GENOMICA STRUTTURALE: GENOMICA FUNZIONALE:

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1 GENOMICA STRUTTURALE: GENOMICA FUNZIONALE: 1. Anatomia dei genomi 8. Funzionamento dei genomi Il genoma dei procarioti Modificazioni della cromatina e l espressione del Il genoma degli eucarioti genoma 2. La mappatura dei genomi Microarray e RNA-seq Mappatura genetica Metil-seq Mappatura fisica Chip-seq 3. Il sequenziamento automatico del DNA Il principio del sequenziamento secondo Sanger Il sequenziamento su larga scala La lettura dei tracciati di sequenziamento 4. Il sequenziamento del genoma I nuovi metodi di sequenziamento Il sequenziamento gerarchico Il sequenziamento shogun Piattaforme di sequenziamento di interi genomi 5. Assemblaggio e annotazione del genoma Copertura del genoma Phrap/Consed Approccio Overlap-Layout-Consensus ed Euleriano La verifica delle sequenze Le caratteristiche funzionali delle sequenze genomiche 6. I Progetti Genoma Il Progetto Genoma Umano Il Progetto Genoma Animali Il Progetto Genoma Piante Il Progetto Genoma Microrganismi 7. Genotipizzazione Gli SNP e la variazione La genotipizzazione degli SNP

2 la diversitàèricchezza

3 variabilità genetica

4 La riproduzione sessuata mantiene elevata la diversità biologica La riproduzione asessuata produce tutti discendenti identici al progenitore (cloni) Le mutazionisono la fonte principale per la diversità biologica

5 Da che cosa sono causate le mutazioni? Un certo numero di errori durante la replicazione del DNA avviene spontaneamente. Il tasso di mutazione può essere enormemente aumentato dall esposizione ad agenti mutageni Agenti fisici (ad esraggi X o UV) Agenti mutageni chimici

6 I diversi tipi di mutazioni Mutazioni geniche(o puntiformi) Mutazioni cromosomiche

7 Mutazioni geniche Le mutazioni geniche o puntiformi sono dovute in gran parte alla sostituzione di una singola base nucleotidica del DNA con un altra Altri tipi di mutazione si originano in seguito alla perdita (delezione) o alla inserzione di una base nel filamento del DNA Sostituzione Delezione Inserzione

8 Sostituzione di una base nucleotidica con un altra Single Nucleotide Polymorphism La sostituzione di una base può avere conseguenze più o meno grandi sul prodotto finale (la proteina specificata da quel gene). In base alle conseguenze se ne distinguono tre tipi: mutazioni silenti mutazioni di senso mutazioni non senso

9 Mutazioni silenti. Se in seguito alla sostituzione di una base si ottiene una tripletta che specifica per lo stesso aminoacido la proteina prodotta sarà la stessa il codice genetico è degenerato Le sostituzioni silenti riguardano solitamente la terza base del codone, quella che varia tra codoni diversi che specificano lo stesso aminoacido

10 Mutazioni di senso. Nella maggior parte dei casi la nuova tripletta codifica per un diverso aminoacido il codice genetico è degenerato CCU Prolina GCU Alanina CAU Istidina ACU Treonina CAA Glutamina AAU Asparagina La proteina avrà quindi lo stesso numero di aminoacidi ma una sequenza che differisce per un aminoacido GAG GTG = Glu6Val

11 Mutazioni nonsenso. Se il nuovo codone che si forma dalla sostituzione codifica per il segnale di stop avremo una proteina più corta della precedente AAG Lisina UAG codone di STOP

12 Delezione o inserzione di una base mutazioni per spostamento della griglia di lettura Talvolta l errore consiste nell inserire una base in più nella sequenza del DNA. Altre volte durante la replicazione o durante la riparazione del DNA si ha la perdita di una base In entrambi i casi la lettura di tutta la sequenza che segue viene completamente alterata inserzione A A U G A G G A C U C C C G G A U U A Met Arg Thr Pro Gly Leu A U G A G G A A C U C C C G G A U U A Asp Ser Arg Iso

13 I diversi tipi di mutazioni Mutazioni geniche (o puntiformi) Mutazioni cromosomiche Mutazioni nel numero dei cromosomi Mutazioni nella struttura

14 Mutazioni nella strutturadei cromosomi Esistono 4 tipi principali di mutazione della struttura dei cromosomi delezione duplicazione inversione traslocazione

15 Mutazioni nel numerodei cromosomi aneuploidia Monosomie e trisomie Accade talvolta che alla meiosi i due omologhi anziché separarsi, migrino entrambi nella stessa cellula figlia (non disgiunzione). In questo modo si creano due cellule figlie, una con un cromosoma in meno e una con un cromosoma in più Monosomia Trisomia

16 Checosasignificaregenotipizzare? genotyping Analizzarele variazioninellasequenza didna genotipo= la costituzionegeneticadi un individuo

17 Allele forma alternativadiun gene o sequenzadidna, in una determinata posizione cromosomica (locus) in ciascunlocusun individuopossiede2 alleli, uno ereditato dal padre, uno dalla madre genotipo: èla sommadeidue alleliin tuttele posizioni

18 differenzegenetiche: Possono causare o predisporre ad una malattia Determinano le risposte individuali a stimoli chimici/ambientali Vengono usate come MARCATORI per identificare geni sono necessarie tecnologie di genotipizzazione su larga scala high-throughput genotyping technologies

19 POLIMORFISMO GENETICO Un sito viene definito polimorfico se di esso si conoscono almeno due forme allelichela piùrara delle quali ha una frequenza di almeno l 1%

20 SNP markers Single Nucleotide Polymorphism GTGGACGTGCTT[G/C]TCGATTTACG

21 Sostituzione di una base nucleotidica con un altra Single Nucleotide Polymorphism

22 Sostituzione di una base nucleotidica con un altra Single Nucleotide Polymorphism La sostituzione di una base può avere conseguenze più o meno grandi sul prodotto finale (la proteina specificata da quel gene). In base alle conseguenze se ne distinguono tre tipi: mutazioni silenti mutazioni di senso mutazioni non senso

23 Sostituzione di una base nucleotidica con un altra Single Nucleotide Polymorphism A seconda della regione di sequenza in cui cadono, i polimorfismi possono essere definiti SNP non codificantie SNP codificanti. Gli SNP non codificanticoinvolgono regioni di DNA non trascritte in 5 o 3 (NTR), regioni non tradotte in 5 o 3 (UTR), introni, oppure tratti intergenici. Sono anche detti polimorfismi di non sostituzione e possono comunque avere un effetto determinante sulla funzionalità genica, influenzando la regolazione della trascrizione e della traduzione oppure l aatività del promotore, lo splicing e la stabilitàdell RNA. Gli SNP codificanti riguardano segmenti di DNA tradotto e possono a loro volta essere distinti in polimorfismi di sostituzione, se modificano l aminoacido codificato, e in polimorfismi sinonimi se cambiano il codone ma non l aminoacido.

24 ... SNPmarkers È il polimorfismo più semplice Altamenteabbondante; unosnp ogni1000 bp nel genoma umano La maggior parte non alterano le funzioni cellulari Largamente usati come marcatori

25 Genotipizzazionedei polimorfismi nucleotidici singoli L elevata frequenza delle variazioni presenti nella sequenza del DNA del genoma umano, particolarmente in forma di polimorfismi nucleotidici singoli (SNP), fornisce una fonte abbondante e preziosa di marcatori genetici utili per studi di mappature genomica. Inoltre l ottenimento della stesura completa del genoma umano hanno aperto una nuova era per la caratterizzazione sistematica dei geni umani stimati, ed hanno reso possibile l analisi delle funzioni geniche e la loro associazione con le malattie di origine genetica.

26 A) Metodiche classiche per l identificazione di Polimorfismi Metodi enzimatici Sequenziamento del DNA (metodo Sanger) Restriction Fragment Length Polymorphism(RFLP) Flap endonucleasi(fen) Primer extension Oligonucleotide ligase assay(ola) Metodi basati sulle proprietà fisiche del DNA Denaturing Gradient Gel Electrophoresis(DGGE) Single Stranded Conformation Polymorphism(SSCP) Denaturing high performance liquid chromatography(dhplc) Metodi basati sull ibridazione 5 nuclease assay(taqman assay) Allele-Specific Oligonucleotide Hybridization(ASO) Dynamic Allele-Specific Hybridization(DASH) Molecular beacons B) High-throughput SNP genotyping

27 PCR e Sequenziamento del DNA (metodo Sanger)

28 Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP)

29

30 Elettroforesi su gel a gradiente denaturante(dgge)

31 Analisi del polimorfismo di conformazione del filamento singolo(sscp)

32 Cromatografia liquida denaturante ad alta risoluzione (DHPLC)

33 JOE SUTLIFF A prerequisite to understanding the complete biology of an organism is the determination of its entire genome sequence Fleischmann et al. 1995

34 High-throughputgenotyping