Cromosoma batterico Plasmidi Elementi genetici trasponibili DNA fagico

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2 Cromosoma batterico Plasmidi Elementi genetici trasponibili DNA fagico

3 NUCLEOIDE = unico cromosoma libero nel citoplasma, dsdna, circolare superspiralizzato (lineare nei cromosomi eucariotici), mancano gli istoni ma ci sono proteine istone-like coinvolte nel packaging del cromosoma e nella regolazione della trascrizione. DIMENSIONI: ~750 kbp in Mycoplasma spp. ~5000 kbp in Escherichia coli = 5 milioni di coppie di basi per una lunghezza di 1,3 mm Nell uomo 23 coppie di cromosomi per 2,9x10 9 paia di basi pari a 990 mm

4 Mappa cromosomica dei geni di E. coli Funzioni: 20% metabolismo 10% trasporto 10% regolazione/replicazione 5% strutturali 5% sintesi proteica 50% ancora sconosciute o finalizzate a meccanismi di resistenza e patogenicita

5 Plasmidi Elementi genetici extracromosomici Stabili, replicazione autonoma (repliconi) Sono episomi ma alcuni possono integrarsi nel cromosoma Possono essere più copie per cellula (1-50) dsdna circolare, da 1.5 a 400 Kb Non codificano per funzioni vitali della cellula e quindi non sono essenziali, ma codificano per funzioni che possono rappresentare un VANTAGGIO per la cellula (scambio genico, resistenza, virulenza, ecc)

6 Diffusi e ubiquitari fra Gram+ e Gram-, sono un potente fattore di variabilità genetica. Forniscono le più disparate informazioni genetiche dispensabili o indispensabili, a volte stabili, a volte solo transitorie. Sono un potenziale di informazione flessibile e riarrangiabile. Sono trasmissibili per trasformazione e coniugazione e quindi acquisibili o spendibili agilmente per attrezzare la cellula ad adeguarsi ai fattori selettivi dell ambiente.

7 Plasmidi: replicazione autonoma La replicazione autonoma è indipendente dai tempi di replicazione batterica. Se il plasmide si duplica meno frequentemente del cromosoma alcune cellule figlie possono non ricevere alcuna copia del plasmide. Se si duplica più frequentemente del cromosoma, le cellule possono contenere copie multiple del plasmide. Di alcuni plasmidi ne sono stati trovati anche 50 copie in un'unica cellula; quindi rappresentano il veicolo ideale per la produzione di proteine e fattori necessari in alte concentrazioni (Es: resistenza antibiotici).

8 Coniugazione : Plasmide F formazione pili per trasferimento genico (trasmissione orizzontale) attraverso un ponte citoplasmatico. Resistenza agli antibiotici: Plasmidi R - degradazione enzimatica (e.g. penicillina) - modificazioni enzimatiche (e.g. cloramfenicolo) - alterata permeabilità (e.g. tetracicline) - alterazione del target (e.g. streptomicine) - via metabolica alternativa (e.g. sulfamidici) Virulenza: fattori di invasione, produzione tossine e colicine (es: Plasmide COL) Metabolismo e Catabolismo: es. produzione di siderofori

9 Plasmide F Il plasmide F è composto da 25 geni e regola la produzione dei pili F di coniugazione. Il trasferimento di un plasmide F conferisce alla cellula ricevente la capacità di produrre pili F (cellula F+). Il fattore F, come altri plasmidi, può essere autonomo ed extracromosomico, oppure può integrarsi nel cromosoma batterico; in tal caso diventa possibile il trasferimento di una porzione dello stesso cromosoma dalla cellula a un altra.

10 Plasmide R Il plasmide R conferisce la resistenza agli antibiotici, è caratterizzato dalla capacità di sintetizzare grandi quantità di enzimi che distruggono il farmaco. La resistenza dipende dalla sintesi di elevate concentrazioni di enzimi specifici resa possibile dalla rapida duplicazione di copie di questi geni. I geni R possono essere trasferiti non solo da una cellula a un altra, ma anche da un plasmide R ad un altro (trasposoni). Un solo plasmide può riunire fino a 10 geni per la resistenza quindi rendendo la cellula resistente fino a 10 antibiotici diversi. Tali geni possono anche essere trasferiti dai plasmidi al cromosoma batterico, ai virus e a batteri di altra specie.

11 Plasmide COL Sono plasmidi che codificano per le batteriocine o colicine. La secrezione di colicine può essere messa in evidenza su piastra esaminando le aree di lisi che si formano in una patina batterica intorno a colonie produttrici di colicina. Un batterio può essere immune ad una colicina se ne possiede il plasmide relativo, attraverso la secrezione di una proteina che lega la colicina.

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13 Variazioni genetiche nei batteri

14 Modificazioni geniche Mutazioni Ricombinazioni Meccanismi di scambio genico

15 mutazioni Ogni cambiamento nella sequenze di basi del DNA è denominato MUTAZIONE. TUTTE le mutazioni sono CASUALI. Alcune mutazioni sono instabili (cioè frequentemente ritornano al loro stato di origine), altre non incidono sull organismo (silenti), altre infine sono stabili e causano cambiamenti nelle caratteristiche dell organismo. Mutazioni puntiformi = piccoli cambiamenti (1 coppia di basi) Riarrangiamenti = cambiamenti più grandi (duplicazione, delezione, traslocazione, inversione) Le mutazioni avvengono durante la replicazione del DNA (frequenza di errore delle DNA polimerasi), oppure in seguito a danno chimico (Es: deaminazione della citosina in seguito a esposizione a raggi UV, specie reattive dell ossigeno, ecc. mutageni)

16 ricombinazioni Avvengono tra sequenze di DNA omologhe. L appaiamento di tali sequenze può essere seguito dalla formazione di crossing over tra le regioni omologhe, dando come risultato l inserimento della nuova sequenza in sostituzione di quella originale. Il fenomeno si può verificare ogni volta che nel batterio è introdotto un DNA esogeno omologo (trasformazione, coniugazione, trasduzione).

17 Segmenti di DNA mobili in grado di traslocare nell ambito della stessa cellula. Non capaci di replicazione autonoma. Trasposizione mediata da ricombinazione sito-specifica (enzima Trasposasi). A. Sequenze IS B. Trasposoni (Tn)

18 Scambio genetico A differenza di molti eucarioti (riproduzione sessuata mediante gameti), i procarioti non hanno la possibilità di variare il patrimonio genetico ad ogni generazione. Però possono scambiare piccole porzioni di DNA tra una cellula (donatrice) a un altra (ricevente). Mentre negli eucarioti lo scambio genetico avviene con un unico meccanismo (fusione dei gameti), nei procarioti questo può avvenire con 3 MECCANISMI DIVERSI.

19 1. TRASFORMAZIONE 2. CONIUGAZIONE 3. TRASDUZIONE

20 trasformazione Processo attraverso cui i batteri acquisiscono frammenti di DNA nudo e lo incorporano. I batteri devono essere competenti : alcuni lo sono naturalmente alla fine della fase log di crescita (Gram+ S. pneumoniae, Bacillus), oppure sempre (Gram- H. influenzae, Neisseria), mentre altri devono essere forzati (Es: trasformazione di E.coli con elettroporazione o metodi chimici).

21 coniugazione Trasferimento di DNA da un batterio donatore ( ) ad un batterio ricevente ( ) attraverso il pilo sessuale o pilo F. Il ruolo (sesso) è determinato dalla presenza del plasmide F. Può avvenire in quasi tutti i batteri.

22 Cosa avviene nella coniugazione

23 Importante: Il plasmide F non viene trasferito come DNA a doppia elica, ma a singola elica. Questo viene poi duplicato nuovamente in entrambe le cellule: donatrice (F+) e ricevente (F-).

24 Esiti della coniugazione Caso 1 F+ F+ x F+ F+ Caso 2 F+ x F- F+ F+

25 Hfr (High Frequency of Recombination) F + Hfr

26 1. Quando il fattore F si integra nel cromosoma batterico si forma una cellula Hfr. L integrazione avviene in un sito casuale nel cromosoma La cellula Hfr è capace di iniziare la coniugazione con una cellula F-. 3. Quando inizia il trasferimento del DNA, la cellula Hfr cerca di trasferire TUTTO il suo cromosoma alla cellula F-. Il primo DNA ad essere trasferito è quello cromosomico, mentre l ultimo è il fattore F Il trasferimento quasi mai è completo. I pili sono strutture fragili, ed è frequente che si rompano prima che l intero cromosoma sia trasferito. Quindi il fattore F stesso non è quasi mai trasferito, e la cellula ricevente resta F-. 3. Questa cellula però riceve nuovo DNA dalla cellula Hfr, e questo DNA può ricombinarsi con alta frequenza con il cromosoma ospite (Hfr= alta frequenza di ricombinazione). La ricombinazione può risultare in eventi di conversione genica, se il DNA trasferito e la corrispondente regione del DNA ospite contengono alleli diversi dello stesso gene. 4.

27 La quantità di geni trasferiti dipende dal TEMPO di coniugazione.

28 trasduzione Ricombinazione genetica attraverso un infezione fagica. Capside o testa Sistema contrattile Coda Fibre della coda Piastra basale

29 Due tipi di infezione Ciclo litico: infezione con fagi virulenti e conseguente lisi cellulare Ciclo lisogenico: infezione con fagi temperati ed integrazione del genoma virale (profago) nel genoma batterico senza lisi cellulare Il ciclo lisogeno può trasformarsi in ciclo litico con l uscita del profago dal genoma N.B. IMMUNITA FAGICA: durante lo stato lisogeno la cellula batterica e immune da infezioni di altri fagi dello stesso tipo del fago integrato

30 Infezione litica L infezione di un batterio da parte di un fago virulento provoca inevitabilmente la morte della cellula mediante lisi, con il rilascio di nuove particelle fagiche. Il ciclo litico dura circa 20 minuti. Una cellula batterica infettata da un solo fago può rilasciare centinaia di fagi progenie.

31 Infezione lisogenica Nell infezione di un batterio da parte di un fago temperato, il DNA del fago si può integrare nel cromosoma batterico. Il batterio si moltiplica indisturbato (batterio lisogenizzato). A volte il DNA integrato può excidersi dal cromosoma e ridare un ciclo litico. I nuovi fagi possono portare, nel loro DNA, frammenti di cromosoma batterico contenenti le sequenze vicine al sito di integrazione.

32 Generalizzata (associata al ciclo litico): trasduzione nella quale ogni gene batterico puo essere potenzialmente trasferito Specializzata (associata al ciclo lisogeno): trasduzione nella quale specifici geni batterici sono trasferiti

33 1. Infezione della cellula batterica (donatore) 2. Replicazione del fago e degradazione del DNA dell ospite 3. Assemblaggio delle particelle fagiche 4. Rilascio dei fagi neoformati 5. Infezione di una nuova cellula batterica (ricevente) 6. Ricombinazione omologa

34 Trasduzione specializzata 1. Infezione della cellula batterica (donatore) 2. Integrazione del fago (lisogenia) 3. Riattivazione del DNA fagico, replicazione e rilascio dei nuovi fagi 4. Infezione di una nuova cellula batterica (ricevente) 5. Ricombinazione omologa

35 CONVERSIONE FAGICA Batteri che assumono nuovi caratteri fenotipici quando vengono lisogenizzati con un profago ricombinato (contenenti geni di origine batterica). ESEMPI DI CONVERSIONE FAGICA: La trasformazione di batteri avirulenti in batteri produttori di tossine, eg. Corynebacterium diphtheriae (fago beta con proteina Tox) Amplia il corredo di tossine batteriche, eg. Clostridium botulinum (almeno due delle sette tossine botuliniche), Streptococcus pyogenes (alcune tossine pirogene) Modificazioni antigeniche che si riscontrano in alcune salmonelle, shigelle ed altri batteri

36 Base genetica dei fattori di virulenza