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2 Il cuore e l infarto acuto del miocardio L infarto acuto del miocardio è la causa leader di morte al mondo!!nel mondo ci sono circa 12 milioni di morti all anno per infarto miocardico, il che vuol dire che circa ogni 2 sec una persona muore per un infarto acuto del miocardio!!l'infarto miocardico è, nel 98% dei casi, conseguenza dell'aterosclerosi coronarica!!l'infarto miocardico è costituito dalla morte o necrosi di una zona del miocardio, dovuta all'improvvisa occlusione di uno o più rami delle arterie coronarie.!!l'occlusione del vaso, solitamente causata da trombosi, determina l interruzione dell apporto di nutrienti ed ossigeno al miocardio!!attualmente non esistono nuove terapie approvate per il riparo del miocardio dopo l infarto (UNMET MEDICAL NEED).

3 Trattamenti standard per il riparo dei tessuti cardiaci Come si interviene? La terapia farmacologica si focalizza sulla riduzione del carico di lavoro e sulla protezione dai fattori umorali tossici che sono sovrattivati durante l arresto cardiaco. La terapia interventiva, come la chirurgia o l impianto di dispositivi capaci di controllare l asincronia elettrico/meccanica, stanno ricevendo una più ampia applicazione specialmente per i pazienti con sintomi particolarmente gravi e con notevoli limiti nell attività. GOLD STANDARD Il trapianto cardiaco rimane l opzione risolutiva nel caso di grave scompenso cardiaco LIMITATA DISPONIBILITA DI DONATORI NECESSITA DI SVILUPPARE NUOVE FORME DI TERAPIE E NUOVE STRATEGIE

4 Trattamenti per il riparo dei tessuti cardiaci Sospensione cellulare Vunjak-Novakovic et al. / Tissue Engineering 2010 Cardiomioplastica cellulare L innesto di nuove cellule nel contesto del tessuto miocardico danneggiato, che abbiano la capacità di rigenerare il muscolo cardiaco ripristinando la sua funzione. E necessario stabilire:! quali sono le linee cellulari (cellule staminali, cardiomiociti, mioblasti..) più consone per il trapianto! quali sono le tecniche più efficaci per l innesto cellulare (via epicardica, endocardica oppure intracoronarica) Da un punto di vista funzionale, i requisiti fondamentali che le cellule innestate devono possedere sono:!colonizzare il miocardio (integrazione anatomica)!differenziare in senso cardiomiocitario!contrarsi efficacemente (integrazione funzionale)!creare un accoppiamento elettromeccanico con il tessuto miocardico circostante (integrazione elettromeccanica)

5 Trattamenti per il riparo dei tessuti cardiaci Principali limiti della cardiomioplastica cellulare Ogni linea cellulare proposta offre vantaggi e limiti peculiari in vista di un impiego clinico. Le cellule staminali di derivazione dal midollo osseo sono la scoperta più recente. Sebbene la loro utilizzazione appaia promettente (Zhang. 2006) rimangono molti punti da chiarire in merito al loro reale potenziale differenziativo nell uomo. Inoltre la somministrazione cellulare in fase liquida soffre di :!Limitata ritenzione e sopravvivenza delle cellule;!difficoltà nel controllare la distribuzione e posizione delle cellule iniettate;!difficoltà nel formare legami cellula-cellula e cellula-ecm (giunzioni intercellulari atte alla contrazione sincrona con il battito cardiaco).

6 Trattamenti per il riparo dei tessuti cardiaci Principali limiti della cardiomioplastica cellulare Le cellule rispondono al proprio ambiente e uno dei componenti regolatori chiave del comportamento cellulare è l ECM. Perché le cellule iniettate svolgano la loro normale funzione riparatrice è necessario che si trovino in una normale matrice con una composizione molecolare, strutturale e proprietà meccaniche simili a quella del tessuto cardiaco Hydrogel cell delivery Cardiac tissue engineered patch Fornire alle cellule un supporto durante e dopo il rilascio al sito di interesse ne può promuovere la sopravvivenza, il differenziamento e la costituzione di connessioni funzionali con il tessuto ospite. Vunjak-Novakovic et al. / Tissue Engineering 2010

7 L ingegneria dei tessuti Un campo interdisciplinare che applica i principi dell ingegneria e delle scienze della vita allo sviluppo di sostituti biologici per il riparo, mantenimento, rigenerazione o miglioramento delle funzioni di un tessuto. R. Langer, 1980 Osteoblasti Condrociti Epatociti Cellule staminali Recupero delle cellule Impianto del tessuto biopsia Espansione Paziente Processo 3D In vitro IT Costrutto cellulare 3D Coltura cellulare in 2D Semina cellulare in 3D 6

8 L ingegneria dei tessuti "!La progettazione e lo sviluppo di biomateriali 3D con differenti geometrie e composizione chimica "!Lo sviluppo di sistemi di bioreattore per la coltura delle cellule multipotenti sui biomateriali sotto opportuni stimoli fisici e in condizioni sperimentali automatizzate, riproducibili e monitorabili!"#$%&'(&")*&+&,#'%-.&/%&0/1('23.

9 XVII Congresso Nazionale della SOCIETA ITALIANA DI RICERCHE CARDIOVASCOLARI (SIRC) L ingegneria dei tessuti "!La progettazione e lo sviluppo di biomateriali 3D con differenti geometrie e composizione chimica "!Lo sviluppo di sistemi di bioreattore per la coltura delle cellule multipotenti sui biomateriali sotto opportuni stimoli fisici e in condizioni sperimentali automatizzate, riproducibili e monitorabili!"#$%&'(&")*&+&,#'%-.&/%&0/1('23.

10 L ingegneria dei tessuti "!La progettazione e lo sviluppo di biomateriali 3D con differenti geometrie e composizione chimica Chung et al./ Adv. Drug Delivery Rev "!Lo sviluppo di sistemi di bioreattore per la coltura delle cellule multipotenti sui biomateriali sotto opportuni stimoli fisici e in condizioni sperimentali automatizzate, riproducibili e monitorabili!"#$%&'(&")*&+&,#'%-.&/%&0/1('23.

11 Ingegneria dei tessuti per il riparo del miocardio Accoppiamento elettromeccanico delle cellule con il miocardio ospite con attività contrattile sincrona Popolazione cellulare cardiaca fenotipicamente stabile immersa in una matrice simile a quella nativa Grandezza e spessore di misura clinicamente rilevante (necessità di vascolarizzazione) Tessuto cardiaco ingegnerizzato funzionale

12 Ingegneria dei tessuti per il riparo del miocardio Biomateriali Cellule Fattori di crescita K.L.Christman et al. / J.Am College of Cardiology (2006)

13 Ingegneria dei tessuti per il riparo del miocardio Cell sheet engineering Scaffold-free metodo per costruire tessuti a partire da cell sheet La tripsinizzazione distrugge sia la ECM che Ie proteine di legame cellula-cellula. Ricucendo la T, si ottengono fogli intatti di cellule con la ECM da loro depositata. T. Okano et al. / Biomaterials 2005

14 Ingegneria dei tessuti per il riparo del miocardio Cell sheet engineering TOP-DOWN BOTTOM-UP Masuda et al. / Adv. Drug Delivery Rev J. Yang et al. / Biomaterials 2005 ECM esogena ECM endogena

15 Ingegneria dei tessuti per il riparo del miocardio Cell sheet engineering

16 Ingegneria dei tessuti per il riparo del miocardio Cell sheet engineering

17 XVII Congresso Nazionale della SOCIETA ITALIANA DI RICERCHE CARDIOVASCOLARI (SIRC) Realizzazione di tessuti 3D attraverso µtp Aim: realizzazione in vitro di un costrutto tessutale 3-D inducendo l assemblaggio di precursori di tessuto micrometrici (µtps) Microcarriers cell sheet con supporto meccanico µtp Cellule Unità funzionale per la costruzione di tessuti 3D C.Palmiero, G. Imparato, F. Urciuolo, P.Netti / Acta Biomaterialia 2010 F.Urciuolo, G. Imparato et al. / Tissue Engineering 2010 Sinterizzazione biologica di µtp

18 Realizzazione di tessuti 3D attraverso µtp Microsfere porose di gelatina (materiale approvato dall FDA ) Le cellule aderiscono e crescono sulla superficie delle microsfere per formare un monostrato di cellule

19 Realizzazione di tessuti 3D attraverso µtp Microsfere porose di gelatina (materiale approvato dall FDA ) I µtp possono assemblare attraverso il layer di cellule ed ECM che li circondano e formare un costrutto tissutale 3D

20 Realizzazione di tessuti 3D attraverso µtp Derma like tissue µm mm µtp Tessuto 3D ECM è la colla che unisce i µtp C.Palmiero, G. Imparato, F. Urciuolo, P.Netti / Acta Biomaterialia 2010 F.Urciuolo, G. Imparato et al. / Tissue Engineering 2010 La forma finale del tessuto 3D dipende unicamente dalla camera di maturazione utilizzate per l assemblaggio dei µtp

21 XVII Congresso Nazionale della SOCIETA ITALIANA DI RICERCHE CARDIOVASCOLARI (SIRC) Realizzazione di tessuti 3D attraverso µtp Derma like tissue µm Organizzazione del tessuto C.Palmiero, G. Imparato, F. Urciuolo, P.Netti / Acta Biomaterialia 2010 F.Urciuolo, G. Imparato et al. / Tissue Engineering 2010 mm Tessuto 3D

22 Realizzazione di tessuti 3D attraverso µtp Microcarriers Differenti popolazioni cellulari Tessuti complessi possono essere ingegnerizzati assemblando µtp eterogenei

23 Rigenerazione di tessuti in situ attraverso µtp I µtp possono essere direttamente iniettati al sito di interesse Non è necessario conoscere dal principio la forma del sito danneggiato

24 Realizzazione di tessuti 3D attraverso µtp Cardiac like tissue Estrazione di cardiomiociti da cuori di ratto neonatale Digestione Collagenase type 37 C, 15 min!-actina sarcomerica Recupero surnatante (popolazione cellulare mista) Pre-piastramento Isolare cardiomiociti dai fibroblasti Centrifuga recupero del pellet cellulare Inattivazione dell enzima con NCS (New Born Calf Serium)

25 XVII Congresso Nazionale della SOCIETA ITALIANA DI RICERCHE CARDIOVASCOLARI (SIRC) Realizzazione di tessuti 3D attraverso µtp Cardiac like tissue Microsfere porose di gelatina (materiale approvato dall FDA ) + Cardiomiociti Battito dei cardiomiociti poche ore dopo la semina sulle microsfere

26 Rigenerazione del tessuto miocardico Rilascio multiplo crono-programmato di fattori di crescita In Aim: tutte investigare le situazioni l effetto di danno sull infarto tissutale la del presenza miocardio locale del di rilascio fattori di crescita capaci di istruire sia le cellule residenti nel tessuto che quelle trapiantate sequenziale ha di un VEGF ruolo e IGF-1 chiave da per microsfere il successo di del gelatina processo biodegradabili rigenerativo Microcarriers VEGF Microcarriers IGF µm Favorisce il processo di angiogenesi terapeutica, grazie al quale si assisterà allo sviluppo di nuovi vasi capaci di ossigenare zone colpite da ischemia. 50µm I cardiomiociti esistenti andranno incontro ad un processo di ipertrofia non patologica grazie al quale sarà possibile aumentare e sostenere la funzione meccanica svolta dal cuore. I microcarriers opportunamente ingegnerizzati:!rappresentano dei vettori ideali per il rilascio di fattori per un periodo prolungato di tempo!possono essere inserite nel sito di interesse mediante tecnologia iniettabile

27 Rigenerazione del tessuto miocardico Rilascio duale di IGF-1 e VEGF - esperimenti in vitro Fattore (VEGF o IGF-1) La soluzione acquosa contenente il VEGF viene assorbita per swelling delle microsfere, il rilascio in vitro è stato analizzato mediante saggio elisa. microsfere Cittadini et al. / Cardiovascular Research submitted

28 Rigenerazione del tessuto miocardico Rilascio duale di IGF-1 e VEGF - esperimenti in vitro Cinetica di rilascio in vitro Il burst iniziale di IGF-1 a 6 ore è seguito da un elevato rilascio durante i primi giorni mentre il rilascio di VEGF è più lento e sostenuto nel tempo. IGF-1 VEGF Inizialmente l IGF-1 esercita un potente effetto antiapoptotico, antinfiammatorio e di promozione della crescita che aiutano durante le prime ore successive alla legatura della coronaria, caratterizzate da processi di necrosi ed apoptotici. Il VEGF invece considerando la sua azione angiogenica non ha teoricamente bisogno di un iniziale massiccio rilascio locale ma piuttosto un lento e costante rilascio nel tempo. Cittadini et al. / Cardiovascular Research submitted

29 Rigenerazione del tessuto miocardico Rilascio duale di IGF-1 e VEGF esperimenti in vivo 1) 2) 3) 4)! Ratti maschi Sprague-Dawley del peso di g divisi in 4 gruppi:!!!! Ratti inoculati con microsfere nude; Ratti inoculati con microsfere caricate con IGF1; Ratti inoculati con microsfere caricate con VEGF; Ratti inoculati con microsfere caricate con IGF1 e microsfere caricate con VEGF.! I ratti sono stati anestetizzati con iniezione intraperitoneale di Zoletil 100 e trattamento sottocutaneo di Atropina! E stata eseguita una toracotomia anteriore (1)! Il cuore dei ratti è stato esposto e privato del pericardio (1)! L arteria coronarica discendente anteriore sinistra è stata legata con un filo di seta 6.0 in prossimità dell auricola sinistra per provocare l infarto acuto (2)! 10 min dopo l infarto, i ratti hanno ricevuto 10 microiniezioni da 10!l ciascuna nella parete anteriore del ventricolo sinistro intorno alla zona infartuata (3):! Il cuore dei ratti viene riposizionato nella cavità toracica (4) Cittadini et al. / Cardiovascular Research submitted

30 Rigenerazione del tessuto miocardico Rilascio duale di IGF-1 e VEGF Significativa riduzione dell infarct size nei gruppi VEGF e IGF-1+VEGF Significativo aumento dell aerea dei cardiomiociti in tutti i gruppi trattati comparati al gruppo MI (infartuati non trattati) 24 % 16 % L infart size è stato valutato attraverso colorazione delle sezione di cuore con picrosirius red Cittadini et al. / Cardiovascular Research submitted

31 Rigenerazione del tessuto miocardico Rilascio duale di IGF-1 e VEGF MI induce un diminuzione della densità capillare del 38% rispetto agli sham. Il rilascio di IGF-1 attenua questa diminuzione al 31%, quello di VEGF al 19%, il rilascio combinato al 16% Rispetto al gruppo MI, nei gruppi trattati con i fattori la densità capillare aumenta di 3 volte (gruppo IGF-1), di 13 volte (gruppo VEGF), di 15 volte (gruppo IGF+VEGF). Cittadini et al. / Cardiovascular Research submitted

32 Rigenerazione del tessuto miocardico Rilascio duale di IGF-1 e VEGF Dal momento che il VEGF potrebbe indurre la formazione di capillari non-maturi si è cercato di identificare il layer di SMC che generalmente circonda i capillari maturi. Il trattamento con IGF-1 ed in particolare con entrambi i fattori induce un marcato aumento della densità di cellule positive all "-actina. Negli animali trattati con VEGF l aumento dei vasi circondati da SMC è meno evidente. Sembra quindi che il VEGF abbia effetto sul numero assoluto di capillari mentre l IGF-1 contribuisce significativamente al processo di maturazione. Cittadini et al. / Cardiovascular Research submitted

33 Rigenerazione del tessuto miocardico Rilascio duale di IGF-1 e VEGF MI IGF-1 5.9±1 vs 72±9 Riduzione del 35% Riduzione del 17% Riduzione Del 58% IGF-1+VEGF VEGF Il gruppo sottoposto alla terapia combinata mostra i migliori risultati in termini di riduzione del processo apoptotico Cittadini et al. / Cardiovascular Research submitted

34 Rigenerazione del tessuto miocardico Rilascio duale di IGF-1 e VEGF MI Le azioni antiapoptodica e antirimodellamento dell IGF-1 sono IGF-1 potenziate dalla neoangiogenesi promossa dal VEGF risultante in una marcata riduzione dell infarct size associata con un ridotto volume del Riduzione Riduzione Riduzione LV, un miglioramento della funzione cardiaca, aumentata del 35% del 17% Del 58% vascolarizzazione 5.9±1 vs 72±9 e ridotta apoptosi e infiammazione. Gli effetti del trattamento combinato con i due fattori sono significativamente migliori IGF-1+VEGF di quelli del singolo fattore. VEGF Il gruppo sottoposto alla terapia combinata mostra i migliori risultati in termini di riduzione del processo apoptotico Cittadini et al. / Cardiovascular Research submitted

35 THANK YOU FOR YOUR KIND ATTENTION!!!!!! Prof. Paolo Netti e tutto il gruppo di ricerca del CRIB Prof. A.Cittadini e la Dott.ssa G.Monti della Facolcoltà di Medicina dell Università Federico II di Napoli