ml con filtro di cotone (12 per le buste + 6 per il Jensen); g) 2 pipette da 25 ml con filtro di cotone; h) Acqua minerale non gasata i) 3 bicchieri di carta l) Nastro adesivo Pag 1 di 5

2 PER L'INFEZIONE a) Una piastra di Petri contenente il ceppo batterico opportunamente cresciuto; b) Una piastra contenente TYR; c) Una confezione di anse sterili; d) Qualche striscia di Parafilm; e) Una busta di plastica da autoclave. f) 1 pipetta da 2 ml con filtro di cotone; I BATTERI: sono un ceppo di Rhizobium leguminosarum biovar viciae capace di infettare piante di fava (dai suoi noduli, infatti, vengono estratti i batteri per il nostro esperimento), di piselli (piante che infetteremo durante l esperimento), veccia, latirus e lenticchia. La soluzione JENSEN che contiene diversi sali, ma non azoto, in quanto sarà compito dei batteri fissare l'azoto atmosferico. Lista dei materiali non inclusi nel kit e di cui fornirsi. a) Scatola per alloggiare le buste contenenti i semi; b) Acqua ossigenata al 3%; c) Alcool denaturato; d) Nastro adesivo; e) Acqua minerale non gasata; f) Bicchieri di carta; FASE I - GIORNO 1 ESTRAZIONE BATTEROIDI Preleva le piante di fava con le radici nodulate dal terreno (si può fare in tutta Italia da ottobre a maggio). Immergi le radici in un bicchierino contenente acqua ossigenata al 3% per 30 secondi per eliminare batteri presenti sulla superficie esterna dei noduli e delle radici. Lava le radici immergendole in un bicchierino contenente alcool denaturato per 1 secondo e poi sciacquare abbondantemente due volte con acqua minerale immergendole in due diversi bicchieri. Preleva (in condizioni sterili usando alcool per disinfettare ogni strumento usato per le operazioni) i singoli noduli e porli in un tubino da 1.5 ml (in numero di circa 10 per ciascun tubo) dopo averlo opportunamente siglato. Aggiungi nel tubino una goccia di acqua minerale e schiacciare i noduli con un pestello preventivamente sterilizzato (puo andare bene il tappo di una penna sterilizzato con dell alcool). Pag 2 di 5

3 Immergi nel tubino un ansa sterile, in modo da prelevare una goccia della sospensione ottenuta dallo schiacciamento dei noduli e strisciare delicatamente la sospensione sulla piastra TYR precedentemente siglata La piastra deve essere sigillata con parafilm ed incubata a tempertaura ambiente dopo essere stata capovolta per evitare che le goccioline di condensa (che inevitabilmente derivano dall umidità della piastra) ricadano sul terreno mescolando le colonie batteriche. Anse e tubini devono essere buttati nella busta da autoclave se è possibile sterilizzare il tutto, altrimenti è meglio sterilizzare tutti gli scarti in varecchina. PREPARAZIONE DELLA SCATOLA E DELLE BUSTE E' necessario preparare una scatola di cartone per alloggiare le buste che dovranno essere sistemate all'interno in modo da rimanere al buio lasciando sporgere solo il lato delle buste che presenta la tasca tratteggiata. La scatola deve essere quindi interamente chiusa, ma vanno predisposte su una base tante fenditure quante sono le buste che si desidera inserire. L'ideale è quindi avere una scatola con 12 fenditure lunghe quanto le buste, ma più corte delle pipette in modo che esse forniscano appoggio per le buste stesse. Taglia due pezzetti di nastro adesivo ed attaccarne i due estremi in alto sulla faccia interna della plastica della busta (più o meno equidistanti dal centro della busta) lasciando la parte di carta con la tasca tratteggiata rivolta verso di voi. Fa' aderire al retro della busta una pipetta in posizione orizzontale Pag 3 di 5

4 e quindi attaccarla facendo aderire gli altri due estremi di nastro adesivo. MESSA IN COLTURA DEI SEMI DI PISELLO Prendi circa 80 semi di pisello, mettili nel bicchierino ed addiziona acqua ossigenata al 3%, quale disinfettante in quantità opportuna ed agita lentamente per qualche minuto. Lascia agire per 10'. Elimina lentamente l acqua ossigenata e lavare con acqua. Colloca (mediante dita sterilizzate con l alcol) 4 piselli regolarmente distanziati nell apposita tasca di ogni busta di crescita ed alloggia queste ultime nella scatola. Addiziona lateralmente (evitando di bagnare direttamente i piselli) in ogni busta di crescita circa 1ml di soluzione salina (Jensen) mediante una pipetta da 2ml e 19ml di acqua con la pipetta da 25ml. Le pipette a bocca si utilizzano in modo simile a delle cannucce: si aspira il liquido fino a che questo non raggiunga la tacca desiderata e si impedisce l'ingresso di aria nella pipetta bloccandone l'estremità superiore con il dito indice. Per far scendere il liquido dalla pipetta basta allontanare il dito. Attenzione a non bagnare il filtro di cotone aspirando troppo liquido: se questo accade la pipetta sarà recuperabile eliminando il filtro di cotone con una pinzetta e andrà riutilizzata con maggiore cautela. Incuba i piselli in una stanza luminosa e con una temperatura sufficientemente costante di 20 C. Addiziona acqua periodicamente in modo da permettere che le buste abbiano in media 20ml di acqua. ATTENZIONE!!!...per la riuscita dell'esperimento è opportuno che: 1) Il controllo delle buste di crescita sia, per quanto possibile, quotidiano; 2) L'acqua utilizzata sia preferibilmente minerale naturale; 3) L'acqua sia addizionata delicatamente e lateralmente; Pag 4 di 5

5 QUANDO LA RADICHETTA HA RAGGIUNTO LA LUNGHEZZA DI 3-4 CM PROCEDI ALL INFEZIONE DEI SEMI CON I BATTERI I batteri devono essere prelevati mediante anse di plastica, inoculati nell acqua minerale (circa 20 ml) in bicchierini precedentemente siglati ed agitati energicamente con l ansa. Mediante pipette da 2 ml inocula 2 ml di sospensione batterica per ogni busta. Avendo a disposizione 12 buste di crescita (Attenzione!!! siglare opportunamente le buste di crescita), infetta 6 buste con i batteri e lascia gli altri 6 non infettati in modo che possano fungere da controllo. Piastre,anse, parafilm, bicchierini vengono gettati nella busta da autoclave. Le buste di crescita sono rimesse nella scatola e lasciate crescere per 45 giorni provvedendo a bagnarle periodicamente in modo che vi sia sempre acqua (20 ml) nelle buste. Piastre,anse, parafilm, bicchierini vengono gettati nella busta da autoclave. Le buste di crescita sono rimesse nella scatola e lasciate crescere per 45 giorni provvedendo a bagnarle periodicamente in modo che vi sia sempre acqua (20 ml) nelle buste. Ed ORA? BUONA FORTUNA, MA RICORDA DI 1) Controllare le buste di crescita, per quanto possibile, ogni giorno; 2) Addizionere l'acqua a temperatura ambiente nelle buste di crescita delicatamente e lateralmente; 3) Usere pipette diverse per il gruppo di piselli infettati e per quelli non infettati in modo da evitare contaminazioni reciproche. A tal fine sarà inoltre opportuno non prendere l'acqua direttamente dalla bottiglia ma riempire 2 bicchieri diversi e prelevare l'acqua da questi ultimi. 4) Addizionere 1 ml di soluzione Jensen in ogni busta una volta alla settimana. Pag 5 di 5