MODULISTICA. MODULO 1 - Dati generali. Il microambiente tumorale come bersaglio terapeutico. DURATA (in mesi, massimo 36) : /3/6/

Transcript

1 MODULO 1 MODULISTICA MODULO 1 - Dati generali TITOLO DEL PROGETTO (max 100 caratteri) Il microambiente tumorale come bersaglio terapeutico COSTO COMPLESSIVO DEL PROGETTO ,00 FINANZIAMENTO RICHIESTO AD ACC/ISS ,00 RISORSE PROPRIE ,00 COFINANZIAMENTI : ,00 (SPECIFICARE ENTE EROGATORE, DATA INIZIO DISPONIBILITÀ FONDI E RELATIVO IMPORTO) AIRC FINANZ (INT GIANNI) / / /_0_/_5_/_0_/_7_/ / /_7_/_1_/_6_/_0/_0 / ENTE EROGATORE GG MM AA IMPORTO _ AIRC FINANZ (INT COLOMBO) / /_0_/_5_/_0_/_7_/ / /_6/_0_/_0_/_0_/_0_/ ENTE EROGATORE GG MM AA IMPORTO _ AIRC FINANZ (INT TAGLIABUE) / /_0_/_5_/_0_/_7_/ / /_4_/_0_/_0_/0 /0_/ ENTE EROGATORE GG MM AA IMPORTO DURATA (in mesi, massimo 36) : /3/6/ I

2 MODULO 1 COORDINATORE DEL PROGETTO: nominativo: Prof. Alessandro M. Gianni struttura di appartenenza : Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori funzione: Vice Direttore Scientifico - Direttore di Struttura complessa Oncologia Medica 3 indirizzo: via G. Venezian 1, MILANO N. tel N. fax indirizzo alessandro.gianni@unimi.it DESTINATARIO ISTITUZIONALE PROPONENTE Destinatario Istituzionale: Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori Rappresentante legale: Prof. Stefano Zurrida* *Il Rappresentante Legale della Fondazione, Sig. Carlo Borsani, con documento n del 3 agosto 2006, ha delegato la sottoscrizione di atti di gestione che impegnano la Fondazione, al Direttore Generale, Prof. Stefano Zurrida. Responsabile Scientifico UO 1: Prof. Alessandro M. Gianni Gruppi di ricerca afferenti al DI (Dipartimento/Sezione e nominativo del Responsabile Scientifico) 1. Dipartimento di Medicina Oncologica - Sc. Oncologia Medica 3 - Prof. Alessandro Massimo Gianni 2. Dipartimento di Oncologia Sperimentale - S.s. Immunobiologia dei Tumori Umani Dott. Andrea Anichini 3. Dipartimento di Oncologia Sperimentale - S.s. Immunoterapia e Terapia Genica Dott. Mario P. Colombo 4. Dipartimento di Oncologia Sperimentale - S.c. Biologia Molecolare - Dott.ssa Elda Tagliabue Gruppi di ricerca afferenti ad altre Istituzioni di Ricerca (Istituzione e nominativi del Responsabile Scientifico e del Rappresentante Legale) DESTINATARI ISTITUZIONALI PARTECIPANTI Destinatario Istituzionale: Istituto Europeo di Oncologia Rappresentante legale: Dott. Carlo Ciani (Amministratore Delegato) Responsabile Scientifico UO 2: Prof. Pier Giuseppe Pelicci Gruppi di ricerca afferenti al DI (Dipartimento/Sezione e nominativo del Responsabile Scientifico) 1. Dipartimento di Oncologia Sperimentale - Prof. Pier Giuseppe Pelicci 2. Dipartimento di Oncologia Sperimentale - Dott.ssa Giuliana Pelicci 3. Dipartimento di Oncologia Sperimentale Dott. Bruno Amati Gruppi di ricerca afferenti ad altre Istituzioni di Ricerca (Istituzione e nominativi del Responsabile Scientifico e del Rappresentante Legale): 4. Istituto Superiore di Sanità Responsabile scientifico: Dott. Walter Malorni Rappresentante Legale: Prof. Enrico Garaci II

3 Destinatario Istituzionale: IRCCS Istituto Clinico Humanitas Humanitas Mirasole S.p.A. Rappresentante legale: Dott. Ivan Michele Colombo (Amministratore Delegato) Responsabile Scientifico UO 3: Dott.ssa Paola Allavena Gruppi di ricerca afferenti al DI (Dipartimento/Sezione e nominativo del Responsabile Scientifico): 1. Laboratorio di Immunologia e Infiammazione Dott.ssa Paola Allavena Gruppi di ricerca afferenti ad altre Istituzioni di Ricerca (Istituzione e nominativi del Responsabile Scientifico e del Rappresentante Legale) 2. Fondazione Centro San Raffale del Monte Tabor, Milano: Responsabile scientifico: Dott. Angelo Corti Rappresentante Legale: Dott. Renato Botti (Direttore Generale) III

4 MODULO 2 MODULO 2 - DESCRIZIONE DEL PROGETTO (SINTESI DELLE ATTIVITÀ DI TUTTE LE UNITÀ OPERATIVE) BASE DI PARTENZA E RAZIONALE (max 4000 caratteri) La terapia dei tumori, sviluppatasi a partire dagli anni 50, si basa quasi esclusivamente sull impiego di farmaci dotati di citotossicità diretta nei confronti della cellula tumorale. Questo approccio riflette largamente le modalità di screenig impiegate fino a pochi anni or sono nella ricerca di composti ad attività antitumorale, consistenti nel testare l attività antiproliferativa di un gran numero di composti empiricamente selezionati su linee cellulari coltivate in vitro. All opposto, in vivo la crescita tumorale è influenzata in modo determinante dalle cellule che costituiscono il microambiente tumorale. Lo stroma co-evolve con il tumore e concorre a formare un microambiente sfavorevole alle terapie sia dal punto di vista strutturale sia fornendo fattori di sopravvivenza. I principali attori cellulari del microambiente tumorale sono i fibroblasti dello stroma, le cellule del sistema immunitario sia innato che adattativo, e le cellule della rete vascolare e linfatica. A questi si associano i componenti della matrice extracellulare che hanno sia funzione strutturale che regolatoria. La maggiore comprensione della biologia della crescita tumorale in vivo, ed il riconoscimento del ruolo critico giocato dal microambiente, incoraggia oggi la ricerca di trattamenti in cui il bersaglio non sia la cellula tumorale, ma le cellule del microambiente con funzioni di supporto. Promettenti risultati clinici sono stati osservati in alcuni tumori umani con farmaci capaci di inibire le cellule endoteliali (talidomide nel mieloma, bevacizumab nei tumori epiteliali) o i B linfociti (rituximab nel linfoma di Hodgkin classico, CD20-negativo). Queste osservazioni, anche se preliminari e perfettibili, rappresentano un importante prova di principio a favore di strategie terapeutiche dirette contro il microambiente. Se combinate con la chemioterapia tradizionale possono potenziarne l efficacia favorendone l attività citotossica e/o la biodistribuzione del farmaco al tumore. OBIETTIVO PRINCIPALE E OBIETTIVI SECONDARI DEL PROGETTO (max 4000 caratteri) Obbiettivi generali 1) identificare nel microambiente tumorale nuovi bersagli terapeutici basandosi su modelli preclinici biologicamente ben caratterizzati; 2) identificare meccanismi responsabili di effetti biologici o efficacia terapeutica in studi clinici in cui l attività sul microambiente è ipotizzabile; 3) validare, in studi clinici di fase I/II, l effettivo targeting di cellule dello stroma e loro efficacia. Obbiettivi specifici principali 1) valutare l attività di un anticorpo anti-sparc (di topo > in topo) nel favorire l accesso al tumore di farmaci e anticorpi terapeutici; 2) confermare l esistenza della nicchia per la leucemia mieloide acuta e modularne l interazione con le cellule staminali leucemiche; 3) definire il ruolo di PTX-3 (una proteina solubile di fase acuta prodotta dai macrofagi) e dei macrofagi nel favorire la crescita tumorale dei sarcomi; 4) verificare in pazienti affetti da linfoma di Hodgkin l attività antilinfomatosa di farmaci diretti contro cellule del microambiente (in particolare T-linfociti CD4-positivi); 5) verificare l attività antitumorale di farmaci dotati di attività inibitoria sull autofagia, un processo cellulare inflenzato dal microambiente e responsabile di resistenza ai farmaci antitumorali. IV

5 METODOLOGIA (max 8000 caratteri) I carcinomi della mammella sono eterogenei per l espressione dei geni che codificano molecole della matrice extracellulare, e possono essere suddivisi, in base a questo parametro, in tre sottogruppi. Verrà studiata la risposta alla chemioterapia in tumori rappresentativi dei tre sottogruppi, ed in particolare il ruolo di SPARC su malignità e resistenza ai farmaci in topi geneticamente modificati per avere differenti tipi di stroma. Un anticorpo monoclonale anti-sparc da noi prodotto testerà se il blocco funzionale di SPARC favorisce l accesso al tumore dei farmaci. Farà seguito la costruzione di Ab umani da librerie fagiche per test in topi umanizzati e nel paziente. L aminopeptidase N (CD13) è selettivamente espressa sui vasi tumorali e un suo ligando peptidico NGR è già utilizzato per veicolare TNFa al tumore in studi clinici di fase II. Frammenti di fibronectina contenenti isodrg (NGR deaminato) hanno attività antitumorale. Inoltre, un frammento della cromogranina A (vasostatina) inibisce l angiogenesi indotta da VEGF. Proponiamo di creare proteine di fusione tra NGR/vasostatina o isodrg/vasostaina, e di validarne l attività biologica in modelli animali. Trabercetidin (Yondelis/ET-743) è un prodotto naturale inibitore di CCL2 e con spiccata citotossicità per i macrofagi, cellule stromali con attivià trofica per il tumore. Precedenti dati in vitro hanno dimostrato che il trattamento con trabectedin riduce in modo drastico la produzione di PTX3. Ci proponiamo: i) di misurare i livelli circolanti di PTX3 nei pazienti con sarcomi prima e dopo successivi trattamenti con trabectedin,; ii) di definire il ruolo di PTX-3 nella biologia dei sarcomi (in particolare liposarcomi mixoidi), utilizzando linee cellulari e silenziando il gene con sirna specifici; iii) di analizzare l espressione genica globale con tecnologia Affymetrix dell effetto di trabectedin sulle cellule di sarcoma, con riguardo a fattori dell angiogenesi e chemiotattici; iv) di valutare l ipotesi che i macrofagi tumore-associati abbiamo un ruolo favorente la progressione del tumore e che la terapia con Trabectedin agisca sia a livello del tumore che sulle cellule dell infiltrato. Per studiare se e come la nicchia ematopoietica favorisca il mantenimento del clone leucemico, inoculeremo topi singenici con cellule leucemiche GFP-positive e ne analizzeremo l homing tra gli osteoblasti dell osso. L analisi delle molecole di adesione e i segnali di transduzione coinvolti nel processo identificheranno potenziali bersagli atti a neutralizzare l effetto nicchia per il clone leucemico. Per ridurre l effetto di autofagia (resistenza intrinsica alla chemioterapia) si valuterà come condizioni metaboliche diverse modulano geni/proteine di apoptosi e autofagia (ATG5, ATG6, ATG8) in vitro ed ex-vivo su biopsie derivate da tumori resistenti e non alla chemioterapia. Si valuterà se inibitori della diidrofolato reduttasi a basse dosi revertono il fenomeno. Lo studio sul ruolo dei linfociti (ed in particolare dei linfociti CD4+) nella risposta alla chemioterapia del linfoma di Hodgkin comprende una parte clinica e una biologica. Lo studio clinico prevede il trattamento di pazienti pluri-recidivati o refrattari con farmaci ad azione mirata su cellule del microambiente. In particolare, dovrebbe essere dispponbile un anticorpo monoclonale (zanolimumab) citotossico nei confronti del T-linfociti CD4+. Questi linfociti costitutiscono oltre il 90% delle cellule del tessuto tumorale, e si ritiene che svolgano un attività trofica a favore delle cellule di Hodgkin-Reed Sterbenrg (HRS). Parte integrante dello studio clinico sarà uno studio biologico delle cellule HRS, del microambiente linfonodale e delle sottopopolazioni linfocitarie nel sangue circolante. RISULTATI ATTESI (max 4000 caratteri) V

6 1) definizione del ruolo di SPARC in tumori sperimentali del topo, e costruzione di anticorpi umani da librerie fagiche (studio preclinico); 2) controllare in modelli animali la crescita delle cellule della leucemia mieloide acuta attraverso una modulazione della nicchia emopoietica (studio preclinico); 3) generazione di proteine di fusione tra NGR/vasostaina e isodrg/vasostatina, e valutazione di una loro attività antitumorale in modelli animali (studio preclinico); 4) definire se l attività antitumorale del farmaco trabercetidin nei sarcomi umani è mediata dalla riduzione dell attività trofica dei macrofagi tumore-associati (studio clinico); 5) definire se inibitori inibitori della diidrofolato reduttasi a basse dosi revertono il fenomeno della autofagia (studio clinico); 6) definire l attività antilinfomatosa di farmaci, come l anticorpo monoclonale anti-cd4 zanolimumab, diretti contro cellule del microambiente del linfoma di Hodgkin (studio clinico) VI

7 MODULO 2 COMPOSIZIONE DEL COSTO COMPLESSIVO DEL PROGETTO Voci di costo e breve descrizione Totale di cui a carico dei fondi ministeriali 1. Personale dipendente ,00 NULLA 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio , ,00 3. Missioni , ,00 4. Materiale di Consumo , ,00 5. Pubblicazioni/ organizzazione convegni, ecc , ,00 6. Elaborazione dati (specificare) , ,00 7. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) , ,00 TOTALE , ,00 VII

8 MODULO 2 Curriculum Vitae del Coordinatore del progetto (max 2 pagine) ( INDICARE ANCHE LE 10 PUBBLICAZIONI SCIENTIFICHE RITENUTE PIÙ SIGNIFICATIVE, CON PARTICOLARE RIFERIMENTO A QUELLE DELL AREA TEMATICA SCIENTIFICA SULLA QUALE INSISTE IL PROGETTO) Curriculum Vitae Prof. Alessandro Massimo Gianni PERSONAL DATA Birthdate December 12, 1943 Birthplace Castelvetro (Modena), Italy Citizenship Italian Home Address Via L. Muratori 29, 20135, Milano, Italy Business Address Istituto Nazionale Tumori, Reparto T.M.O., Via Venezian 1, Milano, Italy Telephone Home (02) ; business (02) EDUCATION 1962 Graduated Liceo Classico Alessandro Manzoni, Milan 1968 Medical Doctor, Magna cum laude University of Milan TRAINING Residency in Internal Medicine Institute of Internal Medicine I - University of Milan Residency in Internal Medicine Institute of Clinical Semeiotics University of Milan Fellow of the Ministero della Pubblica Istruzione Institute of General Pathology University of Milan 1972 Specialization in Internal Medicine, Magna cum laude -University of Milan NATO-CNR Fellow Institute of Molecular Virology (Director: Dr. M. Green) St.Louis University School of Medicine 1983 Residency (one month) Bone Marrow Translplantation Unit (Dr. U.Schaefer) University of Essen (West Germany) 1983 Residency (two months) Bone Marroiw Transplantation Unit (Dr. D. Thomas) Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle, Wa USA APPOINTMENTS Assistant Professor Institute of General Pathology University of Milan 1973 Teaching Professor (Professore Incaricato) Institute of General Pathology University of Milan Research Associate Center for Cancer Research Massachussetts Institute of Technology Assistant Professor Institute of Internal Medicine University of Milan Associate Professor in Clinical Therapeutics University of Milan 1983 Director Bone Marrow Transplant Unit Milan Cancer Institute 1992 Associate Professor in Medical Oncology University of Milan 1992 Director Division of Medical Oncology C and BMT Unit Milan Cancer Institute 1994 Teaching Professor Research Doctorate in Experimental Hematology University of Milan Interim Director Division of Medical Oncology A Milan Cancer Institute 1998 Interim Director Division of Medical Oncology A Milan Cancer Institute 1998 Full Professor Chair of Medical Oncology University of Turin 1998-present Director Division of Medical Oncology C (II Level Operative Unit) Department of Medical Oncology Milan Cancer Institute 1998-present Director Chair of Medical Oncology University of Milan 2004 Director Leukemia and Lymphoma Department Milan Cancer Institute 2007 Scientific Vice-Director, Foundation IRCCS National Cancer Institute, Milan RESEARCH FIELDS 1. Molecular basis of thalassemia 1.1 Molecular defects of ß-thalassemia and HPFH 1.2 Translational regulation of globin chain synthesis 1.3 Molecular diagnosis of thalassemias 1.4 Mechanisms of HbFHbA switching VIII

9 1.5 Analysis of hemoglobin synthesis in in vitro erythroid colonies (BFU-E) 2. Retroviral oncogenesis 2.1 Molecular steps in the life-cycle of Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV) 2.1 Biological activity (transfection) of reverse-transcribed MMLV nucleic acids 3. High-dose chemotherapy in the treatment of human malignancies 3.1 Clinical protocols for high-dose therapy of human chemosensitive tumors 3.2 Clinical use of peripheral blood progenitor cells following submyeloablative therapy 4. Clinical use of growth factors 4.1 Use of growth factors to reduce hematological toxicity of high-dose chemotherapy 4.2 Use of growth factors to expand/mobilize hematopoietic progenitor cells 5. Gene transfer into human hematopoietic progenitor cells 5.1 Development of new retroviral vectors for gene therapy of cancer 5.2 Use of hematopoietic progenitor cells as target of gene transfer through retroviral vectors TEN MOST SIGNIFICANT PUBLICATIONS GIANNI A M, GIGLIONI B, OTTOLENGHI S, COMI P & GUIDOTTI G G. Globin - chain synthesis by 'supernatant' 10S RNA from rabbit reticulocytes. Nature New Biol, 240, 183-5,1972. GIGLIONI B, GIANNI A M, COMI P, OTTOLENGHI S & RUNGGER D. Translational control of globin synthesis by haemin in Xenopus oocytes. Nature, 246, ,1973. GIANNI A M & WEINBERG R A. Partially single-stranded form of free Moloney viral DNA. Nature, 255, , SMOTKIN D, GIANNI A M, ROZENBLATT S & WEINBERG R A. Infectious viral DNA of murine leukemia virus. Proc Natn Acad Sci USA, 72, , GIANNI A M, HUTTON J, SMOTKIN & WEINBERG R A. Proviral DNA of Moloney leukemia virus: purification and visualization. Science, 191, , GIANNI AM, SIENA S, BREGNI M, TARELLA C, STERN A, PILERI A & BONADONNA G. Granulocytemacrophage colony stimulating factor to harvest circulating haemopoietic stem cells for autotransplantation. Lancet ii, , SIENA S, DI NICOLA M, BREGNI M, MORTARINI R, ANICHINI A, LOMBARDI L, RAVAGNANI F, PARMIANI G & GIANNI AM. Massive ex-vivo generation of functional dendritic cells from mobilized CD34+ peripheral blood progenitors - A protocol suitable for anticancer therapy. Exp Hematol, 23, , GIANNI AM, BREGNI M, SIENA S, BRAMBILLA C, DI NICOLA M, LOMBARDI F, GANDOOLA L, TARELLA C, PILERI A, RAVAGNANI F, VALAGUSSA P & BONADONNA G (other authors: STERN A, MAGNI M, CARACCIOLO D). High-dose chemotherapy and autologous bone marrow transplantation compared with MACOP-B in aggressive B-cell lymphoma. New Engl J Med 336, , A M GIANNI, M MAGNI, M MARTELLI, M DI NICOLA, C CARLO-STELLA, S PILOTTI, A RAMBALDI, S CORTELAZZO, C PATTI, G PARVIS, F BENEDETTI, S CAPRIA, P CORRADINI, C TARELLA, T BARBUI. Long-term remission in mantle-cell lymphoma following high-dose sequential chemotherapy and in vivo rituximab-purged stem cell autografting (R-HDS regimen). Blood 102, , A M GIANNI, M MAGNI, M MARTELLI, M DI NICOLA, C CARLO-STELLA, S PILOTTI, A RAMBALDI, S CORTELAZZO, C PATTI, G PARVIS, F BENEDETTI, S CAPRIA, P CORRADINI, C TARELLA, T BARBUI. Long-term remission in mantle-cell lymphoma following high-dose sequential chemotherapy and in vivo rituximab-purged stem cell autografting (R-HDS regimen). Blood 102, , IX

10 MODULO 3 MODULO 3: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUNA UNITÀ OPERATIVA (Compilare un modulo per ciascuna UO) UNITÀ OPERATIVA N. 1 Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Alessandro Massimo Gianni struttura di appartenenza : Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori - funzione: Vice Direttore Scientifico, Direttore SC Oncologia Medica 3 indirizzo : via G. Venezian, Milano N. tel: N. fax: indirizzo alessandro.gianni@unimi.it RAPPRESENTANTE LEGALE: nominativo: Prof. Stefano Zurrida * *Il Rappresentante Legale della Fondazione, Sig. Carlo Borsani, con documento n del 3 agosto 2006, ha delegato la sottoscrizione di atti di gestione che impegnano la Fondazione, al Direttore Generale, Prof. Stefano Zurrida. CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 2000 caratteri) Studi clinici di fase I/II Nel linfoma di Hodgkin (HL), le cellule reattive del microambiente tumorale costituiscono un potenziale bersaglio terapeutico grazie all espressione di specifici marcatori riconosciuti da anticorpi monoclonali (anti-cd4, Zanolimumab; anti-cd52, Alemtuzumab; o anti-hla-dr, 1D09C3) o dall inibitore di Raf, Sorafenib. Verranno eseguiti studi clinici che arruoleranno coorti successive di pazienti affetti da HL recidivato o refrattario da sottoporre a chemioterapia di salvataggio associata ad uno specifico anticorpo monoclonale o all inibitore di Raf, Sorafenib. Obiettivi di questi studi clinici sono: (1) valutare la risposta clinica; (2) confrontare il profilo di espressione genica delle cellule HRS prima e dopo trattamento. [Task svolta da Gruppo #1] Studi immunologici Verranno caratterizzate le sottopopolazioni linfocitarie presenti nel tessuto neoplastico e nel sangue periferico di pazienti affetti da HL e arruolati in studi clinici con anticorpi moclonali (Zanolizumab, Alemtuzumab, 1D09C3). In campioni tissutali isolati prima e durante la terapia si valuterà fenotipo, stadio differenziativo e funzione delle principali sottopopolazioni di cellule T. [Task svolta da Gruppo #2] Studi preclinici Verranno eseguiti studi preclinici in modelli murini di xenotrapianto di HL per valutare l efficacia terapeutica di anticorpi e inibitori chinasici usati in combinazione allo scopo di ottimizzare modalità di trattamento da testare in futuri studi clinici. [Task svolta da Gruppo #1] Verrà studiato il ruolo di SPARC prodotto dal tumore e dallo stroma su malignità e resistenza ai farmaci in topi geneticamente modificati che sviluppano tumori mammari spontanei con differenti tipi di stroma. Si costruiranno anticorpi umani anti- SPARC isolando le sequenze variabili da librerie fagiche per poterli utilizzare sia in topi umanizzati che nel paziente. [Task svolta da Gruppo #3] Verrà definita la biologia del microambiente del carcinoma della mammella e il suo coinvolgimento nell evoluzione e/o risposta alla terapia. Inoltre, attraverso l utilizzo di anticorpi precedentemente prodotti, si valuterà l efficacia del targeting del microambiente nella risposta delle cellule di carcinoma mammario sia ai farmaci convenzionali che a quelli bersaglio specifici. [Task svolta da Gruppo #4] X

11 METODOLOGIA (max 4000 caratteri) Studi clinici di fase I/II - Verranno eseguiti studi clinici che arruoleranno coorti successive di pazienti affetti da HL recidivato o refrattario da sottoporre a chemioterapia di salvataggio associata ad uno specifico anticorpo monoclonale (Zanolimumab, Alemtuzumab, o 1D09C3) o a Sorafenib. Saranno eleggibili per questi studi pazienti con HL ricaduti dopo una seconda remissione completa o resistenti a una seconda linea di chemioterapia. Ciascuno studio si articolerà in due parti. La prima parte (settimane 1 3) serve a definire l attività di ciascun anticorpo monoclonale o di Sorafenib somministrati come agenti singoli. La seconda parte (settimane 4 16) prevede la somministrazione dell anticorpo in studio associata a 4 cicli mensili di IGeV o DHAP, ovvero 4 mesi di trattamento con Sorafenib associato a 4 cicli mensili di IGeV o DHAP. Alla fine del trattamento, i pazienti verranno valutati per la risposta. OBIETTIVO PRINCIPALE: documentare, in coorti successive di pazienti con HL ricaduto/refrattario, la risposta clinica e strumentale al trattamento con l anticorpo in studio o Sorafenib come agenti singoli e in combinazione a chemioterapia di terza linea. OBIETTIVO SECONDARIO: studiare in un sottogruppo di pazienti consenzienti il profilo di espressione genica delle cellule HRS prima e dopo trattamento con l anticorpo in studio o Sorafenib come agenti singoli. Studi immunologici - Linfociti verranno isolati dal sangue periferico o da linfonodi dei pazienti. Il fenotipo verrà valutato tramite citofluorimetria multiparametrica. Verranno identificati: a) principali subsets T, compreso le cellule CD4 +, CD8 +, Treg, Tr1; b) stadio differenziativo dei principali subsets T, tramite colorazione per CD45RA, CCR7, CD28, e fattori citolitici granzyme B e perforina; c) profilo funzionale delle cellule T (TH1/TH2 e Tc1/Tc2) tramite espressione di citochine intracellulari (IFN-gamma e IL-4) in risposta a mitogeni o mab anti-cd3; d) presenza e funzione di cellule T EBV-specifiche (in pazienti HLA-A* ) tramite: 1) analisi citofluorimetrica con tetrameri HLA contenenti peptidi immunogenici codificati dai geni virali EBNA3 e LMP2; 2) saggio ELISPOT per la produzione di citochine in risposta a peptidi codificati da EBV. Studi preclinici Verranno eseguiti studi preclinici in modelli murini di xenotrapianto di HL con l obiettivo di valutare l efficacia di anticorpi monoclonali e inibitori chinasici usati in combinazione allo scopo di ottimizzare modalità di trattamento che potranno in una fase successiva essere testate in studi clinici. Per studiare il ruolo di SPARC verranno usati topi che sviluppano tumori mammari spontanei resi o meno deficienti per SPARC, mentre per differenziare SPARC prodotto dal tumore e dallo stroma utilizzeremo chimere trapiantate con il midollo osseo di topi SPARC competenti o deficienti. Gli animali saranno trattati mediante chemioterapia (Doxorubicina) o immunoterapia (anti-her-2) in presenza o meno di inibizione di SPARC con l anticorpo monoclonale da noi isolato. Verrà valutata la crescita tumorale e sarà analizzata la componente stromale mediante immunoistochimica per verificare che l inibizione di SPARC moduli l efficacia della terapia antitumorale. Validata l efficacia adiuvante dell anticorpo anti-sparc, si procederà ad isolare una anticorpo uguale da una libreria fagica di cdna umano. Attraverso manipolazione genetica verranno generate linee di carcinoma della mammella capaci di produrre diversi tipi di matrice extracellulare. Queste linee cellulari verranno saggiate sia in vitro che in vivo per la loro sensibilità ai chemioterapici (doxorubicina e taxolo), a inibitori delle tirosino-chinasi (Gefitinib e Lapatinib) e all anticorpo monoclonale Trastuzumab. Si verificherà se la resistenza ai trattamenti dipenda dalla modificazione da parte delle cellule tumorali e/o del microambiente in cui il tumore si sta sviluppando. Infine, mediante metodologie di biologia molecolare (RT-PCR e DASL), e/o immunoistochimica, carcinomi umani della mammella di pazienti sottoposte a terapia neoadiuvante verranno classificati in base al profilo di espressione dei geni deputati alla formazione della matrice e risultati importanti nella progressione e/o risposta alla terapia negli studi effettuati sui modelli sperimentali. I dati ottenuti verranno poi confrontati con la risposta delle pazienti ai trattamenti neoadiuvanti. Infine, verranno effettuati nei modelli sperimentali saggi di sensibilità ai farmaci in presenza di anticorpi specifici per i componenti del microambiente. XI

12 MODULO 3 COMPOSIZIONE DEL COSTO DELL UNITÀ OPERATIVA Voci di costo e breve descrizione Totale di cui a carico dei fondi ministeriali 1. Personale dipendente ,00 NULLA 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio , ,00 3. Missioni , ,00 4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): Materiale di consumo , ,00 _ 6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc , ,00 7. Elaborazione dati (specificare) , ,00 8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) , ,00 TOTALE , ,00 XII

13 MODULO 3 Curriculum Vitae del Responsabile Scientifico dell Unità Operativa (max 1 pagina) (PERIODO DI RIFERIMENTO: ULTIMI 5 ANNI; INDICARE ANCHE LE 10 PUBBLICAZIONI SCIENTIFICHE RITENUTE PIÙ SIGNIFICATIVE, CON PARTICOLARE RIFERIMENTO A QUELLE DELL AREA TEMATICA SCIENTIFICA SULLA QUALE INSISTE IL PROGETTO) Curriculum Vitae Prof. Alessandro Massimo Gianni PERSONAL DATA Birthdate December 12, 1943 Birthplace Castelvetro (Modena), Italy Citizenship Italian Home Address Via L. Muratori 29, 20135, Milano, Italy Business Address Istituto Nazionale Tumori, Reparto T.M.O., Via Venezian 1, Milano, Italy Telephone Home (02) ; business (02) EDUCATION 1962 Graduated Liceo Classico Alessandro Manzoni, Milan 1968 Medical Doctor, Magna cum laude University of Milan TRAINING Residency in Internal Medicine Institute of Internal Medicine I - University of Milan Residency in Internal Medicine Institute of Clinical Semeiotics University of Milan Fellow of the Ministero della Pubblica Istruzione Institute of General Pathology University of Milan 1972 Specialization in Internal Medicine, Magna cum laude -University of Milan NATO-CNR Fellow Institute of Molecular Virology (Director: Dr. M. Green) St.Louis University School of Medicine 1983 Residency (one month) Bone Marrow Translplantation Unit (Dr. U.Schaefer) University of Essen (West Germany) 1983 Residency (two months) Bone Marroiw Transplantation Unit (Dr. D. Thomas) Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle, Wa USA APPOINTMENTS Assistant Professor Institute of General Pathology University of Milan 1973 Teaching Professor (Professore Incaricato) Institute of General Pathology University of Milan Research Associate Center for Cancer Research Massachussetts Institute of Technology Assistant Professor Institute of Internal Medicine University of Milan Associate Professor in Clinical Therapeutics University of Milan 1983 Director Bone Marrow Transplant Unit Milan Cancer Institute 1992 Associate Professor in Medical Oncology University of Milan 1992 Director Division of Medical Oncology C and BMT Unit Milan Cancer Institute 1994 Teaching Professor Research Doctorate in Experimental Hematology University of Milan Interim Director Division of Medical Oncology A Milan Cancer Institute 1998 Interim Director Division of Medical Oncology A Milan Cancer Institute 1998 Full Professor Chair of Medical Oncology University of Turin 1998-present Director Division of Medical Oncology C (II Level Operative Unit) Department of Medical Oncology Milan Cancer Institute 1998-present Director Chair of Medical Oncology University of Milan 2004 Director Leukemia and Lymphoma Department Milan Cancer Institute 2007 Scientific Vice-Director, Foundation IRCCS National Cancer Institute, Milan RESEARCH FIELDS 1. Molecular basis of thalassemia 1.1 Molecular defects of ß-thalassemia and HPFH 1.2 Translational regulation of globin chain synthesis 1.3 Molecular diagnosis of thalassemias XIII

14 1.4 Mechanisms of HbFHbA switching 1.5 Analysis of hemoglobin synthesis in in vitro erythroid colonies (BFU-E) 2. Retroviral oncogenesis 2.1 Molecular steps in the life-cycle of Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV) 2.1 Biological activity (transfection) of reverse-transcribed MMLV nucleic acids 3. High-dose chemotherapy in the treatment of human malignancies 3.1 Clinical protocols for high-dose therapy of human chemosensitive tumors 3.2 Clinical use of peripheral blood progenitor cells following submyeloablative therapy 4. Clinical use of growth factors 4.1 Use of growth factors to reduce hematological toxicity of high-dose chemotherapy 4.2 Use of growth factors to expand/mobilize hematopoietic progenitor cells 5. Gene transfer into human hematopoietic progenitor cells 5.1 Development of new retroviral vectors for gene therapy of cancer 5.2 Use of hematopoietic progenitor cells as target of gene transfer through retroviral vectors TEN MOST SIGNIFICANT PUBLICATIONS GIANNI A M, GIGLIONI B, OTTOLENGHI S, COMI P & GUIDOTTI G G. Globin - chain synthesis by 'supernatant' 10S RNA from rabbit reticulocytes. Nature New Biol, 240, 183-5,1972. GIGLIONI B, GIANNI A M, COMI P, OTTOLENGHI S & RUNGGER D. Translational control of globin synthesis by haemin in Xenopus oocytes. Nature, 246, ,1973. GIANNI A M & WEINBERG R A. Partially single-stranded form of free Moloney viral DNA. Nature, 255, , SMOTKIN D, GIANNI A M, ROZENBLATT S & WEINBERG R A. Infectious viral DNA of murine leukemia virus. Proc Natn Acad Sci USA, 72, , GIANNI A M, HUTTON J, SMOTKIN & WEINBERG R A. Proviral DNA of Moloney leukemia virus: purification and visualization. Science, 191, , GIANNI AM, SIENA S, BREGNI M, TARELLA C, STERN A, PILERI A & BONADONNA G. Granulocytemacrophage colony stimulating factor to harvest circulating haemopoietic stem cells for autotransplantation. Lancet ii, , SIENA S, DI NICOLA M, BREGNI M, MORTARINI R, ANICHINI A, LOMBARDI L, RAVAGNANI F, PARMIANI G & GIANNI AM. Massive ex-vivo generation of functional dendritic cells from mobilized CD34+ peripheral blood progenitors - A protocol suitable for anticancer therapy. Exp Hematol, 23, , GIANNI AM, BREGNI M, SIENA S, BRAMBILLA C, DI NICOLA M, LOMBARDI F, GANDOOLA L, TARELLA C, PILERI A, RAVAGNANI F, VALAGUSSA P & BONADONNA G (other authors: STERN A, MAGNI M, CARACCIOLO D). High-dose chemotherapy and autologous bone marrow transplantation compared with MACOP-B in aggressive B-cell lymphoma. New Engl J Med 336, , A M GIANNI, M MAGNI, M MARTELLI, M DI NICOLA, C CARLO-STELLA, S PILOTTI, A RAMBALDI, S CORTELAZZO, C PATTI, G PARVIS, F BENEDETTI, S CAPRIA, P CORRADINI, C TARELLA, T BARBUI. Long-term remission in mantle-cell lymphoma following high-dose sequential chemotherapy and in vivo rituximab-purged stem cell autografting (R-HDS regimen). Blood 102, , A M GIANNI, M MAGNI, M MARTELLI, M DI NICOLA, C CARLO-STELLA, S PILOTTI, A RAMBALDI, S CORTELAZZO, C PATTI, G PARVIS, F BENEDETTI, S CAPRIA, P CORRADINI, C TARELLA, T BARBUI. Long-term remission in mantle-cell lymphoma following high-dose sequential chemotherapy and in vivo rituximab-purged stem cell autografting (R-HDS regimen). Blood 102, , XIV

15 MODULO 3BIS MODULO 3BIS: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA (Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti) GRUPPO DI RICERCA: 1 - SC Oncologia Medica 3 (INT-MI) RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Alessandro Massimo Gianni struttura di appartenenza : Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori funzione: Vice Direttore Scientifico Direttore SC Oncologia Medica 3 indirizzo : Via G. Venezian Milano N. tel: N. fax: indirizzo alessandro.gianni@unimi.it RAPPRESENTANTE LEGALE: nominativo: Prof. Stefano Zurrida* *Il Rappresentante Legale della Fondazione, Sig. Carlo Borsani, con documento n del 3 agosto 2006, ha delegato la sottoscrizione di atti di gestione che impegnano la Fondazione, al Direttore Generale, Prof. Stefano Zurrida. CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) Verranno eseguiti studi clinici in pazienti con linfoma di Hodgkin (HL) recidivato o refrattario da sottoporre a chemioterapia di salvataggio associata ad uno specifico anticorpo monoclonale [anti-cd4, Zanolizumab; anti-cd52, Alemtuzumab; anti- HLA-DR, 1D09C3] o all inibitore di Raf, Sorafenib. Obiettivi di questi studi clinici sono: (1) valutare la risposta clinica; (2) confrontare il profilo di espressione genica delle cellule di Hodgkin/Reed-Sternberg prima e dopo trattamento. Inoltre, in modelli preclinici valuteremo l efficacia terapeutica combinata di anticorpi e inibitori di Raf. METODOLOGIA (max 1000 caratteri) Saranno eleggibili per gli studi clinici coorti successive di pazienti con HL ricaduti dopo seconda remissione completa o resistenti a chemioterapia di seconda linea. Ciascuno studio si articolerà in due parti. La prima parte (settimane 1 3) serve a definire l attività di ciascun anticorpo (Zanolizumab, Alemtuzumab, 1D09C3) o di Sorafenib somministrati come agenti singoli. Nella seconda parte (settimane 4 16), i pazienti riceveranno l anticorpo in studio o Sorafenib combinati a 4 cicli mensili di IGeV o DHAP. OBIETTIVO PRINCIPALE: documentare la risposta clinica e strumentale al trattamento con l anticorpo in studio o Sorafenib come agenti singoli o in combinazione a chemioterapia. OBIETTIVO SECONDARIO: studiare il profilo di espressione genica delle cellule HRS prima e dopo trattamento con l anticorpo in studio o Sorafenib. Inoltre, in modelli preclinici di xenotrapianto di HL studieremo l efficacia terapeutica combinata di anticorpi monoclonali e inibitori di Raf allo scopo di ottimizzare modalità di trattamento da testare in futuri studi clinici. XV

16 MODULO 3BIS COMPOSIZIONE DEL COSTO DEL GRUPPO DI RICERCA Voci di costo e breve descrizione Totale di cui a carico dei fondi ministeriali 1. Personale dipendente ,00 NULLA 3 medici 3 tecnici 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio , ,00 1 contratto triennale 3. Missioni , ,00 4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): 0,00 0,00 5. Materiale di consumo , ,00 Anticorpi monoclonali Reagenti per IHC Reagenti per apoptosi Reagenti per GEP Topi NOD/SCID 6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc , ,00 7. Elaborazione dati (specificare) , ,00 elaborazione statistica ed analisi di dati degli studi clinici 8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) , ,00 segreteria amministrativa e scientifica data management TOTALE , ,00 XVI

17 MODULO 3BIS MODULO 3BIS: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA (Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti) GRUPPO DI RICERCA: 2 - S.s. Immunobiologia dei Tumori Umani Dip. di Oncologia Sperimentale (INT-MI) RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Dott. Andrea Anichini struttura di appartenenza : Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, Milano funzione: Responsabile di S.S. indirizzo : Via G. Venezian 1, Milano N. tel: N. fax: indirizzo andrea.anichini@istitutotumori.mi.it RAPPRESENTANTE LEGALE: nominativo: Prof. Stefano Zurrida* *Il Rappresentante Legale della Fondazione, Sig. Carlo Borsani, con documento n del 3 agosto 2006, ha delegato la sottoscrizione di atti di gestione che impegnano la Fondazione, al Direttore Generale, Prof. Stefano Zurrida. CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) Il contributo del gruppo di ricerca sarà volto a caratterizzare le sottopopolazioni linfocitarie presenti nel tessuto neoplastico e nel sangue periferico di pazienti affetti da linfoma di Hodgkin e arruolati in studi clinici con anticorpi zanolimumab (anti- CD4), o alemtuzumab (anti-cd52) o anti-hla-dr (1D09C3). In campioni tissutali isolati prima e durante la terapia si valuterà fenotipo, stadio differenziativo e funzione delle principali sottopopolazioni di cellule T, incluse le cellule CD4, CD8, Treg, Tr1, TH1 e TH2, Tc1 e Tc2 e la presenza e funzione di cellule T EBV-specifiche. METODOLOGIA (max 1000 caratteri). Linfociti verranno isolati dal sangue periferico o da linfonodi dei pazienti. Il fenotipo delle principali sottopopolazioni linfocitarie verrà valutato tramite citofluorimetria multiparametrica. Si utilizzerà l immunocolorazione con differenti combinazioni di anticorpi monoclonali per identificare: a) principali subsets T, compreso le cellule CD4 +, CD8 +, Treg, Tr1; b) lo stadio differenziativo dei principali subsets T, dal fenotipo naive a quello effettore e memoria, tramite colorazione per CD45RA, CCR7, CD28, e fattori citolitici granzyme B e perforina; c) il profilo funzionale delle cellule T (TH1/TH2 e Tc1/Tc2) tramite analisi di espressione di citochine intracellulari (quali IFN-gamma e IL-4) in risposta a mitogeni o mab anti- CD3; d) presenza e funzione di cellule T EBV-specifiche (in pazienti HLA-A* ) tramite: 1) analisi citofluorimetrica con tetrameri HLA contenenti peptidi immunogenici codificati dai geni virali EBNA3 e LMP2; 2) saggio ELISPOT per la produzione di citochine in risposta a peptidi codificati da EBV. XVII

18 MODULO 3BIS COMPOSIZIONE DEL COSTO DEL GRUPPO DI RICERCA Voci di costo e breve descrizione Totale di cui a carico dei fondi ministeriali 1. Personale dipendente ,00 NULLA Responsabile del gruppo di ricerca Dirigente biologo tecnico di laboratorio tecnico di laboratorio 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio , ,00 3. Missioni 6.000, ,00 _ 4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): Nulla Nulla 5. Materiale di consumo , ,00 _Terreni di coltura e siero fetale Materiale sterile per colture cellulari Anticorpi monoclonali Tetrameri HLA Reagenti per ELISPOT Peptidi sintetici 6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc , ,00 7. Elaborazione dati (specificare) Nulla Nulla 8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) , ,00 (10%) TOTALE , ,00 XVIII

19 MODULO 3BIS MODULO 3BIS: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA (Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti) GRUPPO DI RICERCA: 3 - S. s. Immunoterapia e Terapia Genica, Dip. di Oncologia Sperimentale (INT-MI) RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Mario Paolo Colombo struttura di appartenenza : Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, Milano - funzione: Direttore Struttura semplice indirizzo : Via G. Venezian, Milano N. tel: N. fax: indirizzo mario.colombo@istitutotumori.mi.it RAPPRESENTANTE LEGALE: nominativo: Prof. Stefano Zurrida *Il Rappresentante Legale della Fondazione, Sig. Carlo Borsani, con documento n del 3 agosto 2006, ha delegato la sottoscrizione di atti di gestione che impegnano la Fondazione, al Direttore Generale, Prof. Stefano Zurrida. CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) Studieremo il ruolo di SPARC prodotto dal tumore e dallo stroma su malignità e resistenza ai farmaci in topi geneticamente modificati che sviluppano tumori mammari spontanei con differenti tipi di stroma. Mediante un anticorpo monoclonale anti-sparc da noi prodotto valuteremo in vivo se il blocco funzionale di SPARC favorisce l accesso di farmaci e anticorpi terapeutici al tumore. Si costruiranno anticorpi umani anti-sparc isolando le sequenze variabili da librerie fagiche per poterli utilizzare sia in topi umanizzati che nel paziente. METODOLOGIA (max 1000 caratteri) Per studiare il ruolo di SPARC utilizzeremo topi che sviluppano tumori mammari spontanei resi o meno deficienti per SPARC, mentre per differenziare SPARC prodotto dal tumore e dallo stroma utilizzeremo chimere trapiantate con il midollo osseo di topi SPARC competenti o deficienti. Gli animali saranno trattati mediante chemioterapia (Doxorubicina) o immunoterapia (anti-her-2) in presenza o meno di inibizione di SPARC con l anticorpo monoclonale da noi isolato. Verrà valutata la crescita tumorale e sarà analizzata la componente stromale mediante immunoistochimica per verificare che l inibizione di SPARC moduli l efficacia della terapia antitumorale. Validata l efficacia adiuvante dell anticorpo anti- SPARC, si procederà ad isolare una anticorpo uguale da una libreria fagica di cdna umano. Mediante cicli successivi di ibridazione all antigene isoleremo le sequenze variabili che riconoscono SPARC. Il loro cdna verrà clonato in appositi vettori per esprimere un anticorpo completamente umano anti- SPARC. XIX

20 MODULO 3BIS COMPOSIZIONE DEL COSTO DEL GRUPPO DI RICERCA Voci di costo e breve descrizione Totale di cui a carico dei fondi ministeriali 1. Personale dipendente ,00 NULLA Direttore SS Dirigente I Liv. Tecnico di laboratorio 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio , ,00 Ricercatore senior Ricercatore junior Tecnico co.co.co. 3. Missioni 4.000, ,00 4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): 5. Materiale di consumo , ,00 _ 6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc , ,00 7. Elaborazione dati (specificare) 8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) , ,00 TOTALE , ,00 XX

21 MODULO 3BIS MODULO 3BIS: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA (Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti) GRUPPO DI RICERCA: 4 - S.c. Biologia Molecolare Dip. di Oncologia Sperimentale (INT-MI) RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Elda Tagliabue struttura di appartenenza : Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, Milano funzione: Dirigente Biologo indirizzo : via G.Venezian, Milano N. tel: N. fax: indirizzo elda.tagliabue@istitutotumori.mi.it RAPPRESENTANTE LEGALE: nominativo: Prof. Stefano Zurrida * *Il Rappresentante Legale della Fondazione, Sig. Carlo Borsani, con documento n del 3 agosto 2006, ha delegato la sottoscrizione di atti di gestione che impegnano la Fondazione, al Direttore Generale, Prof. Stefano Zurrida. CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) L attività svolta dal gruppo permetterà di definire la biologia del microambiente del carcinoma della mammella e il suo coinvolgimento nell evoluzione e/o risposta alla terapia di questo tipo di malattia. Inoltre attraverso l utilizzo di anticorpi precedentemente prodotti, si valuterà l efficacia del targeting del microambiente nella risposta delle cellule di carcinoma mammario sia ai farmaci convenzionali che a quelli bersaglio specifici. METODOLOGIA (max 1000 caratteri) Il piano di ricerca proposto prevede di generare attraverso manipolazione genetica, linee di carcinoma della mammella capaci di produrre i diversi tipi di matrice extracellulare recentemente riscontrati nei tumori mediante analisi di espressione genica. Le linee cellulari ottenute verranno saggiate sia in vitro che in vivo negli animali da esperimento, per la loro sensibilità ai chemioterapici (doxorubicina e taxolo) e a farmaci diretti contro bersagli specifici come inibitori delle tirosino-chinasi (Gefitinib e Lapatinib) o l anticorpo monoclonale umanizzato anti-her2, Trastuzumab. In queste analisi si verificherà anche se la resistenza ai trattamenti dipenda dalla modificazione da parte delle cellule tumorali e/o dell ospite del microambiente in cui il tumore si sta sviluppando. Infine, mediante metodologie di biologia molecolare (RT-PCR e DASL), e/o immunoistochimica, carcinomi umani della mammella di pazienti sottoposte a terapia neoadiuvante verranno classificati in base al profilo di espressione dei geni deputati alla formazione della matrice e risultati importanti nella progressione e/o risposta alla terapia negli studi effettuati sui modelli sperimentali. I dati ottenuti verranno poi confrontati con la risposta delle pazienti ai trattamenti neoadiuvanti. Infine, verranno effettuati nei modelli sperimentali saggi di sensibilità ai farmaci in presenza di anticorpi specifici per i componenti del microambiente, precedentemente prodotti. XXI

22 MODULO 3BIS COMPOSIZIONE DEL COSTO DEL GRUPPO DI RICERCA Voci di costo e breve descrizione Totale di cui a carico dei fondi ministeriali 1. Personale dipendente ,00 NULLA Dir biologo 1 livello (12 mesi /uomo) 2 Tecnico di laboratorio (18 mesi/uomo) 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio , ,00 Borsista laurea specialistica (33 mesi/uomo) Borsista laurea breve (33 mesi/uomo) 3. Missioni , ,00 Un congresso all anno per due persone 4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): 5. Materiale di consumo , ,00 terreni di coltura cellulare, reagenti per le transfezioni,_ antibiotici per la selezione, reagenti per l immuno- istichimica, kits per l estrazione dell RNA, probes per RT-PCR, microarrays per DASL 6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc , ,00 _ 7. Elaborazione dati (specificare) 8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) , ,00 10% TOTALE , ,00 XXII

23 MODULO 3 MODULO 3: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUNA UNITÀ OPERATIVA (Compilare un modulo per ciascuna UO) UNITÀ OPERATIVA N. 2: Istituto Europeo di Oncologia RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Prof. Pier Giuseppe Pelicci struttura di appartenenza : Istituto Europeo di Oncologia funzione: Chairman Dipartimento di Oncologia Sperimentale indirizzo : Via Adamello, Milano N. tel: 02/ N. fax: 02/ indirizzo piergiuseppe.pelicci@ifom-ieo-campus.it RAPPRESENTANTE LEGALE: nominativo: Dott. Carlo Ciani CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (MAX 2000 CARATTERI) Le cellule staminali (SC) sono relativamente quiescenti, mentre la loro progenie piu differenziata ha una grande attività proliferativa. La quiescenza delle SC si pensa che abbia un ruolo critico nel limitare la loro suscettibilità agli stress e agli insulti mielotossici. Poiché le leucemie sono organizzate gerarchicamente, come l emopoiesi normale, dove da poche SC leucemiche (LSC) derivano tutte le altre cellule tumorali, vorremmo indagare se anche nelle leucemie esistono cellule staminali quiescenti responsabili non solo del mantenimento del clone leucemico, ma verosimilmente anche delle ricadute dopo terapia. L utilizzo di alcune procedure sperimentali (come il PKH) ci permetterà di isolare in vivo le cellule leucemiche quiescenti, saggiarle per il loro potenziale leucemogenico e comprenderne i meccanismi molecolari che controllano tale comportamento, aprendo in questo modo nuove possibilità di trattamento. E infatti probabile che una delle spiegazioni del fallimento delle attuali terapie nel controllo delle ricadute sia l impossibilità di eradicare il clone leucemico eliminando completamente le LSC. Con questa finalità vorremmo far luce anche sulle complesse interazioni fra LSC ed ospite. E infatti noto che segnali derivanti dall ambiente extracellulare (nicchia) regolano l equilibrio fra sel-renewal e differenziamento delle SC. Recentemente è stata identificata la nicchia emopoietica: le SC sono adese tramite N-caderine a particolari cellule osteoblastiche (SNO) a livello del midollo osseo. E stato dimostrato che quando una SC ematopoietica esce dalla nicchia perdendo contatto con le cellule SNO incomincia a differenziare e viene eliminata. Nostra intenzione è quella di comprendere se anche le LSC dipendono dalle interazioni con la nicchia per il loro mantenimento. A questo fine analizzeremo in vivo la localizzazione e le modalità di crescita delle LSC, cercando di modificare le possibili interazioni con il microambiente al fine di eliminare il clone leucemico e le possibilità di ricaduta. Un approccio simile verra utilizzato per lo studio delle cellule staminali neuronali. METODOLOGIA (max 4000 caratteri) Diverse metodiche per isolare e coltivare le SC ematopoietiche e le LSC sono correntemente in uso nel nostro laboratorio. Utilizziamo abitualmente saggi come le LTC-IC, saggi clonogenici e trapianti nell animale per stabilire il numero, il potenziale rigenerativo e le capacità di differenziamento delle SC ematopoietiche. Useremo un protocollo ormai consolidato per indurre leucemie nell animale da esperimento utilizzando le proteine di fusione delle leucemie umane. Caratterizzeremo queste leucemie a livello fenotipico e cercheremo di isolare le cellule quiescenti. Per questo scopo useremo il metodo del PKH, un colorante lipofilico delle membrane cellulari, che ci consentirà di seguire in vivo e di isolare le cellule leucemiche quiescenti. Brevemente le cellule leucemiche saranno colorate ed iniettate nell animale. Le cellule che proliferano perderanno il colorante che al contrario sarà mantenuto solo dalle cellule quiescenti. Questa semplice procedura ci consentirà di isolare in vivo le cellule leucemiche quiescenti, valutarne il potenziale leucemogenico e studiare da un punto di vista molecolare il loro ciclo cellulare. Al fine di identificare le possibili interazioni fra cellule leucemiche e la nicchia (cellule SNO), utilizzeremo metodiche di immunocitochimica su fette di osso decalcificato e tecniche di immunofluorescenza su sezioni al criostato. Per consentire di XXIII