Dipartimento di Patologia Clinica. S. S.D. Biologia Molecolare

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1 Dipartimento di Patologia Clinica S. S.D. Biologia Molecolare Caterina Valle Dirigente Responsabile Struttura S. Dipartimentale Biologia Molecolare Ospedale S. Corona Pietra Ligure

2 Biologia molecolare Ospedale Santa Corona

3 Presentazione della Struttura Dipartimentale Biologia Molecolare Staff Nella Struttura Dipartimentale operano le seguenti figure professionali: Biologo, Biotecnologo,Tecnico di Laboratorio Biomedico. Dr.ssa Caterina Valle - Dirigente Responsabile SSD, Specialista in Immunologia Clinica, in Patologia Clinica e in Igiene c/o Università di Genova e Master per Direttore di S.C. c/o Università di Genova ECM come da programmazione. Dr.ssa Giovanna Lavagna -Dirigente Responsabile RSQ, Specialista in Microbiologia ed in Patologia Clinica, c/o Università di Genova, ECM come da programmazione Dr.ssa Francesca Guerra - Coordinatore TSLB,Master di I Livello in Management per le funzioni di Coordinamento nell Area tecnico Sanitaria, Università di Firenze e Master II Livello in Teledidattica applicata alle Scienze della Salute e ITC in Medicina ECM come da programmazione Sig.ra Carmen Fata - TSLB- Formazione secondo gli aggiornamenti previsti ed acquisizione ECM come da programmazione. Recapiti utili Dir. Responsabile della Struttura ( RUO) - Dr.ssa Caterina Valle Tel: (studio) (portatile) c.valle@asl2.liguria.it Responsabile della Qualità ( RSQ) - Dr.ssa Giovanna Lavagna tel: Coordinatore TSLB Dr.ssa Francesca Guerra Tel

4 Presentazione della Struttura Dipartimentale Biologia Molecolare La Struttura Dipartimentale è composta da uno staff operativo nell Ospedale S.Corona dal Nel 1988 i Dirigenti Biologi introducono il settore di ImmunoPatologia e Virologia nell ambito del Servizio Trasfusionale. Tale settore, inizialmente, comprende diagnosi di laboratorio di Epatite B,C, positività ad HIV con metodica di screening MEIA e di diagnostica differenziale RIBA ed Western-blot ; Immunopatologia per lo studio delle patologie autoimmuni, con metodica IFA ed EIA; Studio del complesso T.O.R.C.H., con metodiche IFA ed EIA; Citofluorimetria a flusso per lo studio di pannelli Immunologici di base e pannello Immunologico per pazienti HIV positivi. Dal 1995 i biologi iniziano l attività di Biologia Molecolare Diagnostica per HCV e HIV; nel 1997 viene estesa alla validazione biologica per unità di sangue legata, inizialmente, all analisi PCR ( reazione di polimerizzazione a catena) di HCV-RNA, per essere estesa successivamente all analisi di HIV-RNA e HBV-DNA, con metodica molecolare PCR REAL TIME (TRINAT). Dal marzo 2003, il settore diventa Struttura Semplice Virologia e Biologia Molecolare, iniziando l attività di genetica su DNA umano per lo studio di celiachia, trombofilia ed emocromatosi. Dal primo agosto 2008 la Struttura presta la propria attività molecolare per il Centro di Validazione TRINAT del Ponente Ligure, secondo il progetto Regionale di centralizzazione ( Delibera G.R. n.587 1/06/07). Dal 2010 la Struttura Semplice diventa Dipartimentale, con l obiettivo di centralizzare l attività molecolare nell ambito del Dipartimento di Patologia Clinica. dal I maggio 2011 l attività di TRINAT viene trasferita alla S.C. Trasfusionale, nell ambito di un percorso condiviso per la centralizzazione dell attività molecolare ( I percorso/sinergia comune con un altra Struttura del Dipartimento)

5 Presentazione della Struttura Dipartimentale Biologia Molecolare Aree di eccellenza INDAGINI VIROLOGICHE DI I E DI II LIVELLO VIROLOGIA MOLECOLARE GENETICA FARMACOGENETICA Per la diagnosi di laboratorio di Celiachia, dopo un semplice prelievo di sangue del paziente, viene effettuato uno studio di Laboratorio completo, dai test di screening alla Biologia molecolare( I test di screening, in immunofluorescenza ed immunoenzimatica,sono stati trasferiti,per un percorso diagnostico condiviso di centralizzazione dell autoimmunità, alla S.C. Laboratorio di Patologia Clinica,dal gennaio 2012: II percorso/sinergia comune con un altra Struttura del Dipartimento). Il test in Biologia Molecolare per lo studio della predisposizione alla Malattia Celiaca, prevede la ricerca di più gruppi allelici predisponenti: DR3DQ2, DR7DQ2, DR5DQ7 e DR4DQ8; Per lo studio di Patologie Trombofiliche, su DNA umano estratto da sangue intero, si ricerca, a carico del gene del Fattore V di Leiden, la mutazione R506Q, del fattore V HR2 la mutazione H1299R,, Fattore II protrombina- la mutazione G20210A e per il gene di Omocisteina-la-mutazione-C677T. Per La FARMACOGENETICA, siamo l unico laboratorio del Ponente Ligure ad effettuare lo Studio di polimorfismi per IL 28B (per epatite c +)e della presenza di allele HLA CLI B*5701 ( per HIV+)

6 Tipologia d analisi DESCRIZIONE Metodica Tempi Di conseg na( gg) Virus epatite B (HBV) HBsAg Chemilum. Perfezionata CMIA ABBOTT 3 Virus epatite C (HCV) Anticorpi Chemilum. Perfezionata CMIA ABBOTT 3 Virus immunodef. HIV1-2 ac/ag p24 Chemilum. Perfezionata CMIA ABBOTT 3 Virus HCV Immunoblotting RIBA Chemilum. Perfezionata CMIA ABBOTT 7 Virus HIV1-2 immunoblotting Western blot Chemilum. Perfezionata CMIA ABBOTT 3 Virus epatiteb (HBV) Anticorpi HBcAg Chemilum. Perfezionata CMIA ABBOTT 3 Virus epatiteb (HBV)Anticorpi HBcAg-IgM Chemilum. Perfezionata CMIA ABBOTT 3 Virus epatiteb(hbv)anticorpi HBeAg Chemilum. Perfezionata CMIA ABBOTT 3 Virus epatite B(HBV)Anticorpi HBsAg Chemilum. Perfezionata CMIA ABBOTT 3 Virus epatite B(HBV)Antigene HBeAg Chemilum. Perfezionata CMIA ABBOTT 3 Virus epatite A(HAV)Anticorpi IgG Chemilum. Perfezionata CMIA ABBOTT 3 Virus epatite A(HAV)Anticorpi IgM Chemilum. Perfezionata CMIA ABBOTT 3

7 Tipologia d analisi DESCRIZIONE metodica Tempi di cons egna gg Virus HBV-DNA quantitativa PCR Real- time con Sistema di preparazione/ estrazione/rivelazione COBAS S-601 ROCHE ( * Virus HCV-RNA quantitativa PCR Real- time con Sistema di preparazione/ estrazione/rivelazione COBAS S-601 ROCHE ( Virus HIV-RNA quantitativa PCR Real- time con Sistema di preparazione/ estrazione/ amplificazione-rivelazione COBAS S-601 ROCHE 7-10 (se 3-7 (se urgente 48 0re) urgente 48 ore) 3-7 ( se urge nte in giorn ata) Genotipi HCV (sempre associata a HCV- RNA) PCR Real- time con Sistema di preparazione/ estrazione COBAS S-601 ROCHE; amplificazione-rivelazione TAQMAN 48 ROCHE 7-10

8 Tipologia d analisi DESCRIZIONE Metodica Tempi di consegna (gg) Test genetico per lo studio di gruppi allelici DQB1, DQA1, DRB1, (gruppi allelici predisponenti alla malattia celiaca) Analisi Mutazione del DNA per i Fattori della Coagulazione Preparazione manuale del campione e delle MMX ;PCR per amplificazione in termociclatore ; rivelazione in LIPA ( Strumento INNO-LIPA NUCLEAR LASER) Preparazione manuale del campione e delle MMX ;PCR per amplificazione in termociclatore ; rivelazione in LIPA ( Strumento INNO-LIPA NUCLEAR LASER) Preparazione manuale del campione e delle MMX ;PCR Real- time su ROTORGENE NUCLEAR LASER Analisi dei polimorfismi di IL 28 B Preparazione manuale del campione PCR Real- time HLA B5701 (ABACAVIR) Preparazione manuale del campione PCR Real- time ESTRAZIONE DI ACIDI NUCLEICI Preparazione manuale del campione PER ESTRAZIONE //

9 Biologia Molecolare: percorsi/sinergie comuni ad altre Strutture dipartimentali

10 ANALIZZATORE PER CENTRALIZZAZIONE DI DIAGNOSTICA VIROLOGICA DI SCREENING (TECNOLOGIA IN CHEMILUMINESCENZA PERFEZIONATA ABBOTT)

11 Sistema molecolare: Cobas Ampliprep-TaqMan-P630 (metodiche in PCR-REAL TIME- sonde TaqMan) Applicazioni attuali: HCV-HIV-HBV-TNAI (estrazione da sangue intero con TNAI e amplificazione/rivelazione TaqMan

12 HCV,HIV,HBV: PERIODO FINESTRA Virus giorni HCV HIV 7-41 HBV 9-92

13 Infezione da HIV - profilo sierologico HIV-RNA nel plasma anti-hiv Viremia (infettante) Esposizione HIV-DNA (PCR) in PBMC HIVAg (p24) Giorni pre/post infettività dall esposizione

14 Test molecolari per virologia: sensibilità a confronto PCR-REAL TIME PER DONAZIONI DI SANGUE : Soglie di sensibilità ROCHE HBV 3,7 UI/ml HCV 10,7 UI/ml HIV1 : 1. gr.o 154 UI/ml 2. Gr.M 49 UI/ml HIV2 2,2 copie/ml TMA: Soglie di sensibilità CHIRON HBV 7,46 UI/ml HCV 2,78 UI/ml HIV1 20,6 UI/ml PCR REAL TIME PER DIAGNOSTICA Soglie di sensibilità ROCHE: HIV UI/ml (20 cp/ml) HCV 15 UI/ml HBV 20 UI/ml

15 Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan48 Software AmpliLink 3.2 Completa automazione del processo di preparazione dei campioni di siero o plasma: in questo modo si elimina completamente la fase di estrazione manuale degli acidi nucleici realizzando un cospicuo risparmio in termini di tempo-operatore. Riproducibilità e standardizzazione della fase pre-pcr grazie all automazione, che elimina tutte le variabili associate alla procedura manuale. Kit dedicati, standardizzati e marcati CE Fino a 72 campioni a bordo dello strumento; caricamento in continuo dei campioni per la massima versatilità di utilizzo; Produttività di 20 campioni all ora per abbreviare i tempi di refertazione e processare senza problemi anche routine importanti;

16 Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan48 Software AmpliLink 3.2 Software Amplilink 3.2 per la gestione completa del sistema: un solo PC e un solo software, con interfaccia grafica semplice ed immediata, per governare a seconda della configurazione, Cobas AmpliPrep e Cobas TaqMan 48 e 96 Backup dei dati analitici su DVD-R per una assoluta sicurezza dei dati ed economia di spazio e costi di gestione; Operazioni di manutenzione sullo strumento completamente guidate dal software per rendere l operatore completamente autonomo nella gestione dello strumento, senza necessità di consultare guide o manuali durante il lavoro; Riconoscimento positivo mediante codice a barre di campioni, rack e reagenti, per la massima sicurezza e affidabilità del processo; Principio di estrazione brevettato che utilizza particelle magnetiche di silice con elevata affinità chimico-fisica verso gli acidi nucleici Estrazione totale degli acidi nucleici del campione Assenza di contaminazioni di qualsiasi tipo: i campioni vengono aspirati e dispensati da un puntale dedicato dentro appositi contenitori (SPU), Sample Processing Units: tutto il materiale che viene a contatto con il campione è monouso. Una lampada UV incorporata nello strumento può essere accesa tra una seduta e l altra per garantire la sterilità delle superfici di lavoro.

17 Strumentazione: Cobas Ampliprep-TaqMan 48 Applicazioni attuali: HCV per Genotipo

18 GENOTIPI HCV I GENOTIPI DELL'HCV Il virus dell'epatite C non è omogeneo e si riconoscono almeno 6 genotipi principali. Seguendo la classificazione di Simmonds i genotipi sono numerati dall' 1 al 6 e i sottotipi sono classificati in a, b, c. L'importanza della determinazione del genotipo risiede nel fatto che tali genotipi rispondono differentemente alla terapia: migliore risposta si ottiene con i genotipi 2 e 3.

19 PCR REAL TIME : MICROARRAY Un microarray di DNA (comunemente conosciuto come GENE CHIP, CHIP A DNA, BIOCHIP o matrici ad alta densità) è costituito da un insieme di microscopiche sonde di DNA attaccate ad una superficie solida come vetro, plastica, o chip di silicio formanti un array (matrice). Tali array permettono di esaminare simultaneamente la presenza di moltissimi geni all'interno di un campione di DNA (che spesso può rappresentare anche tutto il genoma o il trascrittoma di un organismo). Un utilizzo tipico è quello di confrontare il profilo di espressione genica di un individuo malato con quello di uno sano per individuare quali geni sono coinvolti nella malattia o per lo studio di antibiogramma per patogeni.

20 COBAS TaqMan Amplificazione/rivelazione

21 ROTORGENE ATTUALE UTILIZZO,CON TECNOLOGIA PCR-REAL TIME ( sonde FRET o sonde TaqMan )PER: FARMACOGENOMICA IL 28 B per epatite C HLA cl.i B* 5701 per HIV+ TEST GENETICO PER TROMBOFILIA mutazioni a carico di Fattore V Leiden, Fattore V HR2, Fattore II protrombina, MTHFR per omocisteina

22 INTERLEUCHINA 28B: TEST PREDITTIVO PER LA PROGNOSI E LA TERAPIA DELL'EPATITE C Il virus dell'epatite C è un RNA virus a singola elica e appartiene alla famiglia delle Flaviviridae. La sua principale via di trasmissione è quella sanguigna o percutanea. La diagnosi sierologica è basata sulla determinazione di anticorpi anti-hcv, mentre la presenza del virus nel sangue è rilevata da HCV-RNA quantitativo e dalla determinazione dei genotipi dell'hcv. La mappatura del genoma umano ha individuato le basi della nostra "diversità" che si riassumono nel concetto di POLIMORFISMO. Il polimorfismo è una modificazione del DNA molto frequente che non altera il funzionamento del DNA stesso, ma ne influenza le capacità sintetiche. Il polimorfismo del gene IL28B ha un rapporto con la maggiore o minore probabilità di risposta al trattamento dell'epatite C cronica. Il polimorfismo più "predittivo ed utile" riguarda i nucleotidi Citosina (CC) ed ha evidenziato una maggiore risposta terapeutica nei soggetti con epatite cronica, in particolare con i genotipi 1 di HCV. In presenza di polimorfismo CC l'eliminazione definitiva del virus dell'epatite C dopo terapia è stata osservata in circa il 71% di casi. (Thomas et all. Nature 2009)

23 IL 28 B IL TEST Il test esegue la ricerca di: 3 genotipi per RS 60: omozigote TT : (polimorfismo compatibile con possibile tipologia di paziente non responder ) omozigote CC : (polimorfismo compatibile con possibile tipologia di paziente responder ) eterozigote TC : (polimorfismo compatibile con possibile tipologia di paziente medio o scarso responder ) 3 genotipi per RS 17: omozigote TT : (polimorfismo compatibile con possibile tipologia di paziente responder ) omozigote GG :(polimorfismo compatibile con possibile tipologia di paziente non responder ) eterozigote TG : (polimorfismo compatibile con possibile tipologia di paziente medio o scarso responder ). Nelle note viene sempre indicato quanto segue: data la particolare tipologia d analisi si consiglia di valutare il risultato nell insieme degli accertamenti effettuati ed in base alla storia clinica del paziente. Il test viene effettuato su Rotorgene, PCR Real time, sonde Fret.

24 HLA B*5701 Il farmaco antiretrovirale ( inibitore a trascrizione inversa, analogo ai nucleosidi) ABACAVIR, nelle prime 6 settimane di trattamento in soggetti affetti da infezione da HIV, scatena una reazione immunomediata,nel 5-8% dei casi. Da tempo è stata riscontrata l associazione tra l ipersensibilità all Abacavir e la presenza di un allele del sistema HLA: B*5701 Test farmacogenomico molecolare per lo studio del complesso maggiore di istocompatibilità di classe I, allele HLA B*5701,da effettuare a tutti i pazienti HIV positivi, trattati con Abacavir. effettuato su Rotorgene, PCR Real time, sonde TaqMan.

25 HLA CL.I- B*5701 IL TEST si basa su due processi: 1. Isolamento del DNA genomico dai campioni ( su estrattore MagnaPure ROCHE) 2. Amplificazione Real TM con primer allele-specifici ( sonde TaqMan) N.B. il test contiene un controllo interno IC, gene beta-globina umano, che consente di controllare la presenza di materiale cellulare nel campione.

26 GENETICA PER CELIACHIA Estrazione con TNAI (da 400 ul di sangue intero) Estrazione con MagnaPure ( da 200 ul di sangue intero)

27 GENETICA PER CELIACHIA HLA cl.ii e PER HLA cl.i B27: (TERMOCICLATORE PER PCR E PROFIBLOT T 48 PER LiPA) PCR End Point Line Probe Assay ( ibridazione inversa su striscia)

28 AMPLIFICAZIONE GENICA mediante PCR (Reazione Polimerasica a Catena) DENATURAZIONE:il DNA è denaturato a C,si ottengono 2 catene singole IBRIDAZIONE : il DNA,a C è ibridato da coppie di primer specifici alla sequenza bersaglio ESTENSIONE :nel DNA ibridato a 72 C vengono aggiunti,grazie alla taq polimerasi, i dntps complementariamente alla catena di DNA preesistente.

29 Malattia celiaca e associazioni HLA DQ2 CL.II DR3-DQ2 DR3-DQ2, DR3-DQ2 DR3-DQ2,DR7-DQ2 DR5-DQ7,DR7-DQ2 DQ8 DR4-DQ8

30 TEST DI CONFERMA ImmunoBlotting per HCV/HIV1-2

31 HIV-1 Genome Most conserved regions chosen to enable broad HIV-1 subtype detection 5' 3' LTR gag pol env LTR Regions targeted by capture probes and amplification primers p17 p24 p7 p6 Env 10 Matrix Protein (MA) Capsid Protein (CA) gp128 Nucleocapsid (NC) gp41 Surface Protein (SU) Transmembrane Protein (TM) PR Protease (PR) RT Reverse Transcriptase (RT) IN Integrase (IN)

32 GENOMA HCV

33 ESTRAZIONE DI ACIDI NUCLEICI Estrazione con TNAI (A MICROPARTICELLE DI SILICE MAGNETICA, TARGET- SPECIFICA) Estrazione generica da sangue 24 campioni in due ore e 30 minuti RESA: DA 400 ul sangue intero= 100 ul eluato con una concentrazione pari a ng DNA O RNA (COSTO ATTUALE 5 EURO A TEST) Estrazione con MagnaPure (A MICROPARTICELLE DI SILICE MAGNETICA Applicazioni attuali:estrazione generica da sangue) Possibili ulteriori applicazioni: Estrazione generica da qualsiasi materiale biologico, RESA: DA 200 ul sangue intero= 200 ul eluato con una concentrazione pari a ng DNA O RNA 8 campioni ogni 20 MINUTI, (COSTO ATTUALE 5 EURO A TEST)