Caratteristica fondamentale delle cellule vegetali TOTIPOTENZA. È possibile rigenerare un intera pianta da singole cellule differenziate

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2 Caratteristica fondamentale delle cellule vegetali TOTIPOTENZA È possibile rigenerare un intera pianta da singole cellule differenziate Tranne quelle che hanno perso il nucleo (tracheidi, elementi del cribro)

3 Le cellule vegetali possono essere coltivate in vitro, cioè un ambiente asettico in cui le condizioni chimicofisiche sono sotto controllo LUCE (composizione spettrale, fotoperiodo) TEMPERATURA COMPOSIZIONE CHIMICA DEL MEZZO (nutrienti minerali, carboidrati, vitamine, regolatori di crescita) DENSITA DELLA POPOLAZIONE CELLULARE (numero di cellule per unità di volume)

4 Cellule in coltura private della parete PROTOPLASTI possono propagarsi indefinitamente protoplasti di cellule del protoplasti di cellule del mesofillo mantenute in coltura in presenza di mannitolo per evitare la lisi

5 Le colture cellulari possono essere impiegate: nella RICERCA DI BASE (studio della biologia cellulare) per SCOPI APPLICATIVI (produzione di metaboliti secondari)

6 RICERCA DI BASE In natura le condizioni ambientali variano nello spazio e nel tempo in modo non controllabile In vitro è possibile variare uno specifico fattore ambientale (mantenendo invariati gli altri) per studiare la sua influenza su particolari aspetti della biologia cellulare studio del ruolo di un componente del terreno di coltura su una specifica via biosintetica

7 RICERCA DI BASE le colture cellulari possono essere utilizzate per lo studio di specifiche vie biosintetiche precursore 1 precursore 2 prodotto il prodotto deriva dal precursore 1 o dal 2? ESPERIMENTO 1 ESPERIMENTO 2 precursore 1 marcato prodotto non marcato precursore 2 marcato prodotto marcato IL PRODOTTO DERIVA DAL PRECURSORE 2

8 INTERESSE APPLICATIVO le cellule in coltura possono essere utilizzate per produrre sostanze utili per l industria farmaceutica, agroalimentare, cosmetica, ecc. l estrazione di metaboliti secondari dalla pianta comporta generalmente la distruzione della pianta stessa problema se: RARA (difficile da reperire, protetta) DI DIFFICILE COLTIVAZIONE A CRESCITA LENTA (piante legnose)

9 Non sempre le cellule in coltura, indifferenziate, producono i metaboliti di interesse. Alcune vie biosintetiche sono: cellula-specifiche: sono attive solo in alcune cellule specializzate (ghiandole, latticiferi, ecc.) tessuto-specifiche: sono attive solo in alcuni tessuti (epitelio di dotti e cavità secretorie, parenchima corticale, tegumento) organo-specifiche: sono localizzate solo in uno specifico organo (radice, foglia, fiore, frutto, ecc.)

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11 In coltura possono essere mantenute anche strutture organizzate meristemi germogli radici nodi embrioni antere

12 germoglio radici antere

13 Terreni di coltura per cellule e tessuti vegetali sali minerali fonte di carbonio vitamine regolatori di crescita altri composti organici Optimum di ph

14 COMPOSIZIONE - SALI MINERALI MACROELEMENTI: elementi richiesti ad una concentrazione > 0.5 mm Macroelementi essenziali: N, K, P, Ca, S, Mg, Cl MICROELEMENTI: elementi richiesti ad una concentrazione < 0.5 mm Microelementi essenziali: Fe, Mn, B, Cu, Zn, I, Mo, Co

15 composizione in sali minerali di alcuni terreni

16 Funzione dei sali minerali nella crescita in vitro Elemento Funzione N K Ca Mg P S Cl Fe Mn Co Cu Zn Mo Componente di proteine, acidi nucleici, alcuni coenzimi richiesto in elevate quantità Regola il potenziale osmotico principale catione inorganico Parete cellulare, funzione della membrana, signalling Cofattore enzimatico, componente clorofilla Componente acidi nucleici, intermedi metabolismo del carbonio Componente di alcuni amminoacidi e di alcuni cofattori Richiesto nella fotosintesi, movimenti stomatici Componente dei citocromi (trasferimento energia) Cofattore enzimatico Componente di alcune vitamine Reazioni di trasferimento elettronico, cofattore enzimatico Biosintesi clorofilla, cofattore enzimatico Componente della nitrato-reduttasi (metabolismo dell azoto)

17 SORGENTE DI CARBONIO E VITAMINE Saccarosio o glucosio, concentrazione 2-5% indispensabile vitamina B1 (tiamina) crescita aumentata da acido nicotinico e vitamina B6 (piridossina) alcuni terreni contengono: acido pantotenico, biotina, acido folico, acido p-amminobenzoico, colina, riboflavina e acido ascorbico

18 Dai tessuti in coltura è possibile rigenerare l intera pianta avventizi germogli radici embrioni caulogenesi rizogenesi embriogenesi somatica embrioidi o embrioni somatici

19 caulogenesi rizogenesi embriogenesi somatica

20 MORFOGENESI DIRETTA da cellule differenziate di tessuto senza proliferazione di tessuto indifferenziato MORFOGENESI INDIRETTA da cellule de-differenziate di callo (proliferazione di tessuto indifferenziato)

21 Tessuto vegetale che si forma intorno ad una ferita

22 massa di tessuto amorfo formato da cellule che si moltiplicano in maniera disorganizzata si può ottenere da espianti di tessuto sotto lo stimolo di regolatori di crescita endogeni o presenti nel mezzo, le cellule di un espianto di tessuto vanno incontro a de-differenziamento e formano un nuovo tessuto di cellule non specializzate

23 embriogenesi somatica diretta sviluppo di embrioni somatici su espianto di tessuto embriogenesi somatica indiretta sviluppo di embrioni somatici su callo

24 morfogenesi indiretta sviluppo di germogli su callo

25 callo nodulare (embriogenico) callo friabile (non-morfogenico)

26 la capacità di formare un callo è diversa da specie a specie e da tessuto a tessuto (particolarmente nelle monocotiledoni) canna da zucchero

27 la morfogenesi è stata osservata in numerose specie, ma non può essere indotta universalmente, anche all interno di una stessa specie alcune varietà sono recalcitranti cellule che hanno la capacità di dar luogo a morfogenesi sono dette COMPETENTI la competenza è generalmente verso una specifica via di sviluppo: una cellula competente per lo sviluppo dell embrione somatico non lo è anche per lo sviluppo del germoglio Le cellule possono essere indotte a diventare competenti aggiungendo nel mezzo di coltura opportuni regolatori di crescita

28 Dal callo è possibile ottenere cellule in sospensione Espianti fogliari callogenesi pianta Prelievo degli espianti Sterilizzazione Inoculo in mezzo callogenico Inoculo in mezzo liquido callo Espianti caulinari callogenesi SOSPENSIONE CELLULARE BIOREATTORE

29 COME SI RIGENERA UNA PIANTA?

30 ruolo fondamentale nel processo morfogenetico è svolto da ormoni vegetali

31 auxina e citochinine intervengono nella regolazione della divisione cellulare Sovraespressione del gene che codifica per la citochinina ossidasi (ridotti livelli di citochinine) in tabacco ritardo nello sviluppo del germoglio dovuto alla riduzione della velocità di proliferazione cellulare nel meristema apicale WT transgeniche

32 Sovraespressione del gene che codifica per la citochinina ossidasi (ridotti livelli di citochinine) in tabacco aumento della velocità di crescita della radice aumento della proliferazione nel meristema radicale

33 la carenza di auxina provoca l arresto in fase G1 la carenza di citochinine provoca l arresto in fase G2 auxina e citochinine partecipano alla regolazione del ciclo cellulare controllando l attività delle CHINASI CICLINA-DIPENDENTI Cdc2 inattiva Cdc25 auxina citochinine Cdc25 tirosin-fosfatasi Cdc2 attiva

34 Recentemente è stato dimostrato che le citochinine incrementano l espressione del gene CYCD3 (negli animali le cicline di tipo D regolano il passaggio in fase G1) In Arabidopsis CYCD3 è espresso in tessuti proliferativi come i meristemi dei germogli

35 Skoog e Miller (1957): alti livelli di citochinine e bassi libelli di auxina inducevano la formazione di germogli in calli di tabacco in coltura 0 0,2 concentrazione di IAA (mg/l) 0 0,005 0,03 0,18 1,08 3,0 concentrazione di chinetina (mg/l) 1,0

36 auxina auxina + citochinina

37 Callo Sviluppo del germoglio dal callo + citochinine questo processo è abbastanza semplice per le dicotiledoni sviluppo del germoglio

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39 AUXINA alta CITOCHININA bassa formazione di radici su espianti induzione callo nelle monocotiledoni I stadio embriogenesi formazione radici avventizie su callo induzione callo nelle dicotiledoni formazione germogli avventizi bassa proliferazione di gemme ascellari in colture di germogli alta

40 IAA AUXINE IBA (acido 3-indolbutirrico) NAA (acido 1-naftalenacetico) 2,4 D (acido 2,4-diclorofenossiacetico)

41 CITOCHININE

42 Come si propagano le piante Riproduzione sessuale Riproduzione asessuale

43 PROPAGAZIONE VEGETATIVA riproduzione asessuale cactus opuntia bigelovii kalanchoe la progenie è costituita da cloni geneticamente identici alla pianta madre

44 stoloni fragola patate

45 Specie propagate vegetativamente banana alberi da frutto (mele, pere, agrumi) manioca patata fragole cacao canna da zucchero

46 INNESTO portainnesto il portainnesto determina l altezza dell albero da frutto selezionati per la resistenza a malattie

47 propagazione mediante TALEA auxina per indurre la formazione delle radici

48 PROPAGAZIONE IN VITRO (MICROPROPAGAZIONE) Permette di ottenere un elevato numero di Permette di ottenere un elevato numero di piantine identiche sia genotipicamente che fenotipicamente alla pianta madre

49 gemma apicale foglia Materiale di partenza per la micropropagazione gemma ascellare internodo radici

50 micropropagazione moltiplicazione di germogli da gemme ascellari formazione di germogli avventizi formazione di embrioni somatici avventizi direttamente su espianti della pianta madre indirettamente da colture in sospensione o calli

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52 la crescita e la proliferazione di gemme ascellari è indotta in seguito alla diminuzione di dominanza apicale rimozione dell apice aggiunta di citochinina nel terreno di coltura

53 ciclamino impatiens

54 pino orchidea

55 VANTAGGI della micropropagazione specie che non si possono propagare altrimenti spazi ristretti condizioni asettiche: assenza di batteri, funghi e altri microorganismi metodiche per ottenere piante prive di virus (orchidee) produzione indipendentemente dalla stagione vegetativa maggiore possibilità di variare i fattori che influenzano la crescita acquisizione di nuove caratteristiche (es. stoloni fragole)

56 SVANTAGGI della micropropagazione le piantine hanno bisogno di un periodo di adattamento per diventare autotrofe cresciute in alta umidità sono più suscettibili alla perdita di acqua epigenetica variazione somaclonale ereditabile transiente non si eredita perdita della richiesta di ormoni e vitamine

57 VARIAZIONE SOMACLONALE Aberrazioni cromosomali - alterazioni nel numero e nella struttura dei cromosomi - riarrangiamenti cromosomici - differenze nel numero di copie di sequenze di DNA (amplificazione o diminuzione di sequenze ripetute) - metilazione del DNA

58 camera climatica

59 Spesso la limitazione maggiore alla trasformazione delle piante non è la metodica di trasferimento del DNA, quanto la rigenerazione della pianta

60 Quando si effettua una trasformazione, sia con Agrobacterium che con il sistema biolistico, vista la bassa efficienza della rigenerazione, sarà necessario utilizzare un numero elevato di espianti per essere certi di ottenere piantine trasformate I cloni trasformati ottenuti vengono poi MICROPROPAGATI

61 E possibile evitare la coltura dei tessuti e la rigenerazione della pianta?

62 Trasformazione in planta non richiede coltura di tessuti e rigenerazione della pianta Esclusivamente per Arabidopsis thaliana - trasformazione di semi - inoculazione DNA in pianta Agrobacterium - infiltrazione nel fiore (floral dip) co-coltivazione dei semi con Agrobacterium rimozione del germoglio apicale e infiltrazione con Agrobacterium del tessuto meristematico ferito 5% dei nuovi germogli sono trasformati immersione dei fiori nella sospensione batterica o infiltrazione sotto vuoto nel periodo della fecondazione

63 Floral dip immersione delle infiorescenze nella sospensione batterica

64 Si produrranno semi transgenici da cui si otterranno le piante trasformate senza dover passare per la fase di rigenerazione e coltura in vitro dei tessuti Floral dip Le piante possono essere poi propagate da seme sistema per recuperare i semi da Arabidopsis i semi si raccolgono nel cono