Applicazione della Real-Time PCR per l'identificazione di specie carnee in alimenti

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1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PADOVA BIOMEDICINA COMPARATA ED ALIMENTAZIONE Dip. Saità pubblica patologia comparata ed igiee veteriaria Corso di laurea magistrale i Biotecologie Per L alimetazioe Applicazioe della Real-Time PCR per l'idetificazioe di specie caree i alimeti Relatore Dott.ssa, Barbara Cardazzo Correlatore Dott.ssa, Claudia Zampiero Laureado Simoe Biodaro Matricola ANNO ACCADEMICO

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3 SOMMARIO INTRODUZIONE 1.1 Frodi alimetari ella storia Defiizioe delle frodi alimetari La giurisdizioe delle frodi alimetari e commerciali Cause che iducoo alle frodi alimetari Le frodi alimetari più diffuse Tracciabilità Evoluzioe della biologia molecolare per l'idetificazioe di specie PCR Sviluppi della PCR quatitativa PCR Real-Time L'importaza della validazioe del metodo SCOPO DELLA TESI MATERIALI E METODI Campo di applicazioe e campioi di riferimeto Protocollo di estrazioe Dosaggio del DNA estratto Preparazioe della mix di reazioe e caricameto Descrizioe del sistema Real-Time PCR: Applied Biosystem 7500/7500 Fast Real-Time PCR System Iterpretazioe dei dati Calcolo cut-off RISULTATI Determiazioe del cut-off Aalisi del DNA ei campioi commerciali...44

4 5. DISCUSSIONE CONCLUSIONI BIBLIOGRAFIA...58

5 RIASSUNTO L'espressioe frode alimetare si riferisce ad ua pluralità di codotte illecite volte alla adulterazioe, alterazioe, cotraffazioe, sofisticazioe dei prodotti alimetari. La sofisticazioe si cofigura come u'operazioe fraudoleta attraverso cui il prodotto alimetare viee sostituito i alcui suoi igredieti e trattato i modo da rederlo più attraete o simile ad altri prodotti più pregiati e, coseguetemete, più costosi. Il cotrollo delle specie aimali coteute egli alimeti è importate al fie di tutelare i cosumatori da evetuali frodi e di tutelare le loro covizioi etico-religiose. Il metodo utilizzato ell'idetificazioe di specie i alimeti è la PCR Real-Time i quato è caratterizzata da ua maggiore sesibilità e specificità. La sua applicazioe all'idetificazioe e alla quatificazioe di specie degli igredieti preseti egli alimeti permette di verificare la corretta etichettatura i tempi ridotti e co u'alta affidabilità. I questo studio è stata utilizzato, per le specie più commerciali, lo strumeto del cut-off defiito all'1% di care target i care o target creato e verificato come da raccomadazioi EURL. Ioltre soo stati aalizzati 195 campioi di alimeti perveuti presso l'istituto Zooprofilattico sperimetale delle Veezie al fie di verificare la corrispodeza co quato dichiarato i etichetta. Di questi 174 erao campioi destiati all'alimetazioe umaa e 21 all'alimetazioe per aimali da affezioe. Nell'ambito dell'alimetazioe umaa le o coformità si soo rilevate 4 o coformità (i totale il 2%), distribuite i particolare tra i campioi di kebab (7%), u caso di ravioli coteeti care equia ed u caso di care cotta aalizzata i autocotrollo per verificare la preseza della specie coiglio verificatasi poi gatto. Nei campioi di pet-food le o coformità arrivao addirittura al 76%, ei campioi costituiti da farie aimali utilizzate per la produzioe di magimi o si è osservata la preseza della specie idicata.

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7 Object 21 ABSTRACT The term food fraud refers to a plurality of illegal coducts, such as adulteratio, alteratio, falsificatio ad substitutio of food. The food sophisticatio cosists i a fraudulet act through which food igrediets are substituted i order to make a food product more attractive or similar to other precious products ad therefore more expesive. Cotrollig of aimal species i food is importat for the protectio of cosumers from fraud ad their ethical ad religious belief. The method used for idetificatio of food species is the Real Time PCR, a techique characterized by its high sesitivity ad specificity. Its applicatio i idetificatio ad quatificatio of species preset i the food igrediets allows to verify the correct labelig i less time ad with high reliability. I this study has bee used, for most commercial species, the method of cut-off at 1% of target meat i o target meat, created ad verified accordig to EURL recommedatios. Furthermore 195 food samples were aalyzed. These samples were received at the experimetal Zooprofilattico Istitute of Veezie i order to verify its coformity with the label claim. Of these samples, 174 were iteded for huma cosumptio ad 21 for aimals with disease. With regard to samples for huma food, 4 ocoformity were observed (total 2%), distributed betwee samples of kebab (7%), oe case of ravioli cotaiig horse meat ad a case of cooked meat aalyzed i selfcotrol to verify the presece of rabbit species that occurred the cat. I pet food samples o-coformity eve come to 76%. I the samples of aimal meal used for productio of aimal feed, the presece of the species idicated was ot observed

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9 1. FRODI ALIMENTARI IN ITALIA 1.1 Le frodi alimetari ella storia La frode alimetare può essere cosiderata ua delle attività crimiose più atiche e saldamete radicate ella vita sociale. I primi reati cotro la salute, attraverso adulterazioi e cotraffazioi di alimeti, si soo avuti co i primi scambi commerciali. Ad esempio ell'atico Egitto chi reiteratamete poeva i essere truffe i ambito alimetare veiva codaato a morte. Oltre agli aspetti repressivi, gli egizi risultao essere stati i precursori ache delle attività di prevezioe dal mometo che appoevao il marchio sulle cari macellate (Nebbia G., 1962). Le prime misure i materia di prevezioe dei reati alimetari si soo registrate ache ad Atee e ell'atica Grecia, i cui è stata riscota la preseza di vigili saitari, detti Agora omi. Ad essi era demadato il compito di cotrollare il commercio e, addirittura, alcui di loro erao specializzati ello scoprire le frodi sul vio. Ua delle frodi alimetari più frequeti, ifatti, cosisteva el trattare i vii giovai, co particolari sostaze, per poterli vedere come vii d'aata. Nel diritto romao si riscotrao molteplici orme di tipo verticale, vale a dire specifiche per u dato prodotto alimetare, ed i particolare era prevista la pea dell'igiuria per chi iquiava gli acquedotti (Nebbia G., 1962). La fattispecie, oggi è regolata dall art. 439 c.p. Avveleameto di acque o di sostaze alimetari ella sua origiaria formulazioe prevede che Chiuque avvelea acque o sostaze destiate all'alimetazioe, prima che siao attite o distribuite per il cosumo, è puito co la reclusioe o iferiore a quidici ai. Se dal fatto deriva la morte di alcuo, si applica l'ergastolo; e, el caso di morte di più persoe, si applica la pea [di morte] (Per i delitti previsti el codice peale e i altre leggi diverse da quelle militari di guerra, la pea di morte è stata soppressa e sostituita co l'ergastolo co il d.lgs.lt. 10 agosto 1944,. 224 e d.lgs. 22 geaio 1948,. 21). Nell'Idia del IV secolo prima di Cristo chi espoedo il frumeto per la vedita, 1

10 poeva uo strato di frumeto di buoa qualità per celare il sottostate grao pessimo, veiva codaato ad essere sfigurato. Pliio il Vecchio arra di forai che addizioavao la faria co ua specie di talco, ua terra biaca che veiva raccolta i ua collia fra Napoli e Pozzuoli (Nebbia G., 1962). Nel 200, a Parigi, era fi troppo facile imbattersi i birra cui erao state aggiute delle bacche, che grazie al loro odore e sapore, dovevao mascherare la cattiva qualità; il problema divee così grave e diffuso, che el 1292 la corporazioe dei birrai della città fu costretta ad iterveire itimado di o perseguire el comportameto crimioso. Fu sempre ella capitale fracese che el 1396, u ordiaza dovette vietare di vedere burro vecchio e racido colorato o mischiato ad erbe aromatiche che e cotrastassero il sapore ormai statìo. Tra le altre frodi alimetari comui i Europa, ci furoo quella dell olio, spesso allugato co acqua, e del vio, che o si esitò a colorare di rosso co l aggiuta di ossido di piombo, altamete tossico per l orgaismo. I cittadii iglesi del 700 dovevao prestare attezioe al cosumo di gi, u liquore, spesso mescolato all acquaragia, metre el'800, il pericolo maggiore era costituito dal pae sbiacato co allume. I Italia ell'aprile del 1986 fu scoperta la frode del metaolo el vio, il prodotto adulterato causò l'avveleameto e l'itossicazioe di parecchie decie di persoe, per la maggior parte risiedeti i Lombardia, Piemote e Liguria cui provocò dai persoali gravissimi (cecità, dai eurologici) ed i 23 casi la morte; le vittime avevao bevuto vio a cui avevao aggiuto dosi elevatissime di metaolo per alzare la gradazioe alcolica, igoradoe la tossicità per l'orgaismo (Nebbia G., 1962). L atavica lotta verso quei feomei che, i campo alimetare, possoo miare l icolumità collettiva e la fiducia dei cosumatori co gravi ripercussioi di tipo sociale ed ecoomico, ha i questi ultimi decei, ricevuto l attezioe di tutti i soggetti coivolti, pubblici e privati. Gli iteressi protetti, pur eterogeei, tedoo el loro isieme all affermazioe di u sistema che garatisca certezza della qualità e sicurezza degli alimeti. La salvaguardia della salute collettiva è volta ad impedire la produzioe e la circolazioe di alimeti ocivi ed ioltre a preveire u poteziale pericolo di ordie saitario; la protezioe del cosumatore, dagli igai tesi ei suoi cofroti ell'atto di commercio, è salvaguardata dagli operatori del settore alimetare (OSA). 2

11 La dottria maggioritaria ritiee che il bee giuridico tutelato debba riveirsi ella fiducia che i cosumatori ripogoo ella geeralità dei prodotti ed i particolare di quelli alimetari. 1.2 Defiizioe delle frodi alimetari Co il termie di frodi alimetari ci si riferisce alla produzioe ed al commercio di alimeti o coformi alla ormativa vigete, elle quali all elemeto dell aomalia saitaria o qualitativo merceologica si uisce il profilo dell igao, quale travisameto della realtà idotto dal frodatore ella sfera cogitiva di u altro soggetto. Le frodi alimetari si distiguoo i due tipologie: quelle di atura saitaria e quelle di atura commerciale, a secoda che abbiao icideza sulla salute i termii di pericolosità oppure che ledao i diritti cotrattuali di u altro operatore o di u acquirete fiale (il cosumatore). Frodi saitarie (art. 32 Costituzioe-Tutela della salute pubblica): per frodi saitarie possoo essere idetificate tutte quelle situazioi di commercializzazioe o sommiistrazioe, dove, per fii di lucro, si igaa la buoa fede del cosumatore, che, oltre al dao ecoomico, può subire u dao alla salute. Si tratta, i sostaza, di fatti e comportameti che redoo le sostaze alimetari daose ed attetao alla salute pubblica. Possoo essere commesse da chiuque detiee per il commercio o poe i commercio o distribuisce per il cosumo acque, sostaze o cose da altri avveleate, adulterate o cotraffate i modo pericoloso per la salute pubblica. Ciò sigifica che il reato di frode si cofigura per il solo fatto di esporre, porre i commercio o distribuire, ache se, materialmete, o soo state cedute al cosumatore. Frodi commerciali: le frodi commerciali ledoo i diritti patrimoiali e cotrattuali del cosumatore. Si verificao quado el corso di u'attività commerciale, avviee la cosega all'acquirete ua cosa mobile per u'altra, ovvero ua cosa mobile, 3

12 per origie, proveieza, qualità o quatità, diversa da quella dichiarata o pattuita, è puito, qualora il fatto o costituisca u più grave delitto [ , ], co la reclusioe fio a due ai o co la multa fio a euro. I questi casi o si hao modificazioi delle caratteristiche dell'alimeto, tali da rederlo daoso; o vi è u rischio per la salute del cosumatore, ma si cofigura u illecito profitto a suo dao. Affiché si realizzi ua frode i commercio è sufficiete ua piccola differeza sull'origie del prodotto o la sua proveieza o la qualità. Il classico esempio si ha quado il salumiere pesa l'affettato seza sottrarre la tara dell'ivolucro. Il tetativo di frode i commercio si cofigura ache ell'attività di ristorazioe, laddove vegoo impiegati prodotti surgelati, seza che ve e sia mezioe el meù. La frode ell'esercizio del commercio è discipliata dall art. 515 del codice peale, ai sesi del quale Chiuque, ell'esercizio di ua attività commerciale, ovvero i uo spaccio aperto al pubblico,. Le frodi alimetari vegoo geeralmete suddivise i: 1. Frodi sulla qualità itriseca del prodotto: Sofisticazioe (Codice peale art.515/art.5 L. 283/62): azioe fraudoleta che cosiste ell aggiugere o sostituire all alimeto sostaze estraee che e alterao l esseza, corrompedo o viziado la composizioe aturale e simuladoe la geuiità co lo scopo di migliorare l aspetto o di coprire i difetti. I sostaza, il termie sofisticazioe o è presete ella legislazioe peale italiaa ed ache le seteze a cui il termie è associato paioo risaleti ad u periodo atecedete alla orma di depealizzazioe. Adulterazioe (Codice Peale art. 440,442): comprede tutte le operazioi che alterao la struttura origiale di u alimeto mediate sostituzioe di elemeti propri dell alimeto co altri estraei, ovvero co la sottrazioe di elemeti propri dell alimeto, o acora co l aumeto della quatità proporzioale di uo o più dei suoi compoeti. E procurata a fii qualitativi per mascherare i difetti (aroma aggiuto per coprire u cattivo odore), migliorare artefattamete i caratteri 4

13 orgaolettici (addizioe di colorate) o quatitativi (aumetare peso o volume); al cotrario, può produrre u peggiorameto (taglio di ua sostaza pregiata co ua scadete). Qualora si sottraggao suoi elemeti esseziali, si avrà il corrompimeto implicate ua degeerazioe della sostaza origiale (asportazioe del grasso dal latte). Altri esempi soo rappresetati dall aggiuta di alcool metilico el vio, dall aggiuta di acqua o acora dalla produzioe di mozzarella co caseie o latte i polvere zootecico. Alterazioe (legge.283/62 art.5): azioe fraudoleta che cosiste ello spacciare come regolari prodotti che hao comuque subito delle modificazioi ei compoeti o utrieti, a causa, ad esempio, di ua errata coservazioe; l'esempio tipico di alterazioe è quello di modificare la data di scadeza posta sulla etichetta, oppure di boificare dei prodotti ammuffiti o deteriorati e quidi metterli i vedita come freschi. 2. Frodi riguardati la commercializzazioe degli alimeti: Cotraffazioe (Codice Peale art. 440,442): azioe fraudoleta che cosiste essezialmete el coferire al prodotto alimetare ua deomiazioe diversa da quella reale, solitamete di u prodotto più pregiato, ovvero di formare u alimeto apparetemete geuio co sostaze diverse da quelle di cui è ormalmete composto. Ad esempio, mettere i vedita u olio di semi co la deomiazioe di olio di oliva, oppure marchiare u formaggio comue co il simbolo di u prodotto a deomiazioe di origie cotrollata o ache vedere per formaggio di pecora u formaggio fatto co latte bovio. Falsificazioi: cosiste ello sostituire u prodotto co u altro, come el classico esempio della margaria al posto del burro. 1.3 La giurisdizioe delle frodi alimetari e commerciali I reati quali l avveleameto di acque o di sostaze alimetari (art. 439 c.p.), l adulterazioe o cotraffazioe di sostaze alimetari (art. 440 c.p.), il commercio di 5

14 sostaze alimetari cotraffatte o adulterate (art. 442 c.p.), il commercio di sostaze alimetari ocive (art. 444 c.p.) soo comprese el Titolo VI del codice peale Dei delitti cotro l icolumità pubblica ed i particolare el Capo I Dei delitti di comue pericolo mediate frode. Altri delitti, quali la frode ell esercizio del commercio (art. 515 c.p.), la vedita di sostaze alimetari o geuie come geuie (art. 516 c.p.), la vedita di prodotti idustriali co segi madaci (art. 517 c.p.), la cotraffazioe di idicazioe geografiche o deomiazioi di origie dei prodotti agroalimetari (art. 517 quater) soo discipliati el Titolo VIII Dei delitti cotro l ecoomia pubblica, Capo II dei delitti cotro l idustria ed il commercio. La prima osservazioe i materia di frode alimetare è rappresetata dal fatto che la distizioe tra frodi saitarie e frodi commerciali si ripropoe co riferimeto al cocetto di pericolosità: affiché si possa riteere cofigurata la frode cosiddetta saitaria occorre che possa essere ravvisato l elemeto della pericolosità per la salute (art. 439, 440, 442 e 444 c.p.), metre per la cofigurazioe di talue frodi, che possoo essere compiute ache i ambito alimetare, la pericolosità o e costituisce elemeto (art. 515, 516, 517 e 517 quater c.p.). Nell ambito delle frodi saitarie il mometo fraudoleto costituisce uo degli elemeti esseziali del delitto cotro la salute pubblica, ma la frode resta per così dire assorbita ella più grave e complessa fattispecie peale che mira a tutelare, i primo luogo, la salute pubblica. La frode presuppoe il dolo del soggetto agete, metre ei casi i cui il dolo o è ravvisabile, come ell art. 452 c.p. Delitti colposi cotro la salute pubblica o si potrà parlare di frode alimetare, ma di delitti colposi di comue pericolo. La frode i commercio e gli altri attetati alla fiducia commerciale hao u carattere geerale, el seso che si tratta di fattispecie che o fao riferimeto ad u determiato bee (es. alimeti), ma si pogoo a tutela dell ecoomia pubblica ed i particolare di quella coessa all idustria ed al commercio. Ultima importate cosiderazioe è che i base al pricipio di specialità, la frode i commercio (art. 515 c.p.) o trova applicazioe el caso di cosega di sostaze alimetari cotraffatte o adulterate: comportameto puito, apputo, ai sesi dell art. 440 c.p.. Esempi di frode commerciale el settore degli alimeti è la detezioe di alimeti 6

15 cogelati o surgelati all'itero di u esercizio commerciale, seza che sia idicata tale qualità. Per quato riguarda la messa i vedita di sostaze alimetari o geuie come geuie (art. 516 c.p.) è opportuo precisare che per sostaze o geuie o si itede ecessariamete che l alimeto abbia subito ua dimiuzioe del potere utritivo, ma è sufficiete u alterazioe ella loro esseza o ella ormale composizioe tale da o corrispodere alle aspettative degli evetuali acquireti. Si tratta, ifatti, di u reato cotro la fiducia commerciale. Ad esempio, rietrao i questa ipotesi delittuosa la vedita di latte scremato, il vio aacquato, salsicce di maiale coteeti care bovia, caffè mescolato co surrogati, ed altro. Affiché il reato si cosumi occorre che il veditore preseti l alimeto come geuio, ossia i modo tale da legittimare ell acquirete l opiioe che si tratti di cosa geuia e seza che la vedita si sia cocretizzata. 1.4 Motivazioi che iducoo alle frodi alimetari Le cause che cosetoo ad operatori seza scrupoli di realizzare le frodi i campo alimetare soo umerose: i. desiderio di otteere u rapido profitto, ache se, o sempre, c'è il dao ecoomico per il cosumatore; ii. globalizzazioe del mercato co l'igresso di merci o sempre covezioali, soprattutto da paesi lotai, che facilmete si prestao ad adulterazioe o cotraffazioi o vegoo impiegati per sostituire prodotti ostrai ; iii. evoluzioe delle coosceze scietifiche e tecologiche che hao cosetito la messa a puto di uove teciche per ralletare, iibire o mascherare evetuali codizioi idesiderate dell'alimeto o coferire allo stesso caratteristiche che i realtà o possiede. A volte si assiste all'estremizzazioe dei processi di produzioe co l'elaborazioe di alimeti più complessi e delicati che richiedoo iterveti illegali da parte dell'operatore per coferire al prodotto ua maggiore gradevolezza 7

16 iv. pubblicizzazioe e diffusioe dei prodotti cosiddetti tradizioali che si stao ricavado ua buoa icchia di mercato co l'aumeto dei prezzi e della domada a cui corrispode, spesso, l'immissioe di prodotti fraudoletemete spacciati per prodotti di pregio, ma che o rispecchiao quato dichiarato; v. complessità delle ormative i campo alimetare, spesso articolate, di difficile compresioe ed iterpretazioe che iduce l'osa ad aggirarle, ad agire cotro legge, ella speraza che il suo operato passi iosservato, seza, però, curarsi delle possibili ripercussioi egative che tale comportameto potrebbe avere sulla salute del cosumatore; vi. difficoltà el reperimeto di materi prime idoee che spesso vegoo sostituite da quelle di mior pregio o di diversa origie. 1.5 Le frodi alimetari più diffuse Nell ambito dei prodotti viicoli la frode pricipale cosiste ell impiego di zuccheri diversi da quelli proveieti dall uva e sottoprodotti viosi, quali vii aomali, ultra torchiati e additivi ad uso eologico o cosetiti. Si è verificato i passato (1986) il gravissimo episodio di frode tossica, i cui vee aggiuto a vii di bassa gradazioe o aacquati il famigerato metaolo, che provocò la morte di 25 persoe. Altre frodi meo pericolose soo: l utilizzo di uve da tavola, o adatte alla viificazioe, per la produzioe di vii, spacciati poi come Idicazioe Geografica Tipica (I.G.T.), Deomiazioe di Origie Cotrollata (D.O.C.) o Deomiazioe Origie Cotrollata e Garatita (D.O.C.G.). Per quato riguarda il pesce, le più frequeti frodi hao iteressato: la vedita di prodotti scogelati per freschi; la vedita di prodotti di allevameto per prodotti di cattura; 8

17 la vedita di specie diverse da quelle dichiarate; la vedita di prodotti cogelati coperti da glassatura seza l idicazioe del peso etto; della percetuale di glassatura; la vedita di prodotti trattati co additivi per mascherare u preesistete stato di alterazioe. Altro importate alimeto oggetto di frequeti frodi è l olio di oliva, trattato co l aggiuta di oli di semi vari scadeti, o, i altri casi, completamete cotraffatto, utilizzado oli di semi vari colorati poi co clorofilla (detto ache verdoe) oppure co betacarotee per essere veduto come extravergie di fratoio, cofezioato i bottiglie co etichette stilizzate che richiamao l albero dell ulivo o vecchie macie i pietra. U trattameto illecito più difficile da scoprire è l aggiuta i percetuali iferiori al 20% di olio di semi di occiola di proveieza turca o oli spagoli o extracomuitari deodorati. Tra i latticii, le mozzarelle hao assuto u particolare rilievo sotto il profilo delle frodi alimetari. Questo prodotto viee trattato co l impiego di caseie idustriali magre o di latte i polvere ad uso zootecico. Le mozzarelle sottoposte a questo trattameto o si distiguoo d quelle geuie se o tramite aalisi chimicofisiche per la determiazioe della quatità e dei tipi di grassi preseti. Le mozzarelle e gli altri latticii a deomiazioe di origie tipica o protetta o garatita vegoo i alcui casi trattati co l utilizzo di cagliate di origie estera, spesso proveieti dai paesi dell Est quali la Lettoia, l Ugheria, la Poloia e di altri Paesi CE. Per quato riguarda i formaggi, le più frequeti frodi hao iteressato: formaggi otteuti co latte i polvere ricostituito; formaggi pecorii coteeti percetuali più o meo elevate di latte vaccio; mozzarella di bufala coteete percetuali più o meo di elevate di latte vaccio; aggiuta di grassi, soprattutto margaria, per otteere il quatitativo richiesto per u particolare formaggio; aggiuta di fecola o di faria di patate per aumetare il peso del prodotto; 9

18 attribuzioe della desigazioe di formaggio DOP a formaggi comui; aggiuta di pectie, gomme viiliche, sostaze colorati o mierali o cosetiti. Ache il latte è stato oggetto di attezioi da parte di alcui produttori seza scrupoli attraverso comportameti caratterizzati da diversi livelli di pericolosità. Si fa riferimeto: l aacquameto co o seza salagioe e scrematura; la ricostituzioe di latte i polvere; il latte iacidito eutralizzato co l aggiuta di alcali; l aggiuta di acqua ossigeata (H2O2) per ridurre la carica batterica elevata. Tra i casi caratterizzati da maggiore pericolosità si ricorda il caso del famigerato latte co melaia che i Cia ha colpito diverse decie di bambii (2008), comportado almeo quattro decessi. Nel particolare caso, il latte destiato ai bambii era stato addizioato co ua pericolosa sostaza di sitesi chimica (C6H6N6) al fie di celare ua iiziale frode cosistete ella diluizioe delle derrate co acqua e quidi co lo scopo di cotrobilaciare la coseguete riduzioe del aturale valore proteico. Altra diffusa tipologia di frode è quella che iteressa il pae e la pasta soprattutto: per quato attiee la vedita di pae a pezzi e o a peso (frode commerciale); la vedita di pae ricco di umidità e pertato più pesate per o essere stato portato alla cottura dovuta; alla vedita di pae speciale co l impiego di grassi diversi da quelli cosetiti; alla vedita di pasta di semola di grao duro otteuta co la miscelazioe di sfariati di grao teero. Da ultimo, ma o certo per frequeza o rilevaza della frode, si fa riferimeto alle cari dove si registra la vedita: di cari proveieti da aimali igrassati co sostaze o cosetite 10

19 (ormoi, tireostatici, stilbeici, beta-agoisti). I questo caso le cari soo ricche di acqua e si riducoo otevolmete dopo la cottura; di cari coteeti residui di mediciali il cui trattameto o è stato dichiarato e seza l osservaza di sospesioe tra il trattameto stesso e l avvio alla macellazioe; di cari della stessa specie, ma di qualità diversa (vitello adulto per vitello); di tagli meo pregiati per tagli pregiati (es. lombata del quarto ateriore per lombata del quarto posteriore o filetto); di cari di specie diverse da quelle dichiarate; di isaccati dichiarati prodotti co cari di ua sola specie (es. suio), ma coteeti cari di più specie aimali meo costose, come pollo e tacchio; di prodotti geerici commercializzati come prodotti a marchio DOP. 1.6 TRACCIABILITÀ Uo dei puti di forza del sistema produttivo italiao è costituito dalla straordiaria gamma e varietà di prodotti agroalimetari. Tra questi, i prodotti tipici e tradizioali costituiscoo u settore portate e addirittura vitale, o tato per quato riguarda umero di aziede e di addetti, ma soprattutto perché ciascu prodotto, sviluppatosi e affermatosi i rapporto a precisi ambiti territoriali e cotesti sociali, ecoomici e culturali, rappreseta di per sé u valore. Nell'eleco azioale previsto dal DM 350/1999 risultao iseriti al mometo prodotti tradizioali riferiti ad alimeti di origie aimale (il 58% del totale), 689 dei quali derivati da cari, 585 da latte e 98 ittici. Alcui di questi prodotti di origie aimale soo prodotti moo-razza cioè otteuti dalle produzioi di aimali apparteeti alla stessa razza e rappresetao importati elemeti per la salvaguardia e la valorizzazioe di queste popolazioi aimali, dei territori, a volte margiali, e delle tradizioi. La traspareza circa l origie dei prodotti alimetari, ed i particolare dei prodotti aimali, è ormai cosiderata ua compoete importate della qualità e della sicurezza, così come viee percepita dai cosumatori. Ioltre, rappreseta u importate elemeto per la competitività e la valorizzazioe di questi prodotti ei mercati sia a livello locale, che a livello azioale e iterazioale oltre 11

20 che per la difesa degli stessi produttori da imitazioi e cotraffazioi che potrebbero daeggiare dal puto di vista ecoomico l itera filiera e miare la fiducia dei cosumatori. Nel settore delle produzioi aimali per tracciabilità si itede la capacità di mateere il cotrollo dell origie dei prodotti e dell idetità degli aimali lugo i diversi passaggi della filiera, dall allevatore alla vedita al dettaglio (UNI/EN/ISO 22005). La ecessità di mettere a puto sistemi efficaci ed ecoomici per tracciare i prodotti di origie aimale ha assuto u importaza sempre maggiore da quado la globalizzazioe del commercio e l idustrializzazioe dei processi produttivi hao reso impossibile il cotrollo diretto della produzioe alimetare da parte dei cosumatori. La tracciabilità, oltre a forire u sistema di cotrollo per l igiee e la sicurezza degli alimeti, permette di garatire il cosumatore da possibili frodi, salvaguardare categorie a rischio (come ad esempio persoe che soffroo di allergie o di itolleraza a particolari alimeti o additivi) e tutelare scelte alimetari idividuali per motivi religiosi o salutistici. Per quato riguarda le scelte religiose si riscotrao u volume ed u valore degli scambi i cotiua crescita di care halal e kosher, si è stimato ei paesi musulmai u giro di affari di questi prodotti per 57.2 miliardi di dollari. La certificazioe kosher apparetemete ha u bacio di uteza limitato (la comuità italiaa di religioe ebraica è composta da circa 50 mila persoe), ma permette di essere più competitivi i chiave di export; tale certificazioe, per molti cosumatori straieri, o ecessariamete di religioe ebraica, è garazia di qualità, salubrità, sicurezza alimetare, dal mometo che il processo produttivo avviee sotto il cotrollo dei rabbii i tutte le sue fasi. Per gli ebrei soo cosetite le cari dissaguate di tutti i rumiati co gli zoccoli fessurati, come bue e motoe, di aimali acquatici co pie e scaglie, di volatili (esclusi alcui, come i rapaci, esplicitamete proibiti) metre o soo cosetite le cari di aimali carivori, di maiale e i frutti di mare (Farouk et al., 2013; Gori, 2008). Aaloga situazioe per i prodotti certificati halal, destiati al mercato dei cosumatori musulmai, ma o solo. Il rispetto delle leggi italiae ed europee i 12

21 materia di igiee, sicurezza alimetare e beessere aimale è imprescidibile al fie del rilascio di questa certificazioe, che si ottiee quado il processo produttivo è totalmete cotrollato dagli imam; secodo il Corao tutti i cibi soo halal ad eccezioe delle cari di aimali già morti prima della macellazioe, di maiale, di aimali macellati seza ivocare Dio (Farouk et al. 2013; Gori, 2008). Ioltre, la possibilità di verificare co sistemi oggettivi l origie dei prodotti aimali accresce il valore della certificazioe di qualità, come ad esempio i prodotti IGP o DOP, favoredo lo sviluppo di aree ad ecoomia margiale attraverso la valorizzazioe di prodotti tipici e di icchia e foredo icetivi alla coservazioe di razze locali mateedo la biodiversità. Per far frote alla difficile situazioe veutasi a creare a seguito della crisi BSE, il Parlameto Europeo ha emaato il Regolameto CE 1760/2000 riguardate il sistema d etichettatura delle cari bovie e dei prodotti a base di care, al fie di idetificare la carcassa, il quarto, i tagli di care, il sigolo aimale oppure il gruppo di aimali. Il rilevameto di tessuti aimali ei magimi ha quidi acquisito grade iteresse egli ultimi ai. Soo state utilizzate teciche biomolecolari i quato presetao idubbi vataggi, come avere u alto grado di specificità e la possibilità di essere applicate ache a prodotti trasformati col calore (Momcilovic D., 2000). Sebbee il DNA, come le proteie, subisca deaturazioe termica, è stato osservato che può essere acora rilevabile tramite la PCR (Meyer R., 1996). La PCR è stata applicata per la rilevazioe di tessuti bovii i alimeti per aimali (Kremar P., et al., 2001; Myers M.J., et al., 2001), metre Lahiff et al. (2001) hao sviluppato ua PCR per ricooscere ovii, suii e pollame i DNA magimi. I otevoli progressi coseguiti dalla biologia molecolare ei vari settori della ricerca scietifica hao aperto uove prospettive el campo della sicurezza alimetare, cosetedo l attuazioe di cotrolli aalitici i grado di ialzare i livelli di qualità igieico-saitaria (food-safety) e merceologica (food-autheticy) dei prodotti destiati al cosumo umao. Sul versate della food-autheticy, gli stadard qualitativi proposti dalla recete ormativa europea, i tema di sicurezza alimetare, hao reso sempre più attuale il cocetto di tracciabilità degli alimeti, dei magimi, e dei loro igredieti (regolameto CE. 178/2002), 13

22 lugo tutta la filiera produttiva. I questo caso la tracciabilità molecolare derivate dall idetificazioe di specie aimali e vegetali, diveta uo strumeto idispesabile per smascherare evetuali frodi perpetrate ai dai del cosumatore, e per la certificazioe di auteticità dei prodotti di origie cotrollata. Nella rosa delle possibili applicazioi le più comui soo: idetificazioe delle specie aimali ell idustria dell allevameto e ei prodotti a base di cari; idetificazioe di specie el comparto ittico (tecica DNA-barcodig o codice a barre geetico); cotrollo di auteticità delle varietà di uve e olive utilizzate ella produzioe di vio e olio; idetificazioe delle semole di produzioe della pasta tipica made i Italy; idetificazioe varietale, ovvero la verifica che la varietà commercializzata corrispoda a quella dichiarata (fializzata alla protezioe del costitutore da possibili frodi); la tracciabilità di tossie batteriche o cotamiati fugii (le micotossie); la tracciabilità di OGM (Orgaismi Geeticamete Modificati). Lo sviluppo dei marcatori molecolari e del DNA profilig forisce uo screeig rapido e a costi ridotti, oltre che potete, affidabile e ad alto coteuto iformativo. Si parla quidi oggi di tracciabilità molecolare per idicare la possibilità di ivestigare la atura e l origie di u prodotto fiito tramite aalisi del DNA, proteie o metaboliti. 1.7 Evoluzioe della biologia molecolare per l'idetificazioe di specie Le teciche di biologia molecolare hao trovato egli ultimi ai ua sempre più vasta applicazioe ell idetificazioe di specie egli alimeti di origie aimale (Lasaga, 2005). Studi specifici soo stati codotti per gli alimeti a base di care, pesce e derivati del latte. I particolare la PCR trova u sempre più ampio utilizzo el cotrollo delle 14

23 frodi dei prodotti lattiero caseari protetti dal marchio DOP. Tra questi la mozzarella di bufala campaa è sicuramete tra i prodotti maggiormete a rischio di adulterazioe per l impiego, durate il processo di lavorazioe, di latte di specie diversa da quella idicata dal discipliare, a tale proposito il più utilizzato è il latte vaccio. Tali metodi soo l HPLC (GU della Repubblica Italiaa 11 Giugo ) e l IEF su poliacrilammide delle caseie dopo plasmolisi (Reg. CE 213 /2001). Il riscotro di latte diverso da quello cotemplato el discipliare di produzioe è reato di particolare gravità e si cofigura la frode i commercio. Etrambe le teciche sopra mezioate, per quato specifiche e sesibili, soffroo di tempi di esecuzioe abbastaza lughi, o cosetoo di aalizzare u grosso umero di campioi cotemporaeamete, e spesso ecessitao di apparecchiature costose e sofisticate. Tuttavia bisoga cosiderare alcui limiti applicativi, primo fra tutti la PCR tradizioale è u test qualitativo che o cosete di effettuare ua valutazioe quatitativa del DNA di parteza. Paradossalmete la sua estrema sesibilità può ache rappresetare u limite, i quato la tecica mette i evideza ache solo tracce di DNA di specie diversa magari dovute a cotamiazioi miime ed accidetali (ache i termii dello 0.5%) lugo la filiera, dal campo allo stabilimeto di produzioe passado per il trasporto e lo stoccaggio (Meyer et al., 1995). Teciche biomolecolari soo ora largamete utilizzate per il cotrollo degli alimeti per il cosumo umao e aimale, ma tali teciche possoo ache presetare problemi e difficoltà specialmete el caso di matrici eterogeee od alimeti sottoposti a trattameti durate le fasi della lavorazioe (Bottero, 2011) PCR Il più comue metodo di ricerca i grado di produrre u umero elevato di copie di ua specifica sequeza di DNA è la Polymerase Chai Reactio (PCR). Ideata da Kary Mullis alla metà degli ai 80, rivoluzioò la geetica molecolare rededo possibile u tipo di approccio del tutto uovo per lo studio e l aalisi dei gei. Questa tecica è altamete sesibile e specifica, i quato permette la sitesi i vitro di segmeti di DNA bicateario e l amplificazioe della sequeza target milioi di volte i poche ore; per questo motivo viee ache defiita amplificazioe geica. 15

24 La reazioe di amplificazioe parte dalla capacità ezimatica della DNA polimerasi I di sitetizzare u secodo filameto partedo da u DNA stampo deaturato. I particolare, la miscela di reazioi deve compredere i quattro desossiriboucleotidi, opportue cocetrazioi salie e ph, oligoucleotidi che fuzioao da ieschi o primer per l attività ezimatica. Tipicamete, si utilizzao forme di DNA polimerasi termostabili, quali la Taq polimerasi, estratta al batterio Termuus aquaticus, che cosetoo di orgaizzare la reazioe i ripetizioi cicliche. La reazioe a catea della polimerasi si compoe tipicamete di cicli, oguo dei quali preseta tre step: 1. Deaturazioe (deaturatio): il DNA bicateario viee scisso i due filameti moocateari separati mediate riscaldameto a temperature vicie ai 94 C. 2. Fase di attacco (aealig): i due primers (oligoucleotidi specifici che vegoo sitetizzati i laboratorio, grazie alla coosceza della sequeza bersaglio) si legao alle porzioi di DNA moocateario a loro complemetari, mediate la formazioe di legami a idrogeo. 3. Fase di allugameto (elogatio): la Taq polimerasi si lega i corrispodeza dei primers ed utilizza i ucleotidi liberi per completare la sitesi, determiado così la polimerizzazioe di uove catee complemetari. Il pricipale criterio che determia la specificità della PCR è la scelta dei primers. Per assicurare l uicità di amplificazioe di ua sequeza, il primer dovrebbe avere ua lughezza media vicia a 20 paia di basi (Barry A.J & Peter J.B., 1984). Primers troppo corti, ifatti, soo poco specifici avedo alte probabilità di trovare diverse zoe di complemetarietà el geoma. Altri criteri ifluezao la fuzioalità di u primer, quali i rapporti adeia/timia (A/T) e guaia/citosia (G/C), la preseza di sequeze ripetute o complemetari (Hemmer W., 1997). Attualmete l'ottimizzazioe delle sequeze oligoucleotidiche da utilizzare come primer per la PCR può essere facilitata dall'uso di appropriati programmi software (Meyer P., 1995). Altri criteri metodologici per la realizzazioe di u test di PCR, soo l'ottimizzazioe dei diversi parametri della reazioe di amplificazioe, quali la cocetrazioe del DNA stampo, dei primer, dei sali, del umero di cicli della temperatura di aealig 16

25 (Mullis K.B. & Gibbs R.A. 1998; Wolcott M.J., 1992). È ifatti importate l'uso di reageti e protocolli stadardizzati per la riproducibilità dei test di PCR (Mahoy J.B. et al., 1994). La qualità del DNA presete ei campioi è particolarmete importate per l aalisi i PCR. La lughezza media dei frammeti di DNA preseti el campioe di prova è u importate parametro di qualità del DNA; ifatti è esseziale che la dimesioe media dei frammeti di DNA el campioe o sia sigificativamete più piccola della sequeza bersaglio elle aalisi. La degradazioe del DNA presete el campioe da testare, el caso specifico di alimeti, dipede soprattutto dai processi chimici, fisici o ezimatici che esso subisce durate la trasformazioe tecologica. È importate ioltre che le metodiche di estrazioe assicurio l asseza di iibitori della PCR i quato la preseza di iibitori co-estratti isieme al DNA è uo dei maggiori problemi elle successive aalisi del campioe; gli iibitori della PCR compredoo composti orgaici e feolici, glicogeo, grassi, collagee (Wilso et al., 1997; Sholz et al., 1998) Sviluppi della PCR quatitativa La reazioe a catea della polimerasi (PCR), a partire dalla sua itroduzioe el 1985, è il metodo corretemete utilizzato per l'amplificazioe di acidi ucleici ed ha assuto u ruolo di premieza ella diagostica medica e ell'aalitica i geerale (Saiki R.K., Higuchi R., et al., 1998). Tuttavia, le caratteristiche stesse della reazioe di amplificazioe o e cosetoo u utilizzo per la quatificazioe della sequeza target presete iizialmete el campioe (Ferrè F., et al., 1994). Ifatti, possoo ifluezare otevolmete i prodotti fiali della reazioe, piccole differeze ell'efficieza di amplificazioe, quali la qualità e la cocetrazioe della Taq polimerasi, dei dntps, del MgCI2, dei primers e dei cicli della reazioe. Altre variabili imprevedibili, essezialmete legate alla qualità del DNA stampo, possoo alterare il risultato fiale dell'amplificazioe. Il crescete iteresse elle applicazioi quatitative della PCR ha quidi favorito la proposta di diversi tipi di saggi (Diviacco et al., 1992). 17

26 La PCR quatitativa è ua tecica basata sulla reazioe a catea della polimerasi che è i grado di misurare la cocetrazioe iiziale di ua sequeza target i u campioe biologico (Orlado et al., 1998). I particolare la PCR quatitativa competitiva e la PCR Real Time hao trovato umerose applicazioi, i primo luogo ell ambito della diagostica medica, co receti applicazioi elle idagii aalitiche degli alimeti; la preseza di care di suio i miscele di care fresca di suio e mazo è stata idetificata per la prima volta el 1994 da Meyer et al., utilizzado la metodica della PCR co primer specifici disegati sul gee suio codificate l'ormoe della crescita, tracce di maiale soo state rilevate co ua soglia del 2% (w/w). La ecessità di adeguarsi alle direttive legislative europee ed italiae, che l'obbligo di rispettare i criteri relativi alla lavorazioe del prodotto, ha reso ecessario la predisposizioe di metodiche aalitiche i grado di rilevare la preseza i termii percetuali. Attraverso la tecica PCR RFLP (Restrictio Fragmet Leght Polymorphism) co primer specifici per il gee mitocodriale del citocromo b il limite di rilevazioe della care di suio i preparati di care di mazo è stato abbassato ulteriormete, permettedo di rilevare tracce di maiale fio al 1% (w/w). (Meyer et al., 1995). Oggi l'aalisi del gee codificate il citocromo b è stato uiversalmete adottata per idetificare specie aimali e aviarie ei prodotti di macellerie e ei prodotti ittici (Aida et al., 2007; Che et al., 2007). questo gee localizzato el DNA mitocodriale è multicopia, presete quidi il vataggio di essere facilmete idetificabile, i mitocodri soo ioltre più resisteti al processameto termico tipico delle preparazioe idustriali (Wolfe ad Primorse, 2004) PCR Real-Time L'evoluzioe della tecica di PCR proposta dal saggio Taq Ma permette oggi ua drastica riduzioe dei tempi di esecuzioe e del materiale cosumato utilizzado u solo strumeto ed elimiado completamete l'impiego di reageti radioattivi o tossici. Comparato alle PCR tradizioali, il test o solo matiee spiccate caratteristiche di sesibilità, ma garatisce ache decisivi migliorameti i termii di 18

27 specificità, di precisioe e di itervallo di quatificazioe del campioe icogito. Questi vataggi soo dovuti all'iovativo sistema di rilevameto e misurazioe "i tempo reale" del DNA amplificato, che cosete sia di ridurre il umero delle repliche ecessarie alla determiazioe di ogi campioe, sia di abbadoare tutte le maipolazioi successive all'amplificazioe, che rappresetao poteziali foti di alterazioe dei risultati, ed ioltre è dotata di elevata sesibilità (López-Calleja et al., 2007; Zhag et al, 2007;. Kesme et al, 2009;. Miii et al., 2009). La tecologia Real-Time PCR ha permesso lo sviluppo di approcci quatitativi basati sull'utilizzo di sode TaqMa raggiugedo limiti di rilevazioe pari a 0,80 pg di DNA target i miscele complesse (Lopez et al., 2005; Lopez et al., 2006). La prima determiazioe i tempo reale dei prodotti di PCR è stata effettuata da Higuchi et al. (1992), co u sistema che icludeva bromuro di etidio i ogi ciclo d'amplificazioe, ua fote di raggi ultravioletti che irradiava i prodotti d'amplificazioe ed ua CCD camera che catturava l'emissioe di fluoresceza, successivamete elaborata attraverso u software dedicato a rilevare la quatità di DNA target. Co l'evolversi dei cicli la cocetrazioe degli amplificati aumeta, co coseguete icremeto dell'emissioe di fluoresceza. Rappresetado i u sistema di assi cartesiai le itesità di emissioe i ascissa e il umero dei cicli i ordiata, si ottiee ua curva che forisce iformazioi sulla quatità di DNA stampo origiariamete presete ella reazioe co u'approssimazioe miore rispetto a quella derivabile da ua PCR ed poit. U ulteriore progresso verso lo sviluppo degli attuali sistemi si è i seguito avuto co l evolversi della chimica della reazioe. Itercalati quali il bromuro di etidio hao ifatti il limite della aspecificità: si legao ifatti sia ai prodotti d amplificazioe specifici, sia ad evetuali amplicoi aspecifici che vegoo geerati durate la reazioe di PCR. I alterativa il saggio 5 ucleari da la possibilità di rilevare i soli prodotti specifici d amplificazioe. Tale saggio è stato per la prima volta proposto da Hollad et al., (1991) che dimostraroo come l attività 5 ucleasica della Taq DNA polimerasi potesse essere utilmete sfruttata per la determiazioe dei soli prodotti target. I aggiuta ai classici compoeti di ua reazioe PCR, tale saggio compredeva ua soda marcata co 32 P all estremità i 5 e bloccata all estremità i 3 i modo tale da o poter fuzioare da primer. Durate l amplificazioe, l appaiameto della soda 19

28 alla sua sequeza target geerava u substrato che veiva distrutto dall attività 5 ucleasica della Taq polimerasi quado l ezima copiava il secodo filameto a partire da u primer disegato a mote della soda. A reazioe PCR termiata, la quatità di soda degradata veiva termiata attraverso cromatografia su strato sottile. U ulteriore avazameto della metodica aalitica si è avuto ad opera di Lee et al., (1993) che hao elimiato la ecessità di determiare la quatità di soda degradata attraverso aalisi post-pcr. Questi autori hao ifatti realizzato u tipo di soda caratterizzata da u oligoucleotide dotato sia di u fluorocromo reporter che di u quecher. Quado la soda è itegra, la viciaza tra il reporter e il quecher riduce la fluoresceza emessa a causa della legge di Forster. Nell attuale PCR Real Time co sode tipo TaqMa l estesioe dei primer durate la reazioe PCR produce fluoresceza. Se ifatti la sequeza target è presete ella miscela di reazioe, la soda TaqMa si appaia a valle del sito di attacco del primer e durate l estesioe dei primer, viee degradata dall attività 5 ucleasica della Taq polimerasi. Tipicamete, ua soda TaqMa cotiee FAM (6 carboxy-fluorescei) come reporter fluorescete legato covaletemete all estremità i 5 e TAMRA (6- carboxy-tetramethyl-rhodamie) legata covaletemete all estremità 3. La degradazioe della soda o può avveire quado questa è libera i soluzioe, ma esclusivamete dopo aealig ai frammeti di eo-sitesi, per la citata attività 5 ucleasica, e corrispode ad emissioe di fluoresceza, per la separazioe tra la molecola del reporter e del quecher. Il vataggio di u sistema di questo tipo sta essezialmete ella specificità della soda, capace di legarsi solo ad amplicoi specifici. La possibilità di utilizzare diversi tipi di fluorocromi per macare sode diverse, cosete ioltre di rilevare più di ua sequeza target i ua sola reazioe, realizzado così ua reazioe i multiplex. Uo svataggio sta ivece ell obbligo di sitetizzare, per ogi target, ua soda ad hoc. I aggiuta alle sode TaqMa soo state proposte e brevettate altri tipi di sode, quali FRET (Forster resoace eergy trasfer), SuRise, molecular beacos, Scorpios. I alterativa alle sode fluorogeiche l accumulo di amplificati si può seguire i Real Time utilizzado colorati specifici del DNA co i segueti vicoli: capacità di emettere fluoresceza crescete all aumetare degli amplificati 20

29 legati e capacità di o iterferire i alcu modo ell evolversi della reazioe PCR. Figura 1: Chimica Taqma e chimica SYBR U colorate dotato di queste caratteristiche è il SYBR Gree I (Applied Biosystem), co sesibilità paragoabile a quella del bromuro di etidio. Il SYBR ; il SYBR Gree I si lega ache a prodotti di amplificazioe aspecifici evetualmete geerati durate la reazioe (Fajardo et al., 2008; Farrokhi ad Joozai, 2011). Gli strumeti per PCR Real Time, oltre a fugere da termociclatori, eccitao, durate la PCR co u laser a ioi argo o co lampade al tugsteo, i fluorocromi preseti ei campioi e covogliao quidi la fluoresceza emessa i risposta lugo fibre ottiche fio ad uo spettrografo che provvede a separare le compoeti del reporter e del quecher. Appositi software acquisiscoo lo spettro di emissioe di ogi sigolo campioe per tutta la durata della PCR e covertoo la variazioe di fluoresceza del reporter i ua rappresetazioe i tempo reale della cietica di amplificazioe. I maggiore dettaglio, l algoritmo di aalisi calcola l emissioe del reporter (R) e del quecher (Q) ogi pochi secodi. I valori di R riflettoo la quatità di soda fluorescete degradata e possoo essere rappresetati i u grafico i fuzioe del umero dei cicli. Cotemporaeamete, l algoritmo determia il ciclo soglia che corrispode ad effettiva emissioe di fluoresceza, scorporata dal rumore di fodo. Il 21

30 calcolo della quatità di DNA dei campioi icogiti viee effettuata determiado il ciclo della PCR (ciclo soglia, Ct) i cui viee raggiuto il valore soglia di fluoresceza del reporter che separa i segali di amplificazioe specifici da quelli del rumore di fodo del sistema. Il umero dei cicli ecessari perché u campioe raggiuga il suo Ct è iversamete proporzioale al umero di copie target presete iizialmete. Ua curva di refereza costruita co i Ct di campioi stadard a coteuto di DNA oto i fuzioe del logaritmo della relativa quatità di DNA, cosete poi l estrapolazioe del coteuto di DNA ei campioi icogiti. Il vataggio i termii di precisioe e di itervallo di quatificazioe rispetto alla PCR tradizioale, è dovuto alla possibilità di quatificare il DNA al ciclo soglia, che è sempre calcolato ella fase espoeziale della reazioe PCR, fase i cui i reageti soo acora lotai dall esaurimeto e gli elemeti di variabilità soo così ridotti al miimo. 1.8 L'IMPORTANZA DELLA VALIDAZIONE DEL METODO La validazioe di ua metodica è u aspetto focale, per il laboratorio iteressato, poiché è codizioe imprescidibile per poter essere accreditato ed essere garazia di: imparzialità; idipedeza, ovvero assicurare l'asseza di coflitti di iteresse co l'orgaizzazioe da certificare; correttezza; competeza del persoale qualificato; Secodo la orma UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2005 la validazioe è la coferma attraverso esame e l'apporto di evideza oggettiva che i requisiti particolari per l'utilizzazioe prevista soo soddisfatti; tato maggiore è il grado di covergeza fra quato otteuto e quato atteso, tato maggiore risulta essere il grado di validità del procedimeto. La validazioe di u metodo può essere eseguita attraverso degli studi collaborativi co altri laboratori, quado il metodo è di larga applicazioe, oppure può avveire i i-house i quelle situazioi i cui il metodo o può essere diffuso oppure o 22

31 ampiamete utilizzato. È molto importate validare u metodo i quato durate u' aalisi vi soo molteplici variabili che possoo ificiare l'esito del risultato. Tra le variabili da predere i cosiderazioe vi è l'estrazioe del DNA, che può essere critica quado il campioe o è rappresetativo, la scelta del gee-target, alimeti che possoo coteere sostaze iibitrici della PCR e cotamiazioi ivolotarie. Il metodo utilizzato e validato ell'idetificazioe di specie i alimeti è la PCR Real-Time i quato è caratterizzata da ua maggiore sesibilità (10 7 volte più preciso rispetto ai metodi classici) e specificità (possibilità di utilizzare sode altamete specifiche); ioltre la Real-Time è ifluezata miimamete dalle variabili di reazioe, preseta ridotti tempi di aalisi e al termie della reazioe di amplificazioe o è richiesta essua maipolazioe (elettroforesi o blottig). Ioltre è molto importate determiare e quatificare u valore di cut-off per le specie i esame, dovuto al fatto che la Real-Time essedo ua metodica altamete sesibile risulta fodametale avere u puto di riferimeto per poter cosiderare se u campioe sia realmete positivo o egativo. Questo perché i molti casi si può osservare dei campioi i cui vi sia la preseza di u quatitativo irrisorio di ua specie o dichiarata che potrebbe essere più ua causa dovuta ad ua disattezioe del produttore oppure a cotamiazioi ambietali che ad ua azioe fraudoleta volta ad igaare il cosumatore. Per cui viee defiito ua valore soglia dell'1%; risultato iferiori a questo valore si può cosiderare che il livello 1% della frazioe di massa o è superato, i caso cotrario, ovvero u risultato superiore all'1%, si può cosiderare che il livello 1% della frazioe di massa sia superato. 23

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33 2. SCOPO DELLA TESI Gli alimeti a base di care occupao el comparto produttivo agroalimetare italiao, i geerale, u posto di otevole importaza. Nel corso degli ultimi ai, ed i seguito a frequeti allarmi el settore alimetare, si è vista la ecessità di ua estesioe delle tutele previste a tutti gli aelli della filiera alimetare. L esigeza di mettere a puto sistemi efficaci ed ecoomici per tracciare i prodotti di origie aimale ha assuto u importaza sempre maggiore da quado la globalizzazioe del commercio e l idustrializzazioe dei processi produttivi hao reso impossibile il cotrollo diretto della produzioe alimetare da parte dei cosumatori. La tracciabilità, ifatti, oltre a forire u sistema di cotrollo per l igiee e la sicurezza degli alimeti, permette di garatire il cosumatore da possibili frodi, salvaguardare categorie a rischio (come ad esempio persoe che soffroo di allergie o di itolleraza a particolari alimeti o additivi) e tutelare scelte alimetari idividuali per motivi religiosi o salutistici. Il metodo attualmete più applicato ell'idetificazioe di specie i alimeti è la PCR Real-Time i quato caratterizzato da ua maggiore sesibilità e specificità, e preseta tempi ridotti di aalisi. Proprio a causa della grade sesibilità della metodica si rede ecessario uo strumeto di iterpretazioe (u cut-off) che coseta di defiire la preseza effettiva di ua specie aimale i u alimeto distiguedola dalla preseza i tracce che o risulta i etichetta i quato o cosiderata igrediete. Il cut-off è stato stabilito i u valore del 1% dall EURL (Europea Uio Referece Laboratory for GM Food & Feed). Lo scopo di questa tesi è stato l'applicazioe della metodica di biologia molecolare Real-Time PCR, co l'utilizzo del Sybr-Gree, per defiire il cut-off che coseta l iterpretazioe dei risultati delle aalisi, e per l idetificazioe di specie aimali i matrici alimetari a base di care commercializzati sul territorio italiao, al fie di verificare la corrispodeza co quato dichiarato i etichetta che rappreseta ache el settore alimetare, sia umao che aimale, u ottimo strumeto di aalisi per evideziare evetuali frodi legate alla vedita di aliud pro alio. 25

34 3. MATERIALI E METODI 3.1 Campo di applicazioe e campioi di riferimeto L'idetificazioe di specie i u alimeto o magime di origie aimale permette di stabilire le specie aimali di cui è composto. Il metodo descritto è applicabile ad alimeti di origie aimale crudi e/o cotti i aalisi qualitativa. L'aalisi viee eseguita mediate Real Time PCR utilizzado primers specifici per le segueti diverse specie da ricercare: SPECIE AMPLICONI GENE TARGET Bovio ( Bos taurus) 112 bp 16 s Maiale (Sus scrofa) 112 bp Cyt b Pollo (Gallus gallus) 82 bp Cyt b Tacchio (Melagris gallopavo) 75 bp Cyt b Cavallo (Equus caballus) 81 bp Cyt b Cae (Cais lupus) 101 bp 12s Gatto (Felis silvestris catus) 108 bp 12s Pecora (Ovis aries) 104 bp 16s Capra (Capra hircus) 113 bp Nadh-2 Coiglio (Oryctolagus cuiculus) 120 bp Nadh-1 Bufalo (Bubalus bubalis) 153 bp Cyt b Cervo (Cervus elaphus) 104 bp 12s Tab. 1 : Specie ricercate (Bertasi, 2007; Marti, 2007; Joker, 2008; Fajardo, 2011) Ioltre è stato richiesto, a secoda delle aalisi, di ricercare altre specie meo importati commercialmete come cervo, bufalo, capra, cae, gatto, pecora e coiglio. Soo stati utilizzati 184 campioi ufficiali costituiti da matrici differeti (es. care misto bovio suio, caelloi, kebab ecc. ) perveuti presso Istituto Zooprofilattico delle Veezie el periodo , più 21 campioi di pet-food costituiti ach'essi da matrici differeti (care mista co riso e/o patate e varie farie). Soo stati ioltre utilizzati come materiali di riferimeto, per le varie 26

35 specie ricercate, DNA estratti da care a titolo di percetuale ota (100%-1%) creati i laboratorio e cofermati co il sequeziameto. La rilevazioe degli amplificati è eseguita co SYBR Gree I, ua molecola i grado di itercalarsi el DNA a doppia elica ed emettere fluoresceza, coteuto all'itero della mix di reazioe. 3.2 Protocollo di estrazioe La procedura di estrazioe del DNA delle matrici i esame per l'aalisi mediate Real-time PCR è stata realizzata attraverso l'impiego di u kit: Wizard Magetic DNA Purificatio System for Food forito dalla ditta Promega. La procedura di estrazioe del Da prevede lo smiuzzameto meccaico del materiale di origie aimale da esamiare (fig.1). Viee pesato 200 mg di materiale a cui vegoo aggiugi 500 µl di Lysis Buffer A, u buffer lisate, e 5 ul di Rasi-A per degradare l'rna. Successivamete vegoo aggiuti 250 µl di Lysis buffer B, voretexati per secodi e poi lasciati per 10 miuti a icubare a temperatura ambiete (22-25 C). Si aggiugoo 750 ul di Precipatio Solutio, si mescola vigorosamete e si cetrifuga per 10 mi a 13000rpm. Si trasferisce il suratate su ua uova eppedorf e si aggiuge 50 µl di Magesil PMOs, che cotiee delle piccole sferette magetiche che hao la capacità di legare il DNA, e si mescola per iversioe. Si aggiuge u volume di 0,8 ml di isopropaolo, si iverte la provetta per volte e si lascia icubare per 5 miuti a temperatura ambiete. 27

36 Le eppedorf vegoo posizioate su u apposito supporto il MageSphere Tecology Magetic Separatio Stad e lasciate su questo per u miuto così le sfere hao il tempo per rimaere adese alla parete, e si elimia la soluzioe. Si sposta la eppedorf dal supporto, si aggiugoo 250 µl di Lysis Buffer B, per elimiare evetuali cotamiati o iibitori, e si riposizioa il tutto el supporto e si rimuove la parte liquida. Si eseguoo tre lavaggi, i modo da elimiare proteie, polissacaridi e gli evetuali cotamiati, co 1 ml di etaolo al 70% e si lascia la provetta ad asciguare a 65 C el termoblocco. Ifie, il DNA puro viee eluito co 100 µl di uclease-free water mescolato, lasciato per 5 miuti ad icubare a 65 C el termoblocco. Successivamete viee posizioato sul supporto magetico per u miuto e si trasferisce il DNA i ua uova eppedorf, facedo attezioe a o veire i cotatto co le sfere (PROMEGA,2012). 3.3 Dosaggio del DNA estratto La cocetrazioe del DNA estratto si può accuratamete misurare mediate la spettrofotometria di assorbaza degli ultravioletti (UV): la quatità di radiazioe UV assorbita da ua soluzioe di DNA è direttamete proporzioale alla quatità di DNA presete el campioe. L'assorbaza viee misurata a 260 m, che corrispode alla lughezza d'oda a cui u assorbaza (A260) di 1,0 corrispode 50 µg di DNA a doppio filameto per ml. Solitamete per ua buoa quatità della reazioe di PCR per l'idetificazioe di specie soo idicati valori che variao tra i 10 ed i 20 g/ul. Per verificare la purezza di u campioe, si esegue u rapporto di assorbaza a 260 e 280 m (A260/A280) che deve variare tra 1,5 ed 1,8: rapporti iferiori idicao cotamiazioi da proteie, feoli o u errata estrazioe. Ioltre si calcola il rapporto delle assorbaze a 260 m e a 230 m (A260/A230) che dà idicazioi sulla preseza di sostaze quali carboidrati, feoli e composti peptidici o aromatici. Per ogi estratto è stato quatificato il DNA tramite u aalisi 28

37 effettuata co lo spettrofotometro Eppedorf Biophotometer. È stata rilevata la cocetrazioe dell'acido ucleico di ciascu campioe e soo stati misurati i rapporti dell'assorbaza A260/A280 e A260/A280 e l'assorbaza a 260 m. Cosiderado che l'assorbaza, secodo la legge di Lambert-Beer, è direttamete correlata alla cotrazioe di ua soluzioe, la cocetrazioe di DNA è stata calcolata moltiplicado l'assorbaza per 50 ug/ml, per il Fattore di Diluizioe applicato (FD): DNA= A (50 ug/ml) FD 3.4 Preparazioe della mix di reazioe e caricameto Ua volta otteuto l'estratto di DNA si prepara la mix di reazioe per la specie da ricercare, che prevede l'utilizzo di ua piastra i plastica a 96 pozzetti (Optical 96- Well Fast Plates-Applied Biosystem). Composizioe della mix di reazioe: H20 Power SYBR Gree PCR M.Mix (Applied Biosystem) Primer forward Primer reverse Primer Bov-F Primer Bov-R Primer Mai-F Primer Mai-R Primer Gal-F Primer Gal-R Primer Tac-F 5'-CTTGAACTAGACCTAGCCCAAAGATAC-3' 5'-GCGCCGTACTTAGATTTCTATCTCC-3' 5'-ATGACCAACATCGAAAATCAC-3' 5'-TGCCTAAGAGGGAACCGAAG-3' 5'- TCTCACTTACACTACTTGCCACATCTT-3' 5'-CGTGTGTGTCCTGTTTGGACTAG-3' 5'-CCGTAACCTCCATGCGAATG-3' Primer Tac-R 5'-TAATATAGGCCGCGTCCAATGT-3' Primer Cav-F 5'- GCATCGGGGATATCGGC-3' Primer Cav-R 5'-GGAGTCCAAATTGAGCGG-3' Tab. 2: Primer utilizzati per le specie più importati commercializzate (Bertasi, 2007; Joker, 2008) 29

38 Primer Dog-F Primer Dog-R Primer Cat-F Primer Cat-R Primer Pec-F Primer Pec-R Primer Cap-F Primer Cap-R Primer Buf-F Primer Buf-R Primer Cev-F Primer Cev-R Primer Co-F 5'-AAT TGA ATC GGG CCA TGA A-3' 5'-CTC CTC TTG TGT TTT AGT TAA GTT AAT CTG-3' 5'-CGA CTT ATC TCC TCT TGT GGG TGT-3' 5'-AAT TGA ATC GGG CCA TGA A-3' 5'-CCA AAA TCT CCC ACT CTC CA-3' 5'-GGT GAT GAG GAC TAG GGT TG-3' 5'-CCA TGA CCT CCA CTA TAT TTT T-3' 5'-GGT GAT GAG GAC TAG GGT TG-3' 5'-CTTCCTATTCGCATACGCAATCTTACGATC-3' 5'-TATGATGTTCCGGCCATT CAGCCAATGCC-3' 5'-CAA AAACATATAACGAAAGTAACT TTCCGA CC-3' 5'-AGTACTCTGGCGAATAGTTTTGTCTGCA-3' 5'-CCCCTAACATCCTCTCCG C-3' Primer Co-R 5'-AGAATGCCTATATTTAGGTTGAC-3' Tab. 3: primer utilizzati per specie meo ricercate: cae, gatto, pecora, capra, bufalo, cervo e coiglio (Bertasi, 2007; Marti, 2007; Joker, 2007; Fajardo 2011) Composizioe delle mix di reazioe Reagete Coc. Fiale µl per 1 reazioe. campioi M I X H20-6,25 0 Power SYBR GREEN Primer GAL-F 20 ul Primer GAL-R 20 ul 1X 12, mol/ul 0, mol/ul 0,625 0 Volume totale 20 Volume campioe Volume fiale 25 5 R E A Z I O N E P O L L O 30

39 Reagete Coc. Fiale µl per 1 reazioe. campioi M I X H20-6,25 0 Power SYBR GREEN Primer TAC-F 20 ul Primer TAC-R 20 ul 1X 12, mol/ul 0, mol/ul 0,625 0 Volume totale 20 Volume campioe Volume fiale 25 5 R E A Z I O N E T A C C H I N O Reagete Coc. Fiale µl per 1 reazioe. campioi M I X H20-6,25 0 Power SYBR GREEN Primer MAI-F 20 ul Primer MAI-R 20 ul 1X 12, mol/ul 0, mol/ul 0,5 0 Volume totale 20 Volume campioe Volume fiale 25 5 R E A Z I O N E M A I A L E Reagete Coc. Fiale µl per 1 reazioe. campioi M I X H20-6,25 0 Power SYBR GREEN Primer BOV-F 20 ul Primer BOV-R 20 ul 1X 12, mol/ul 0, mol/ul 0,625 0 Volume totale 20 Volume campioe Volume fiale 25 5 R E A Z I O N E B O V I N O 31

40 Reagete Coc. Fiale µl per 1 reazioe. campioi M I X H20-6,25 0 Power SYBR GREEN Primer GAL-F 20 ul Primer GAL-R 20 ul 1X 12, mol/ul 0, mol/ul 0,625 0 Volume totale 20 Volume campioe Volume fiale 25 5 R E A Z I O N E E Q U I N O Reagete Coc. Fiale µl per 1 reazioe. campioi M I X H20-6,25 0 Power SYBR GREEN Primer CAP-F 20 ul Primer CAP-R 20 ul 1X 12, mol/ul 0, mol/ul 0,625 0 Volume totale 20 Volume campioe Volume fiale 25 5 R E A Z I O N E C A P R A Reagete Coc. Fiale µl per 1 reazioe. campioi M I X H20-6,25 0 Power SYBR GREEN Primer PEC-F 20 ul Primer PEC-R 20 ul 1X 12, mol/ul 0, mol/ul 0,625 0 Volume totale 20 Volume campioe Volume fiale 25 5 R E A Z I O N E P E C O R A 32

41 Reagete Coc. Fiale µl per 1 reazioe. campioi M I X H20-6,25 0 Power SYBR GREEN Primer CAT-F 20 ul Primer CAT-R 20 ul 1X 12, mol/ul 0, mol/ul 0,625 0 Volume totale 20 Volume campioe Volume fiale 25 5 R E A Z I O N E G A T T O Reagete Coc. Fiale µl per 1 reazioe. campioi M I X H20-6,25 0 Power SYBR GREEN Primer BUF-F 20 ul Primer BUF-R 20 ul 1X 12, mol/ul 0, mol/ul 0,625 0 Volume totale 20 Volume campioe Volume fiale 25 5 R E A Z I O N E B U F A L O Reagete Coc. Fiale µl per 1 reazioe. campioi M I X H20-6,25 0 Power SYBR GREEN Primer DOG-F 20 ul Primer DOG- R 20 ul 1X 12, mol/ul 0, mol/ul 0,625 0 Volume totale 20 Volume campioe Volume fiale 25 5 R E A Z I O N E C A N E 33

42 Reagete Coc. Fiale µl per 1 reazioe. campioi M I X H20-6,25 0 Power SYBR GREEN Primer CON-F 20 ul Primer CON-R 20 ul 1X 12, mol/ul 0, mol/ul 0,625 0 Volume totale 20 Volume campioe Volume fiale 25 5 R E A Z I O N E C O N I G L I O Reagete Coc. Fiale µl per 1 reazioe. campioi M I X H20-6,25 0 Power SYBR GREEN Primer 12sceqfw-F 20 ul Primer 12sceqrev-R 20 ul 1X 12, mol/ul 0, mol/ul 0,625 0 Volume totale 20 Volume campioe Volume fiale 25 5 R E A Z I O N E C E R V O Preparata la mix di reazioe per la specie da ricercare si aliquota 20 µl di mix per pozzetto dedicato, l'aalisi prevede u caricameto i doppio di ogi campioe e l'aggiuta di u cotrollo positivo, u cotrollo egativo e cotrollo reageti rpcr. Aliquotati i 20 µl di mix, secodo lo schema idicato i tabella 4 si aggiuge 5 µl di DNA estratto el pozzetto corrispodete. Sigillare la piastra co il film adesivo passado più volte co l'apposita spatolia per evitare la formazioe di bolle o pieghe che ificio la lettura della fluoresceza. 34

43 A A1 A1 A2 A2 CTR + B C D E F G CTR - NPC H Tab. 4: esempio di distribuzioe dei campioi ella piastra NTC Preparata la piastra si programma la PCR Real-Time, secodo le codizioi di amplificazioe, avedo cura di selezioare per ogi pozzetto il caale di lettura della fluoresceza del fluorocromo utilizzato (SYBR Gree I). Codizioi di amplificazioe: u primo ciclo a 50 C per 2 mi; u secodo ciclo di iiziazioe e di deaturazioe del DNA a 95 C per 10 mi; - 94 C per 30 sec; 42 cicli ripetuti che prevedoo: - 60 C per 45 sec; - 72 C per 40 sec; - 95 C per 15 sec; ifie uo step di dissociazioe che prevede: - 60 C per 1 mi; - 95 C per 15 sec; - 60 C per 15 sec; 35

44 3.5 Descrizioe del sistema Real-Time PCR: Applied Biosystem 7500/7500 Fast Real-Time PCR System Lo strumeto validato è l'applied Biosystem 7500/7500 Fast Real-Time PCR System. Questo strumeto è composto da u termociclatore che ha la capacità di mateere i modo ottimale la temperatura costate ed omogeea i tutti i pozzetti per o ificiare l'efficieza di reazioe di PCR. Il rilevatore dello strumeto ha come sorgete ua lampada a tugsteo che permette l'acquisizioe i tempo reale della fluoresceza emessa dal DNA target. Il campioe viee irradiato dalla sorgete e la fluoresceza emessa viee rilevata da ua CCD camera, poi covertita i dati grafici e umerici da u algoritmo di decovoluzioe. L'eccitazioe dei fluorocromi è ad opera della lampada a tugsteo che sfrutta l'impiego di filtri ottici. La CCD camera è raffreddata per limitare gli errori di rilevameto del segale dovuti al rumore di fodo della camera stessa (Mauale per 7500 e 7500 Fast Real -Time PCR System). Per ormalizzare le fluttuazioi di fluoresceze o correlate alle reazioi di amplificazioe, viee utilizzato u fluoroforo di riferimeto itero detto ache cotrollo passivo (ROX), presete el buffer di reazioe. Il software calcola, tramite u apposito algoritmo, i valori di Δr riferiti al ROX: Δr = (R+) - (R-) Dove: R+ = (l'itesità di emissioe del reporter)/(itesità di emissioe del ROX) R- = (l'itesità di emissioe del reporter i asseza di stampo) / (itesità di emissioe del ROX i asseza di stampo) Tali valori riflettoo la quatità di soda fluorescete degradata e aumetado i modo espoeziale durate la reazioe. Ad ogi ciclo viee rilevata la fluoresceza e registrati i dati su u diagramma di amplificazioe dove sull'asse delle ordiate vegoo riportati i valori di fluoresceza e sull'asse delle ascisse i cicli di reazioe (Ct). I parametri che caratterizzao il grafico delle curve di amplificazioe soo i 36

45 segueti (Fig. 2): liea di base (baselie): liea orizzotale che idica il valore al di sopra del quale iizia l'accumulo di fluoresceza (di orma si fissa la beselie 3 cicli prima del ciclo i corrispodeza del quale la liea di soglia, threshold, icrocia la prima curva di amplificazioe); liea di soglia (threshold lie): liea parallela alla baselie che iterpola le curve di amplificazioe ella fase espoeziale, cioè dove i diversi profili di amplificazioe risultao paralleli (può essere posizioata automaticamete dal software o autoomamete dall'operatore); ciclo soglia (Ct) o threshold cycle: ciclo di PCR misurato per ciascu campioe, i cui la curva di amplificazioe iterseca la liea soglia; Fig.2: Curva di amplificazioe i Real-Time PCR I valori di Ct soo iversamete proporzioali al logaritmo del umero di copie iiziali del target, per cui è possibile risalire alla cocetrazioe di DNA dei campioi: Ct : a*log (r. Copie) + B dove a è la pedeza e b l'itercetta di ua retta di taratura otteuta da materiali di riferimeto a cocetrazioe ota (Fig. 3). 37

46 Fig. 3: esempio di ua retta di taratura Alla fie del profilo di amplificazioe mediate uo step di dissociazioe è possibile cofrotare i diversi segali e distiguere quelli derivati dalla stessa specie da quelli di diverse specie o da artefatti, poiché ogi amplificato è caratterizzato da ua curva di dissociazioe e da ua Tm (temperatura di meltig) specifiche. Per avere la certezza che il segale di amplificazioe sia attedibile, cioè effettivamete derivato da amplificazioe di DNA target, si osserva la curva di meltig; se la curva di meltig è sovrappoibile a quella del cotrollo positivo rpcr sigifica che si tratta dello stesso amplificato di DNA e che, ragioevolmete, il campioe cotiee quella specie (Fig. 4). Fig. 4: Curva di dissociazioe 38