10 Analisi diallelica

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1 10 Analisi diallelica Nota sull Analisi...(2 a ed.) L'analisi diallelica, frequentemente utilizzata nel miglioramento genetico, ha lo scopo di determinare per un certo carattere quantitativo l'attitudine alla combinazione, nelle sue componenti di generale e specifica, di un insieme di genotipi parentali ognuno dei quali viene incrociato con tutti gli altri. L'attitudine generale alla combinazione (GCA) si riferisce alla performance media di un parentale nella serie di incroci in cui esso costituisce uno dei genitori. L'attitudine specifica alla combinazione (SCA) di due parentali si riferisce alla differenza tra il valore realmente osservato nella loro progenie F 1 ed il valore per essa atteso in base alla performance media dei due parentali. Differenze in valori di GCA sono legati alla presenza di geni ad azione additiva, mentre la SCA dipende dal verificarsi di dominanza genica o di fenomeni di interazione genica. Lo schema diallelico di incroci può includere o no i parentali autofecondati. Esso può inoltre prevedere o no la presenza degli incroci reciproci, cioè l'esecuzione di due incroci per ciascuna combinazione utilizzando i parentali una volta ciascuno come linea materna. Si possono così distinguere secondo Griffing i seguenti 4 schemi di incrocio, che si riportano con i relativi numeri di incroci da eseguire per ciascuno schema in corrispondenza di un numero n di linee parentali: Schema Diallele Numero di incroci 1 con parentali, con reciproci n 2 2 con parentali, senza reciproci n (n+1) / 2 3 senza parentali, con reciproci n (n-1) 4 senza parentali, senza reciproci n (n-1) / 2 Inoltre, i parentali possono essere considerati un fattore fisso oppure casuale. Nel primo caso le conclusioni sperimentali sono limitate all'insieme dei materiali adottati, nel secondo esse sono estese a quella popolazione statistica della quale i genotipi prescelti rappresentano un campione casuale. Infine, la variabile osservata potrà riferirsi a valori medi per unità sperimentale o parcella (siano essi dati dalla media di più valori individuali o da un unico valore rilevato sull'intera parcella), oppure a più dati individuali per parcella. Nel caso in cui lo studio si concentri sull'esame dell'attitudine alla combinazione, senza cioè eseguire un'analisi genetica del carattere, lo schema di incrocio più frequentemente adottato è il quarto. Con riferimento a questo schema, ad un disegno sperimentale in blocchi randomizzati e ad una variabile di risposta relativa a valori medi parcellari, il modello statistico generale dell'analisi è il seguente: Y ijk = µ + g i + g j + s ij + B k + (g i + g j + s ij ) B k + e ijk 10 Analisi diallelica 224

2 essendo Y ijk il valore della variabile di risposta per l'incrocio tra i parentali i e j nel blocco k, µ la media generale degli incroci, g i e g j le GCA dei parentali i e j, s ij la SCA dei parentali i e j, B k l'effetto del blocco k, (g i + g j + s ij ) B k l'interazione tra incrocio e blocco, e ijk l'errore casuale. Il fattore "blocco" è casuale. A seconda che i parentali siano considerati un fattore fisso o casuale, si può avere un modello di analisi misto oppure casuale. Considerando col termine N il numero di blocchi, le varianze relative alle diverse fonti di variabilità sono implicate nell'esecuzione dei test F secondo i due seguenti schemi di analisi della varianza: Sorg. di Varianze Test F Test F variazione degli effetti modello misto modello casuale Incroci Blocco Errore Incroci Blocco Incroci x Blocco GCA GCA SCA SCA Errore (Incroci x Blocco) / N 10 Analisi diallelica 225

3 10.1 Analisi diallelica senza parentali e reciproci Nota sull Analisi...(2 a ed.) L'analisi, non direttamente eseguibile attraverso una specifica PROC del SAS, viene eseguita con la redazione di un programma specifico. Il programma riportato si riferisce al caso in cui la variabile di risposta sia espressa in valori medi parcellari. Esso permette l'analisi sia nel caso di un modello misto che di un modello casuale, attraverso una opzione che va specificata all'inizio del programma. Naturalmente, tale programma non ha la pretesa di essere il più breve o il più efficiente per l'esecuzione dell'analisi considerata. Prima dell'analisi diallelica, il programma esegue una AV-2 comprendente i fattori "incrocio" e "blocco" accompagnata dal test di Newman e Keuls per l'esecuzione di confronti multipli fra gli incroci per un livello di P Segue il test F per GCA e SCA e la stima dei valori di GCA e SCA per parentale. Infine, se il modello di analisi è misto viene calcolato l'errore standard per l'eventuale successivo calcolo manuale della m.d.s. per GCA tra parentali, mentre se il modello è casuale viene calcolata la stima dei valori attesi della varianza di GCA e SCA. Nell'esempio, il diallele ha compreso 7 linee pure di mais omozigoti per l'allele "bm3" (che riduce il contenuto in lignina nella pianta), per la complessiva esecuzione di 21 incroci. Il carattere osservato è l'altezza della pianta (in cm.). I parentali sono considerati un fattore fisso, ed il modello di analisi diallelica è perciò misto. PROGRAMMA SAS Per l'uso del programma, si consiglia di redigere e memorizzare in un file.sas l'intero programma riportato ad eccezione delle prime 4 righe di commento, di titolo all'esempio, e delle righe di dati dell'esempio stesso. Una volta richiamato il programma così memorizzato, i dati potranno essere via via inseriti dopo l'istruzione CARDS oppure, se già memorizzati su un file ASCII, richiamati con il comando INC in fondo al programma dopo avere richiamato il programma stesso e poi spostati in blocco subito dopo CARDS. Le variabili devono essere 4 e vanno inserite in un ordine definito. Le prime due sono riservate ai due parentali di ciascun incrocio, la terza al blocco randomizzato e la quarta alla variabile osservata. Nell'indicare i parentali, si dovrà sempre riportare nella prima variabile quello di ordine alfanumerico più basso (si ricorda che i numeri precedono le lettere in tale ordine). Non è però necessario raggruppare le osservazioni in funzione dei parentali, si può anche riportare le osservazioni in base ad un ordine di parcella come viene fatto nell'esempio. Vengono qui riservati 3 caratteri per la codifica di ciascuno dei parentali. E' possibile destinare un numero diverso di caratteri per tale codifica purchè il numero di caratteri per parentale resti costante, modificando nell'istruzione INPUT i numeri che seguono la variabile "incrocio". Per tale variabile viene usato un tipo di input detto "formattato" che indica la posizione sulla riga di dati ove leggere la variabile stessa, nell'esempio tra il primo ed il settimo carattere. Se ad esempio la codifica avesse riservato 5 caratteri per ciascun parentale, l'input avrebbe compreso INCROCIO $ Il modello dell'analisi va indicato alla prima riga di programma, %LET MODELLO =, inserendo il numero 1 se il modello è misto ed il numero 2 se è casuale. A parte questa indicazione, e l'anzidetta eventuale modifica delle cifre che seguono INCROCIO nell'istruzione INPUT, nessuna altra parte del programma deve essere modificata. 10 Analisi diallelica 226

4 10.1 ANALISI DIALLELICA SENZA PARENTALI E RECIPROCI E. GENTINETTA ET AL. (1990) - J. Genet. & Breed. 44: ; programma per analisi diallelica senza parentali e reciproci (metodo 4 secondo Griffing) scritto da Paolo Annicchiarico (ISCF, Lodi) per esperimenti pianificati in blocchi randomizzati ed analisi eseguita su valori medi parcellari (variabile VOBS) indicare a %LET MODELLO = il tipo di modello: scrivere 1 se modello misto (parentali = fattore fisso), 2 se modello casuale (parentali = fattore casuale) ; %LET MODELLO = 1; ; DATA INIT; INPUT P1 $ P2 $ INCROCIO $ 1-7 BLOCCO VOBS; CARDS; b52 b b77 h b52 c b52 h b52 h b73 h b52 b b73 b b73 c c10 h h29 h b77 c b73 h b77 h b77 h b52 h c10 h b73 h h56 h h29 h c10 h b73 b b52 b b77 h b73 h c10 h h29 h b73 c b73 h b52 b b73 h b77 h b52 h b52 h h56 h h29 h b52 c b77 h Analisi diallelica 227

5 b77 c b52 h c10 h c10 h b52 b b73 b b77 h c10 h b52 h h56 h c10 h b73 h b73 c h29 h b52 c b73 h b52 b b77 c b77 h b77 h c10 h b52 h b52 h h29 h b73 h ; ; PROC SORT; BY P1 P2; analisi della varianza e conservazione dell'errore sperimentale ; PROC ANOVA OUTSTAT=AV1 (KEEP = _SOURCE_ DF SS); TITLE 'Analisi diallelica senza parentali e reciproci'; TITLE2 'analisi della varianza'; CLASS INCROCIO BLOCCO; MODEL VOBS = INCROCIO BLOCCO; MEANS INCROCIO / SNK ALPHA=0.05; DATA AV2; SET AV1; IF _SOURCE_ = 'ERROR'; DATA AV3; SET AV2; KEEP DF SS; DATA AV4; SET AV1; IF _SOURCE_ = 'BLOCCO'; DATA AV5; SET AV4; NBLOCCHI = DF+1; DATA AV6; SET AV5; KEEP NBLOCCHI; medie per incrocio ; PROC MEANS MEAN NOPRINT DATA=INIT; TITLE2; 10 Analisi diallelica 228

6 BY P1 P2; VAR VOBS; OUTPUT OUT=M1 MEAN=M1VOBS; DATA DIAL1; SET M1 ; KEEP P1 M1VOBS; DATA DIAL2; SET M1; KEEP P2 M1VOBS; DATA DIAL3; SET DIAL2; P1 = P2 ; DATA DIAL4; SET DIAL3; DROP P2; DATA DIAL5; SET DIAL1 DIAL4; PROC SORT; BY P1; somma dei quadrati delle medie per incrocio ; DATA DIAL6; SET M1; X2 = M1VOBSM1VOBS; PROC MEANS SUM NOPRINT; VAR X2; OUTPUT OUT=EX2 SUM=X2SUM; somma dei quadrati delle somme degli incroci con un certo genitore ; PROC MEANS SUM MEAN NOPRINT DATA=DIAL5; BY P1; VAR M1VOBS; OUTPUT OUT=E1 SUM=M1SUM MEAN=M1MEAN; DATA DIAL7; SET E1; E2 = M1SUMM1SUM; PROC MEANS SUM N NOPRINT; VAR E2; OUTPUT OUT=EE2 SUM=E2SUM N=P; PROC MEANS SUM NOPRINT DATA=E1; VAR M1SUM; OUTPUT OUT=EE SUM=EESUM; DATA DIAL8; SET EE; EESUM2 = (EESUM/2)(EESUM/2); DATA PAR; SET EE2; KEEP P; calcolo G.C.A. ed S.C.A., esecuzione dei test F, stampa dei risultati ; DATA DIAL9; MERGE EX2 EE2 DIAL8 PAR AV3 AV6; KEEP X2SUM E2SUM EESUM2 P DF SS NBLOCCHI; DATA DIAL100; SET DIAL9; MOD = SYMGET('MODELLO'); SSGCA = ( E2SUM / (P-2)) - ((EESUM24) / (P(P-2))) ; 10 Analisi diallelica 229

7 SSSCA = X2SUM - (E2SUM / (P-2)) + (( EESUM22) / ((P-1)(P-2))); GCA = (( E2SUM / (P-2)) - ((EESUM24) / (P(P-2)))) / (P-1); SCA = (X2SUM - (E2SUM / (P-2)) + (( EESUM22) / ((P-1)(P-2)))) / ((P(P-3))/2); DFGCA = P-1; DFSCA =((P(P-3))/2); MSERR = (SS/DF) / NBLOCCHI; IF MOD = 1 THEN DO; FGCA = GCA/MSERR; IF MOD = 2 THEN DO; FGCA = GCA/SCA; FSCA = SCA/MSERR; IF MOD = 1 THEN DO; PROBGCA = 1-PROBF(FGCA,DFGCA,DF); IF MOD = 2 THEN DO; PROBGCA = 1-PROBF(FGCA,DFGCA,DFSCA); PROBSCA = 1-PROBF(FSCA,DFSCA,DF); RSSGCA = ROUND(SSGCA,.001); RSSSCA = ROUND(SSSCA,.001); RSS = ROUND(SS,.001); RGCA = ROUND(GCA,.001); RSCA = ROUND(SCA,.001); RMSERR = ROUND(MSERR,.001); RFGCA = ROUND(FGCA,.001); RFSCA = ROUND(FSCA,.001); FILE PRINT; PUT 'test delle attitudini generale e specifica alla combinazione'; PUT ' ' ; PUT ' G.C.A. DF = ' DFGCA ' SS = ' RSSGCA ' MS = ' RGCA; PUT ' F = ' RFGCA ' PROB = ' PROBGCA; PUT ' ' ; PUT ' S.C.A. DF = ' DFSCA ' SS = ' RSSSCA ' MS = ' RSCA; PUT ' F = ' RFSCA ' PROB = ' PROBSCA; PUT ' ' ; PUT ' ERROR PER TEST DF = ' DF ' MS = ' RMSERR; stima degli effetti specifici ; PROC SORT DATA=M1; BY P1; DATA ESP1; SET E1; P2 = P1; M2MEAN = M1MEAN; M2SUM = M1SUM; KEEP P2 M2MEAN M2SUM; DATA ESP2; MERGE E1 M1; BY P1; PROC SORT; BY P2; DATA ESP3; MERGE ESP2 ESP1; BY P2; PROC SORT; BY P1 P2; 10 Analisi diallelica 230

8 PROC MEANS SUM N NOPRINT DATA=E1; VAR M1SUM; OUTPUT OUT=ESP4 SUM=SUMGEN N=GENI; DATA ESP5; SET ESP4; SUMGEN = SUMGEN/2; DATA ESPMACR; SET ESP5; CALL SYMPUT('GENSUM1',SUMGEN); CALL SYMPUT('GENI1',GENI); DATA ESP6; SET ESP3; KEEP P1 P2 M1VOBS M1SUM M2SUM; DATA ESP7; SET ESP6; GENSUM = SYMGET('GENSUM1'); NGENI = SYMGET('GENI1'); SPECIFIC = M1VOBS-((M1SUM+M2SUM)/(NGENI-2)) +((GENSUM2)/ ((NGENI-1)(NGENI-2))); PROC TABULATE; CLASS P1 P2 ; VAR SPECIFIC; LABEL P1 = 'PARENT 1'; LABEL P2 = 'PARENT 2'; LABEL SPECIFIC = '-'; TITLE2 'effetti di combinazione specifica'; TABLE P1,P2SPECIFICf=8.3; stima degli effetti generali ; DATA EGEN; SET E1; GENSUM = SYMGET('GENSUM1'); NGENI = SYMGET('GENI1'); EFFGEN =((M1SUMNGENI)-(2GENSUM))/(NGENI(NGENI-2)); PROC PRINT NOOBS; VAR P1 EFFGEN; TITLE2 'effetti di combinazione generale'; calcolo errore standard per confronti fra parentali per GCA (se modello fisso) oppure stima dei componenti della varianza (se modello casuale) ; DATA FIN; SET DIAL100; IF MOD = 1 THEN DO; SEGCA = SQRT(2MSERR/(P-2)); RSEGCA = ROUND(SEGCA,.001); FILE PRINT; TITLE2; TITLE3; PUT ' errore standard per confronto tra parentali per'; PUT ' attitudine generale alla combinazione'; PUT ' ' ; PUT ' STANDARD ERROR = ' RSEGCA; IF MOD = 2 THEN DO; GENERALE = (GCA-SCA)/(P-2); SPECIFIC = SCA-MSERR; FILE PRINT; PUT ' stima dei componenti della varianza per attitudine'; Nota sull Analisi...(2 a ed.) 10 Analisi diallelica 231

9 PUT ' generale e specifica alla combinazione'; PUT ' '; PUT ' GCA = ' GENERALE; PUT ' SCA = ' SPECIFIC; RUN; OUTPUT SAS Le differenze tra gli incroci sono altamente significative ➊. Dal test di Newman e Keuls si deduce che i 4 incroci con le altezze più elevate non differiscono significativamente. Sia gli effetti di GCA ➋ che quelli di SCA ➌ sono altamente significativi (con P = x (10) - 6 nel primo caso e P = x (10) -6 nel secondo, entrambi P 0.001). La M.D.S. per il confronto tra due genotipi per GCA si può calcolare dall'errore standard riportato in output ➍. Per un livello di P 0.05, t = e m.d.s.= x 3.577= La linea b52 è quindi quella con GCA significativamente più elevata. Lo schema di analisi della varianza potrà seguire l'ordine riportato al termine dell introduzione al capitolo, oppure riportare la varianza (mean square) di "incroci", GCA, SCA ed errore (interazione "incroci x blocco") con le varianze di GCA e SCA moltiplicate per il numero N di blocchi del disegno sperimentale, come fatto dagli autori del lavoro sperimentale. I risultati calcolati dal programma differiscono leggermente da quelli degli autori per un diverso arrotondamento dei dati nel corso dei calcoli. Class Levels Values Analisi diallelica senza parentali e reciproci analisi della varianza Analysis of Variance Procedure Class Level Information INCROCIO 21 b52 b73 b52 b77 b52 c10 b52 h29 b52 h56 b52 h96 b73 b77 b73 c10 b73 h29 b73 h56 b73 h96 b77 c10 b77 h29 b77 h56 b77 h96 c10 h29 c10 h56 c10 h96 h29 h56 h29 h96 h56 h96 BLOCCO Number of observations in data set = 63 Analysis of Variance Procedure Dependent Variable: VOBS Sum of Mean Source DF Squares Square F Value Pr > F Model Error Corrected Total R-Square C.V. Root MSE VOBS Mean Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F 10 Analisi diallelica 232

10 INCROCIO ➊ BLOCCO Analisi diallelica senza parentali e reciproci analisi della varianza Analysis of Variance Procedure Student-Newman-Keuls test for variable: VOBS NOTE: This test controls the type I experimentwise error rate under the complete null hypothesis but not under partial null hypotheses. Alpha= 0.05 df= 40 MSE= Number of Means Critical Range Number of Means Critical Range Number of Means Critical Range Number of Means Critical Range Means with the same letter are not significantly different. SNK Grouping Mean N INCROCIO A b52 h29 A B A b52 h96 B A B A C b77 h29 B A C B D A C b73 h29 B D C b52 h b52 c c10 h b52 b b73 h b77 h b73 h b52 b c10 h b77 c b73 c c10 h29 D E C D E C b77 h96 10 Analisi diallelica 233

11 D E C D E C h29 h56 D E D E b73 b77 E F E h29 h96 F F h56 h96 test delle attitudini generale e specifica alla combinazione G.C.A. DF = 6 SS = MS = F = PROB = E-6 ➋ S.C.A. DF = 14 SS = MS = F = PROB = E-6 ➌ ERROR PER TEST DF = 40 MS = effetti di combinazione specifica PARENT b73 b77 c10 h29 h56 h SUM SUM SUM SUM SUM SUM PARENT b b b c h h effetti di combinazione generale P1 EFFGEN b b b c h h h errore standard per confronto tra parentali per attitudine generale alla combinazione STANDARD ERROR = ➍ 10 Analisi diallelica 234