EPATITE B DIAGNOSTICA DI LABORATORIO HBV-HCV-HIV

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1 Epatite B EPATITE B DIAGNOSTICA DI LABORATORIO HBV-HCV-HIV L interesse scientifico per il virus dell epatite B (HBV) e le sue manifestazioni cliniche negli ultimi anni è stato notevolmente alimentato dai significativi progressi intervenuti nella diagnosi e nella terapia. VIRUS DELL EPATITE B Il virus dell epatite B è l unico Hepdnavirus di intesse medico, ed è specifico per la specie umana. La particella virale completa o particella di Dane è una particella sferica del diametro di 42 nm, composta da un involucro esterno Lipoproteico (envelope) che circonda un nucleocapside di 18nm di diametro.

2 Screening sierologico e molecolare per HCV 16,4 milioni di donazioni; positivi HCV NAT Anti-HCV N * * 7 WP, 1 ALT, 1 anti-hbc+ S. Laperche, TSIC Wiesbaden, giugno 2008

3 I VIRUS RESPONSABILI DELL AIDS Agli inizi degli anni 80, la segnalazione di focolai di polmonite mortale da Pneumocystis carinii associata a segni evidenti di compromissione del sistema immunitario, in giovani adulti, per lo più maschi omosessuali portò, negli USA, alla identificazione della Sindrome, oggi nota come immuno deficienza acquisita, ed al sospetto che un agente infettante, a trasmissione sessuale, potesse esserne la causa. Oggi sono noti due virus responsabili della sindrome da immuno-deficienza acquisita: HIV-1 e HIV-2. HIV- 1 è diffuso in tutto il mondo. HIV-2 è diffuso prevalentemente in Africa occidentale, caraibi e America Meridionale, ed è meno virulento e provoca una malattia a decorso più attenuato.

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5 HIV GENOMA Come tutti i retrovirus possiede tre geni fondamentali per la sua replicazione: Gag- codifica per le proteine del Da Pol derivano la Env codifica per le proteine core del virione (p24, p17, p9, p7) Trascrittasi Inversa le proteasi integrasi dell involucro esterno (gp120, gp 41) Oltre a questi geni, HIV possiede altri sette geni accessori che hanno funzione regolatorie del ciclo virale e della sintesi proteica.

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7 Schema dell organizzazione del genoma del provirus di HIV-1 ed HIV-2

8 Le proteine Vif e Vpr sono proteine accessorie che vengono incorporate nel virione maturo di cui sembra favoriscano l infettività. Vpu e Nef sono proteine con funzione regolatrice sul ciclo di replicazione virale Vpu interviene nella maturazione e liberazione del virus. CICLO VIRALE DI HIV Sia HIV-1 che HIV-2 sono in grado di infettare le cellule che presentano sulla loro membrana il recettore CD4. La molecola CD4 è presente: Linfociti T- helper Su alcuni monociti (sangue periferico) Nei macrofagi tessutali Nelle cellule dendritiche follicolari (linfonodi) Nelle cellule della microglia dell encefalo Nelle cellule dendritiche della cute-mucosa.

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10 Ai fini dell ingresso nella cellula CD4 da solo è insufficiente e il virus si deve legare a un co-recettore. I due tipi principali di co-recettore sono CCR5 e CXCR4, entrambi sono espressi sulla superficie dei linfomonociti CD4(+) del sangue periferico, il che spiega la loro sensibilità all infezione. La contemporanea interazione tra gp120 da un lato, e CD4 e co-recettore dall altro, provoca una serie di alterazioni conformazionali nella glicoproteina dell antirecettore che si traducono nella fusione dell envelop virale con la membrana della cellula e la liberazione nel citoplasma cellulare del nucleocapside virale. RETROTRASCRIZIONE: conversione del RNA del genoma virale in DNA (definito provirus ), segue l integrazione del provirus nel genoma della cellula. Il genoma provirale consente l attacco della RNA polimerasi II cellulare e l avvio del processo trascrittivo con formazione del RNA genomico ed mrna.

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12 VARIABILITA DEL GENOMA HIV Una delle più evidenti caratteristiche del genoma di HIV è rappresentata dal notevole grado di variabilità dimostrabile tra diversi stipiti virali da diversi individui o, addiritura, tra gli stipiti virali isolati dallo stesso individuo in diversi momenti dell infezione. La variabilità genomica di HIV-1 è rilevante per diversi aspetti della biologia del virus, che vanno Dal tropismo di cellula o tessuto Al tipo di manifestazioni cliniche indotte Virulenza Suscettibilità alla risposta immune dell individuo Le sequenze che sono soggette a variazioni notevoli sono env e nef mentre gag e pol sono più conservate. Si suppone che le proteine codificate da gag e pol debbano mantenere la struttura-funzione del Virus,mentre le proteine codificate da env cambiano per eludere la risposta immune dell organismo. La gp 120contiene epitopi in grado di evocare la risposta immunitaria anticorpi neutralizzanti (la sua variazione elude la risposta immunitaria.)

13 In alternativa è noto che la RT commette molti errori nell incorporazione delle basi. TIPI E SOTTOTIPI Per HIV-1 esistono 3 gruppi M (Major)con 9 sottotipi (A-K) sono in relazione all area geografica. O (outlayer) con 5 sottotipi N (non M non O )con pochi sottotipi Per HIV-2 sono descritti 8 sottogruppi ( A-H) e nessun sottotipo PATOGENESI DELL AIDS Infezione primaria: può essere asintomatica o, più frequentemente dopo un periodo di incubazione di 3 6 settimane si traduce in una malattia acuta con febbre che si esaurisce spontaneamente nel giro di alcuni giorni, quindi difficile da diagnosticare. L infezione si accompagna ad un elevato titolo di viremia nel sangue periferico e nel giro di 1 settimana massimo 3 mesi si produce una intensa risposta immunitaria che provoca una notevole riduzione della viremia.

14 Il decorso dell infezione da HIV

15 Successivamente il virus viene sequestrato nei linfonodi soprattutto all interno delle cellule dendritiche follicolari. Inizia così la FASE DI LATENZA CLINICA che non coincide con la latenza virale (nei linfonodi continua la replicazione virale) che si accompagna alla liberazione di virus e prodotti virus specifici che determinano lesioni fondamentali. Anche in assenza di manifestazioni cliniche evidenti, infatti, i soggetti infetti da HIV-1 presentano un progressivo calo nel numero dei linfociti CD4+ circolanti. La sintomatologia inizia con lo stadio LAS (lynphoadenopatic syndrome ) Subito dopo inizia lo stadio ARC (AIDS-related complex) che si accompagna ad un ulteriore diminuzione dei linfociti T-helper, anemia e ipergammaglobulinemia. Inizio della fase AIDS conclamata in cui il virus, non è più contenuto dalla reazione linfonodale.

16 Evoluzione immunologica dell infezione da HIV

17 DIAGNOSI SIEROLOGICA DELL INFEZIONE DA HIV L infezione da HIV è seguita dalla costante e progressiva replicazione del virus in una serie di organi bersaglio ed è destinata a sfociare nella definitiva compromissione del sistema immunitario e nella comparsa di sintomatologia clinica. La sieropositività ossia la rilevazione di anticorpi specifici per HIV nel siero del soggetto, consente di confermare la diagnosi di infezione in atto. I test per la diagnosi di infezione da HIV servono per: 1) Identificare i soggetti siero-positivi per una terapia antivirale precoce 2) Identificare i portatori che possono trasmettere l infezione ad altri soggetti (es. donatori di sangue, donne in gravidanza) 3) Per seguire il decorso della malattia e confermare la diagnosi 4) Valutare l efficacia della terapia.

18 TEST DI SCREENING (2Marzo 1985) Le soluzioni ottimali per un test di screening sono: 1) Rilevazione degli anticorpi 2) Rilevazione dell antigene 3) Utilizzare Ag ricombinanti di grandi dimensioni 4) Rilevazione del cluster lineare di gp 41 5) Impiego di struttura tridimensionale di p24 Ag 6) Rilevazione equivalente dei vari sottotipi 7) Sensibilità 8) Specificità

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20 Test HIV di 1 a generazione Indirect anti-human assay format EIA Plasma/Serum Sample Bead + Enzyme Conjugate Bead Substrate Detection of anti-hiv-1 IgG HIV-1 Viral Lysate Enzyme conjugated anti-human IgG

21 Test HIV di 2 a generazione Indirect anti-human assay format EIA Plasma/Serum Sample Bead + Enzyme Conjugate Bead Substrate Detection of anti-hiv-1 IgG Recombinant HIV-1 (& HIV-2) proteins/peptides Enzyme conjugated anti-human IgG Migliore sensibilità e specificità Anticorpi contro il nuovo virus HIV-2 (scoperto nel 1986) Solo il 51-93% delle infezioni da HIV-2 rilevate dai test anti-hiv-1

22 Test HIV di 3 a generazione Direct (sandwich) assay format EIA or CMIA Plasma/Serum Sample Microparticle Recombinant HIV-1 (& HIV-2) proteins/peptides + Enzyme Conjugate Enzyme or acridinium conjugated to recombinant HIV-1/2 proteins/peptides Microparticle Substrate or H 2 O 2 Detection of anti-hiv-1 IgM & IgG Rileva tutte le classi di immunoglobuline (IgG, IgM, IgA) Migliore sensibilità in sieroconversione, maggiore specificità Inclusione di antigeni di HIV-1 gruppo O (metà anni 90)

23 Infezione da HIV IgM e IgG anti-hiv IgG anti-hiv IgM

24 Test HIV di 4 a generazione (Ag/Ab Ab Combo) Direct (sandwich) assay format EIA or CMIA Plasma/Serum Sample Microparticle + Enzyme Conjugate Microparticle Substrate or H 2 O 2 Detection of anti-hiv-1 IgM & IgG Recombinant HIV-1/2 proteins/peptides & anti-p24 antibodies p24 Enzyme or acridinium conjugated to recombinant HIV-1/2 proteins/peptides & anti-p24 antibodies Rileva tutte le classi di immunoglobuline (IgG, IgM, IgA) Rileva p24 di HIV-1/2/O Migliore sensibilità in sieroconversione rispetto ai test per soli anticorpi

25 Infezione da HIV: chiusura del periodo finestra con i diversi test sierologici e molecolari HIV-RNA (plasma) Ag p24 EIA 4 generazione EIA 3 generazione EIA 2 generazione EIA 1 generazione Giorni dopo l'esposizione

26 ALGORITMO PER LA DIAGNOSI DI HIV Test HIV Combo Negativo Reattivo STOP Western blot Positivo Negativo Infezione da HIV Test per p24 o HIV-RNA Negativo (falso positivo) Positivo: Infezione da HIV

27 Attualmente in Italia non c è consenso sulle linee guida da seguire per la diagnosi dell infezione da HIV Ann.Ist Super Sanità 2010 Vol.46. N 1:34-4 SUGGESTED STRATEGIES FOR THE LABORATORY DIAGNOSIS OF HIV INFECTION IN ITALY In Italy there are not consensus guidelines for the diagnosis of HIV infection in individuals who wish to know their HIV serostatus. At the present, each laboratory/hospital is generating its own standard operating procedures, including diagnostic algorithms.

28 Nel 2008 l AMCLI aveva proposto un percorso diagnostico per la diagnosi di infezione da HIV. Sostanzialmente questo percorso prevede in caso di positività del test di screening la ripetizione del test di screening con un secondo metodo che abbia almeno la sensibilità di quello precedente. Nello stesso periodo sono uscite le linee guida della Regione Piemonte DD n 189 del 19 Luglio 2007 che prevede: Raccomandazioni principali anonimato, qualora l utente ne faccia richiesta. ticket, esenzione impegnativa, medico di base o richiesta interna. Test sierologico per gli anticorpi utilizzo di test immunometrici di quarta G. e p24 i risultati positivi devono sempre essere confermati con W.B. risultato indeterminato eseguire? Ricerca di HIV RNA

29 l utente può essere sottoposto a più prelievi. il laboratorio deve lavorare su provetta madre il laboratorio deve usare un CQI giornaliero il laboratorio deve partecipare a un VEQ regionale o nazionale o inter. REFERTAZIONE DEL TEST il referto va consegnato solo all interessato entro una settimana massimo il risultato deve contenere anche le informazioni sul metodo il risultato di positivo può essere consegnato solo dopo conferma W.B. il laboratorio se non esegue il test di conferma lo deve inviare presso un centro di riferimento PROCEDURA DI LAVORO test di screening di 1 livello se reattivo ripetizione del test con un altro metodo su campioni reattivi o dubbi eseguire W.b.

30 risultati concordemente positivi, richiamare il soggetto per un secondo prelievo sul quale eseguire solo test di screening, in caso di conferma,consegna del referto con counselling post test e invio del soggetto presso centro di M.I. in caso di risultati discordanti inviare il campione presso un centro di riferimento per l esecuzione dell HIV RNA, in caso di sospetta infezione inviare il soggetto presso un centro di M.I. Risultato negativo INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO risultato negativo ma se si sospetta una esposizione recente il pz. va inviato al centro di M.I. Risultato positivo presenza di infezione Risultato indeterminato ripetere la sierologia a distanza di un mese dal primo prelievo

31 RISULTATI FALSI-POSITIVI e FALSI-NEGATIVI CON I TEST DI SCREENING Falsi positivi infezioni acute autoimmunità gravidanza trasfusioni multiple immunizzazione recente contro il virus influenzale manipolazione impropria del campione. Falsi negativi infezione recente (periodo finestra) ipogammaglobulinemia infezione allo stadio avanzato (raro) sierotipo di HIV-1 raro (es. gruppo O )

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