BEIA Mab SYPHILIS Screen

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1 BEIA Mab SYPHILIS Screen Edizione Solo per uso professionale TECHNOGENETICS SRL N Pag BEIA Mab Syphilis Screen Ed

2 INTRODUZIONE Il kit BEIA Mab Syphilis Screen è un test immunoenzimatico Back Titration qualitativo (ELISA) per il dosaggio nel siero o nel plasma degli anticorpi di classe IgG, IgM ed IgA specifici verso il Treponema pallidum. SIGNIFICATO CLINICO Lo screening sierologico della Lue ha acquistato, nell ultimo decennio, una rinnovata importanza per l aumento dei casi di sifilide latenti, per l incremento della positività ai test sierologici nelle diverse categorie a rischio e per la stretta correlazione tra Sifilide e HIV. Comunemente, a questo scopo, sono utilizzati metodi con antigene lipoideo come VDRL e RPR unitamente a test con antigene treponemico come TPHA, in grado di offrire una buona sensibilità diagnostica durante tutte le fasi della malattia. Un importante evoluzione per lo screening della Lue è rappresentata dall introduzione dei test ELISA, facilmente automatizzabili ed in grado di superare problemi legati alla soggettività dell interpretazione ed al fenomeno di prozona, normalmente riscontrabili con i test d agglutinazione. Approfondite valutazioni hanno dimostrato come questi test ELISA consentano di ottenere una sensibilità maggiore nei confronti del TPHA stesso. In quest ambito si colloca il kit BEIA Mab SYPHILIS Screen, in grado di offrire, grazie al metodo immunoenzimatico backtitration la massima sensibilità nelle diverse fasi della malattia luetica. PRINCIPIO DEL METODO Il test BEIA Mab SYPHILIS Screen è un dosaggio basato sul principio dell analisi back titration in due fasi. Gli anticorpi specifici (IgG, IgM, IgA) anti-treponema pallidum presenti nel campione in esame reagiscono con gli antigeni adesi al micropozzetto. Dopo aver allontanato con un lavaggio tutto quanto Pag BEIA Mab Syphilis Screen Ed

3 non si è legato alla fase solida, si procede ad una seconda incubazione dopo avere dispensato anticorpi monoclonali anti- TpN47 e anti-tpn15,5, coniugati con perossidasi (HRP) che permettono di valutare quanti determinanti antigenici presenti sulla fase solida sono rimasti reattivi. Maggiore è la concentrazione degli anticorpi nel campione, minore è la quantità di determinanti antigenici rimasti reattivi e minore è la quantità di anticorpi coniugati che si legano alla fase solida. Dopo allontanamento del coniugato enzimatico non legato viene aggiunto il Substrato-TMB che, per azione dell enzima presente sulla fase solida, sviluppa una colorazione azzurra. L aggiunta di una soluzione di acido solforico 1N blocca la reazione e provoca il viraggio del colore dall azzurro al giallo. La densità ottica letta a 450/620 nm è direttamente proporzionale alla quantità di anticorpi coniugati legati e perciò inversamente correlata alla concentrazione degli anticorpi IgM/G/A presenti nel campione. CONTENUTO DELLA CONFEZIONE La confezione è sufficiente per 96/480 determinazioni. Componente Strip da 8 micropozzetti SORB A 12x8x1 5x12x8x1 frazionabili CAL CO B Calibratore Cut-off 1 x 2 ml 2 x 2 ml CONTROL + C Controllo Positivo 1 x 2 ml 2 x 2 ml CONJ D Coniugato 1 x 13,5 ml 5 x 13,5 ml BUF WASH 20X E Tampone di Lavaggio 1 x 100 ml 2 x 100 ml SUBS TMB F Substrato-TMB 1 x 13,5 ml 5 x 13,5 ml H2SO4 G Soluzione Stoppante 1 x 25 ml 2 x 42 ml Istruzioni per l uso 1 1 A. Strip sensibilizzate Strip sensibilizzate con T. pallidum purificato, ceppo Nichols, in busta ermetica richiudibile. Riporre le strip non utilizzate nella busta e richiudere. Le strip sono frazionabili in micropozzetti singoli. Pag BEIA Mab Syphilis Screen Ed

4 B. Calibratore Cut-off Siero umano a concentrazione nota di anticorpi anti-t. pallidum. Contiene 0,09% p/p di sodio azide come conservante. Reagente pronto all'uso. C. Controllo Positivo Siero umano positivo per anticorpi anti-t. pallidum. Contiene 0,09% p/p di sodio azide come conservante. Reagente pronto all'uso. D. Coniugato Soluzione contenente anticorpi monoclonali anti-tpn47 e anti- TpN15,5, coniugati con perossidasi. Reagente pronto all'uso. E. Tampone di Lavaggio Soluzione salina tamponata (PBS) concentrata 20 volte. Contiene 0,1 % di Kathon CG e Tween 20. Vedi preparazione dei reagenti. F. Substrato-TMB Soluzione contenente H2O2/TMB, stabilizzanti e colorante (rosa). Reagente pronto all'uso. G. Soluzione Stoppante Soluzione 1N di acido solforico. Reagente pronto all'uso. MODALITÀ DI CONSERVAZIONE Tutti i reattivi devono essere conservati a 2-8 C al riparo dalla luce. Non utilizzare i reattivi oltre la data di scadenza riportata sull etichetta. REAGENTI INTERCAMBIABILI Il Tampone di Lavaggio, il Substrato-TMB e la Soluzione Stoppante sono intercambiabili tra i diversi kit della linea BEIA. MATERIALE E STRUMENTI RICHIESTI, MA NON FORNITI Lettore di colorimetria per micropiastre con filtro a 450/620 nm. Apparecchiatura manuale o automatica per il lavaggio di micropiastre. Pag BEIA Mab Syphilis Screen Ed

5 Micropipette con puntali monouso da 10, 100, 200, 500, 1000 µl. Provette monouso e normale vetreria da laboratorio. Acqua distillata o deionizzata. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Prima dell'uso portare tutti i reattivi a temperatura ambiente (18-25 C). Evitare l'essiccamento dei micropozzetti, tra gli step di reazione del test. Usare esclusivamente vetreria accuratamente pulita. Non utilizzare uno stesso puntale per pipettare reagenti diversi. Cambiare il puntale tra un campione e l altro. Qualora il Substrato-TMB evidenziasse un viraggio da rosa ad azzurro, il reagente non deve essere utilizzato. Si raccomanda di inserire in ogni corsa analitica dei campioni di controllo al fine di validare i risultati ottenuti, secondo criteri e procedure che ciascun utilizzatore deve definire. Procedere periodicamente alla manutenzione e taratura delle pipette e del lettore. AUTOMAZIONE Il test può essere eseguito con sistemi automatici per kit ELISA, nel qual caso Vi invitiamo a consultare il manuale specifico dello strumento per una corretta esecuzione della corsa analitica. PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Il dosaggio può essere eseguito su siero o plasma (Eparina-EDTA). Se il dosaggio è eseguito entro 5 giorni dal prelievo, i campioni possono essere conservati a 2-8 C. In caso contrario, aliquotare i campioni e congelarli a -20 C. Evitare ripetuti scongelamenti e congelamenti. Si sconsiglia l uso di campioni lipemici, torbidi ed emolizzati. Pag BEIA Mab Syphilis Screen Ed

6 PREPARAZIONE DEI REAGENTI Tampone di Lavaggio Diluire il Tampone di Lavaggio (20x) 1:20 con acqua distillata o deionizzata prima dell'uso. Dopo ricostituzione il tampone è stabile 15 giorni se conservato a 2-8 C e comunque non oltre la data di scadenza riportata sull'etichetta originaria. Nel Tampone di Lavaggio concentrato si possono formare dei precipitati cristallini che si solubilizzano portando il reagente a 37 C prima della diluizione. Si raccomanda di diluire la quantità di tampone necessaria per eseguire i lavaggi dell'analisi in corso. CICLO DI LAVAGGIO Si consiglia di procedere come segue sia nel caso in cui si utilizzi un lavatore automatico di micropiastre sia nel caso in cui si operi manualmente. 1. Svuotare completamente i pozzetti. 2. Riempirli con 300 µl di tampone di lavaggio. 3. Svuotare i pozzetti. 4. Ripetere i punti 2 e 3 per ulteriori 3 cicli. 5. Asciugare con carta assorbente la superficie esterna dei pozzetti al termine del lavaggio. ESECUZIONE DEL TEST Portare i reagenti a temperatura ambiente (almeno minuti a C). Nel caso si utilizzino pozzetti di più micropiastre, anche dello stesso lotto, si consiglia di inserire il Calibratore Cut-off per ciascun gruppo di pozzetti. 1. Prelevare il numero di strip necessario per l'analisi in funzione del numero di campioni in esame, del Calibratore Cut-off e Controllo Positivo (vedi il paragrafo Schema del dosaggio ). Richiudere accuratamente la busta. Pag BEIA Mab Syphilis Screen Ed

7 2. Dispensare nei rispettivi pozzetti 100 L di ciascun siero in esame, del Calibratore Cut-Off e Controllo Positivo. 3. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25 C) per 60 minuti. 4. Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio). 5. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µl di Coniugato. 6. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25 C) per 30 minuti. 7. Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio). 8. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µl di Substrato-TMB. 9. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25 C) per 15 minuti. 10. Bloccare la reazione cromogenica dispensando in ciascun pozzetto 100 µl di Soluzione Stoppante. 11. Leggere la densità ottica (DO) in bicromatismo a 450/620 nm. CALCOLO ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI VALIDAZIONE DELLA SEDUTA ANALITICA Le condizioni che consentono l accettazione dei risultati sono : la DO del Calibratore Cut-off deve essere il valore di I.A. del Controllo Positivo deve essere 0.6 Qualora la seduta dia risultati non conformi alle condizioni sopra elencate, essa non è validabile ed i risultati relativi ai campioni non possono essere refertati senza analisi critica documentata. La non conformità va qualificata e trattata secondo le procedure di Assicurazione Qualità proprie del laboratorio. Si consiglia di instaurare ed attuare procedure di Controllo Qualità interne al laboratorio, i cui risultati concorrano alla validazione delle sedute ed alla gestione di eventuali non conformità. Pag BEIA Mab Syphilis Screen Ed

8 CALCOLO DEI RISULTATI Al fine di correlare il risultato analitico allo stato immunitario del campione si suggerisce di determinare i risultati calcolando l index anticorpale (I.A.) con la seguente formula: DO campione Index Anticorpale (I.A.) = DO Calibratore Cut-off Per il Calibratore Cut-off calcolare, se eseguito in multiplo, il valore medio di densità ottica (DO). I seguenti valori devono essere considerati solo come un esempio e non devono essere usati in luogo dei dati ottenuti dall'utilizzatore. Esempio di calcolo: 1ª DO 2ª DO DO I.A. Calibratore Cut-off Controllo Positivo Campione A Campione B Campione C INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO Studi effettuati su campioni di popolazione equivalente a quella europea hanno condotto a stabilire i seguenti criteri interpretativi: I.A. < 0.9 > INTERPRETAZIONE Il campione è da considerare POSITIVO per la presenza di anticorpi anti-t.pallidum Il campione è da considerare NEGATIVO per la presenza di anticorpi anti-t.pallidum ZONA GRIGIA: Il campione è da considerare DUBBIO per la presenza di anticorpi anti-t pallidum Pag BEIA Mab Syphilis Screen Ed

9 Ritestare i campioni risultati positivi. Se il risultato non è confermato il campione deve essere considerato non reattivo per anticorpi anti-t.pallidum. Va tenuto presente che: - Il test indica solo la presenza o assenza di anticorpi specifici anti-t. pallidum. Non è di per sé e univocamente indice di uno stato infettivo. - Una decisione medica non può essere basata sul risultato di un solo test, ma va fondata sull insieme dei dati clinici disponibili. Dati clinici discrepanti vanno risolti prima di prendere la decisione, eventualmente col conforto di test di conferma o di II livello. - Risultati compresi entro la zona grigia vanno chiariti: con la ripetizione del test sullo stesso campione; con la ripetizione del test su un prelievo successivo; col confronto con un test di riferimento. PRESTAZIONI DEL KIT Avvertenza: i dati presentati sotto questa voce non rappresentano le specifiche di funzionamento del kit, ma costituiscono evidenza sperimentale di come il kit funzioni entro tali specifiche nel modo previsto dal fabbricante. SENSIBILITÀ Sono stati testati 51 sieri di pazienti con diagnosi accertata di infezione da Treponema pallidum. Tutti i 51 sieri hanno evidenziato presenza di immunoglobuline specifiche anti-t. pallidum con il BEIA Mab Syphilis Screen. La sensibilità risulta essere del %. SPECIFICITÀ Sono stati testati 692 sieri supposti negativi per anticorpi anti- Treponema pallidum. I sieri testati sono stati confrontati verso un kit in emoagglutinazione (TPHA) ed un altro kit EIA presenti sul mercato con prestazioni accettabili. 691 sieri risultarono negativi per la presenza di immunoglobuline specifiche anti-t. pallidum con il kit BEIA Mab Syphilis Screen. La specificità risulta essere del 99.85%. Pag BEIA Mab Syphilis Screen Ed

10 SPECIFICITÀ ANALITICA Non è stata rilevata alcuna interferenza in sieri contenenti fino a 10 mg/ml di emoglobina, fino a 1 mg/ml di bilirubina e fino a 30 mg/ml di trioleina. L uso di campioni lipemici, torbidi o emolizzati viene comunque sconsigliato. RIPETIBILITÀ La variabilità intra-saggio ed inter-saggio è stata determinata valutando un campione negativo con I.A. 2.0 e due campioni positivi rispettivamente con I.A. di 0.7 e 0.3. I campioni sono stati replicati 6 volte per seduta in ciascuna di 12 sedute diverse. Sono stati ottenuti coefficienti di variazione inferiori al 20% per il campione negativo ed inferiori al 10% per i due campioni positivi. LIMITAZIONI Contaminazione batterica o ripetuti scongelamenti e congelamenti dei campioni possono alterare i livelli rilevabili di Immunoglobuline specifiche. PRINCIPI GENERALI DI SICUREZZA Tenere in ordine il laboratorio ed effettuare con cura le operazioni previste per l'esecuzione del test. Non mangiare, bere, fumare o usare cosmetici nell area di laboratorio designata. Non pipettare soluzioni o campioni con la bocca. Evitare il contatto diretto con i reattivi ed i campioni indossando guanti monouso e camici. Lavare accuratamente le mani al termine del dosaggio. Pulire immediatamente con opportuni detergenti le superfici di lavoro eventualmente contaminate. Raccogliere il materiale solido o liquido utilizzato per il dosaggio in appositi contenitori ed effettuare lo smaltimento secondo le norme vigenti. Controllare periodicamente il grado di contaminazione dell'ambiente di lavoro e degli operatori. Pag BEIA Mab Syphilis Screen Ed

11 Reagenti contenenti siero I derivati da sangue umano inclusi nel kit sono stati analizzati e trovati negativi per HbsAg, anti-hcv ed anticorpi anti-hiv. Poiché nessun metodo può garantire che tali derivati non possano trasmettere epatite, AIDS o altre infezioni, si raccomanda di manipolare i reagenti con le opportune cautele. Reagenti pericolosi Soluzione Stoppante (Council Directive 88/379/EEC) R36/38 Irritante per gli occhi e per la pelle S26 In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente ed abbondantemente con acqua e consultare un medico. SCHEMA DEL DOSAGGIO Preparare i reattivi Dispensare: 100 L di Calibratore Cut-off in doppio 100 L di Controllo Positivo in doppio 100 L di campione in singolo o doppio, Incubare 60 minuti a T.A. (18-25 C) Eseguire 4 cicli di lavaggio Dispensare 100 L di Coniugato Incubare 30 minuti a T.A. (18-25 C) Eseguire 4 cicli di lavaggio Dispensare 100 L di Substrato-TMB Incubare 15 minuti a T.A. (18-25 C) Dispensare 100 L di Soluzione Stoppante Leggere le densità ottiche al fotometro a 450/620 nm A CC P5 B CC C CP D CP E P1.. F P2.. G P3.. H P4 Pag BEIA Mab Syphilis Screen Ed

12 BEIA Mab SYPHILIS Screen Version For professional use only TECHNOGENETICS SRL Pag BEIA Mab Syphilis Screen Ed

13 INTENDED USE The BEIA Mab Syphilis Screen kit is a qualitative enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Back Titration for the detection of IgG, IgM and IgA antibodies to Treponema pallidum, in human serum or plasma samples. CLINICAL RELEVANCE Serological screening of Lue has gained great importance during the last decade due to a larger number of cases with latent syphilis, an increase of positive results in different high-risk categories, and the close correlation between syphilis and HIV. Test commonly used are those using a lipoid antigen as VDRL and RPR and those using a treponemic antigen, as TPHA, able to offer a good diagnostic sensitivity in all stages of disease. The introduction of the ELISA tests, which can be easily performed in automation and allow to overcome misinterpretation results or prozone phenomenon, usually found with agglutination tests, has been an important evolution.extensive trials have demonstrated that ELISA tests grant a higher sensitivity when compared with TPHA itself. BEIA Mab Syphilis Screen is more sensitive and specific than other methods, is a rapid test and can be performed in automation. PRINCIPLE OF THE ASSAY The BEIA Mab Syphilis Screen kit is a qualitative enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based on back titration method for the detection of Igs antibodies to T. pallidum, in human serum or plasma samples. During the first incubation, only anti-t. pallidum specific antibodies (IgG, IgA, IgM) present in serum or plasma bind to the inner surface of the wells coated with the T. pallidum antigen Nichols strain. After the first incubation the wells are washed to remove non-reactive serum components. During the second incubation monoclonal antibodies anti-tpn47 and anti-tpn15,5 conjugated with horseradish peroxidase (HRP) are added binding to the left reactive antigenic determinants. Higher is the antibodies anti-t. pallidum concentration in the samples lower will be the Pag BEIA Mab Syphilis Screen Ed

14 amount of reactive antigenic determinants left availables for the monoclonal anti-tpn47 and anti-tpn15,5. After a second washing cycle, a Substrate-TMB solution is dispensed into the wells in order to detect specific antibodies during a subsequent incubation. The enzymatic reaction is then stopped by adding a Stop Solution which changes to yellow the blue colour developed into the wells. The amount of colour is directly proportional to conjugated monoclonal antibodies present on the wells and in inverse proportion to specific Igs anti-t. pallidum concentration present in the patient samples. KIT COMPONENTS Package size: 96/480 tests. Component SORB A Coated Strips 12x8x1 5x12x8x1 CAL CO B Cut-Off Calibratore 1 x 2 ml 2 x 2 ml CONTROL + C Positive Control 1 x 2 ml 2 x 2 ml CONJ D Conjugate 1 x 13,5 ml 5 x 13,5 ml BUF WASH 20X E Wash Buffer 1 x 100 ml 2 x 100 ml SUBS TMB F Substrate-TMB 1 x 13,5 ml 5 x 13,5 ml H2SO4 G Stop Solution 1 x 25 ml 2 x 42 ml Package Insert 1 1 A. Coated strips Breakable strips coated with purified T. pallidum, Nichols strain, packed in sealed pouch. Place the unused strips in the pouch and reseal. B. Cut-off Calibrator Human serum, containing antibodies anti-t. pallidum with known concentration. Contain 0.09% w/w of sodium azide as preservative. Ready to use reagent. Pag BEIA Mab Syphilis Screen Ed

15 C. Positive Control Positive human serum for antibodies anti-t. pallidum. Contains 0.09% w/w of Sodium azide as preservative. Ready to use reagent. D. Conjugate Monoclonal anti-tpn47 e anti-tpn15,5 antibodies conjugated with horseradish peroxidase. Ready to use reagent. E. Wash Buffer Buffered salt solution (PBS) 20x concentrated. Contains 0,1 % di Kathon CG and Tween 20. See Preparation of reagents. F. Substrate-TMB Solution containing H2O2/TMB (Tetramethylbenzidine) in stabilizing buffer. Contains pink dye. Ready to use reagent. G. Stop Solution 1N Sulphuric acid solution. Ready to use reagent. STORAGE OF REAGENTS Store all reagents at 2-8 C avoiding exposure to light. Do not use reagents after the expiry date indicated on the label. INTERCHANGEABLE REAGENTS The Wash Buffer, Substrate-TMB and Stop Solution are common to all BEIA kits. MATERIALS/EQUIPMENT REQUIRED BUT NOT PROVIDED Microplate reader with 450/620 nm filters. Manual or automated microplate washing device. Precision pipettes with disposable tips 10,100,200,500,1000 L. Disposable pipettes and normal glassware. Distilled or deionised water. Pag BEIA Mab Syphilis Screen Ed

16 WARNINGS AND PRECAUTIONS Bring all reagents to room temperature (18-25 C) before use. Avoid wells drying through the reaction steps. Use clean glassware. Use a clean disposable pipette tip for each reagent. Use a clean disposable pipette tip for each sample. If the Substrate-TMB shows a change from pink to blue colour, discard the reagent. Every analytical run should include control samples in order to validate the results, according to criteria and procedures established by each laboratory. Periodical maintenance and calibration of pipettes and microplate reader are required. AUTOMATION The test can be performed on automated ELISA processor. Please refer to specific instrument manual for proper applications. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION The test can be performed on serum or plasma (heparin EDTA). Specimens may be stored refrigerated at 2-8 C up to 5 days. For longer storage they should be aliquoted and stored frozen at 20 C. Avoid repeated thawing and freezing. Do not use haemolyzed, lipemic or turbid specimens. PREPARATION OF REAGENTS Wash Buffer (20 X) Dilute 1:20 the content of the Wash Buffer bottle with distilled or deionised water. The diluted Wash Buffer is stable 15 days when stored at 2-8 C; in any case, do not use it after expiry date printed on the original label. If crystallization occurs in the concentrated Pag BEIA Mab Syphilis Screen Ed

17 Wash Buffer, warm the solution to 37 C before diluting. Only dilute the quantity necessary for the assay. WASHING CYCLES Both using a microplate washer and washing the plate manually, perform the following steps. 1. Empty the wells 2. Fill them with 300 µl of Wash Buffer. 3. Empty the wells 4. Repeat steps 2 and 3 for other 3 cycles 5. Dry the rim of the wells with blotting paper at the end of the washing cycles. ASSAY PROTOCOL Allow all reagents to reach room temperature leaving them at least minutes at C. If strips coming from more microplate, although of the same lot, are run, the Cut-off Calibrator should be analysed for each group of strips. 1. Select the number of strips required for the assay according to the number of samples to be assayed, the Positive Control and the Cut-off Calibrator (see paragraph Summary of protocol below). Reseal the pouch. 2. Dispense 100 µl of Cut-off Calibrator, Positive Control, and of the samples. 3. Incubate the plate at room temperature (18-25 C) for 60 minutes. 4. Perform a washing cycle following the suggested procedure (see Washing Cycles). 5. Dispense 100 µl of Conjugate in each well. 6. Incubate the plate at room temperature (18-25 C) for 30 minutes. 7. Perform a washing cycle following the suggested procedure (see Washing Cycles). 8. Dispense 100 µl of Substrate-TMB in each well. Pag BEIA Mab Syphilis Screen Ed

18 9. Incubate the plate at room temperature (18-25 C) for 15 minutes. 10. Stop the chromogenic reaction dispensing 100 µl of Stop Solution into each well. 11. Read the optical density in bi-chromatism at 450/620 nm. CALCULATION AND INTERPRETATION OF RESULTS RUN VALIDATION CRITERIA Criteria used to validate the obtained results are the following: The OD for the Cut-off Calibrator must be The A.I. of Positive Control must be 0.6 If the above criteria are not met, the run is invalid and the results cannot be reported without a documented critical review of the data. The not conformity must be addressed and treated according to each laboratory s Quality Assurance procedures. Each lab should establish and follow its own internal Quality Control procedures and use the QC results to validate runs and manage non conformities. CALCULATION OF RESULTS In order to correlate the analytical results to the immunity of the sample results should be determined calculating the antibody index (A.I.) using the following formula: OD sample Antibody Index (A. I.) = OD Cut-Off For the Cut-off Calibrator calculate, if assayed in duplicate, the mean OD value (OD). The data below show typical results for the test. These data are intended as an example only and should not be used to calculate results from another run. Pag BEIA Mab Syphilis Screen Ed

19 1ª O.D. 2ª O.D. O.D. A.I. Cut-off Calibrator Positive Control Sample A Sample B Sample C INTERPRETATION OF RESULTS Results from our clinical trials, performed on samples representative of the European population, suggest the following interpretative criteria: A.I. < 0.9 > INTERPRETATION Sample should be considered POSITIVE for the presence of anti-t.pallidum antibodies. Sample should be considered NEGATIVE for the presence of anti-t.pallidum antibodies. GREY ZONE: Sample should be considered BORDERLINE for the presence of anti-t.pallidum antibodies. All samples found positive must be tested again. If the positive result isn t confirmed, the sample must be considered not reactive for the antibodies to T. pallidum. Please consider that: - The test only detects specific Igs antibodies. It cannot per se and univocally be referred to as evidence of infection. - A medical decision cannot be made on the basis of a single test result but should be grounded on all the available clinical data. Discrepancies in clinical data should be clarified prior to final decisions, also, if necessary, by confirmatory or 2 nd level test. - Results within grey zone should be made clear: re-testing the same sample; testing a sample from another collection from the same patient; comparing the results with those of a reference test. Pag BEIA Mab Syphilis Screen Ed

20 PERFORMANCE DATA Warning: Data below do not represent the performance specifications of the kit, but only experimental evidence that the performance of the kit is within such specifications, as intended by the manufacturer. SENSITIVITY The sensitivity was assessed by testing 51 specimens from patients with diagnosed Syphilis infection. 51 specimens were observed positive for the presence of antibodies anti-t. pallidum. The sensitivity is of 100.0%. SPECIFICITY The specificity was assessed by testing 692 specimens from a population expected to be negative for Igs to Treponema pallidum The specificity was evaluated comparing the BEIA Mab Syphilis Screen results versus an established Hemoagglutination commercial kit (TPHA) and a EIA kit with acceptable performances. 691 specimens were found negative for the presence of antibodies anti- T. pallidum with the BEIA Mab Syphilis Screen. The specificity is of 99.85%. ANALYTICAL SPECIFICITY No interference has been observed in samples with hemoglobin up to 10 mg/ml, bilirubin up to 1 mg/ml, triolein up to 30 mg/ml. Lipemic, turbid or hemolyzed samples, however, should not be used. REPEATABILITY The within-run and run-to-run variability were determined using one negative sample with A.I. of 2.0 and two positive samples, with A.I. of 0.7 and 0.3. These samples were tested 6 times per single run in 12 different analytical runs. Coefficients of variation lower than 20% have been obtained for the negative sample and lower than 10% for the two positive samples. LIMITATIONS Bacterial contamination or repeated freeze-thaw cycles of specimens may affect the detectable levels of specific Immunoglobulins. Pag BEIA Mab Syphilis Screen Ed

21 GENERAL DIRECTIONS FOR A SAFE USE Keep the laboratory clean and tidy and strictly follow the procedural directions. Do not eat, drink, smoke or apply cosmetics in a clinical lab. Do not pipette solutions or samples by mouth. Wear disposable gloves and overalls when handling reagents and samples. Avoid direct contact. Wash hands thoroughly after assay. Thoroughly clean working area with proper detergent solutions. Collect solid and liquid waste material in proper containers and provide for disposal according to the local regulations. Periodically check contamination level of operators and rooms. Reagents containing serum All components of human origin have been tested and found negative for HbsAg, anti-hcv and anti-hiv antibodies. Since no known test can guarantee, however, that products derived from human blood will not transmit Hepatitis, AIDS or other infectious diseases, these reagents should be handled as hazardous material. Hazardous Reagents Stop Solution (Council Directive 88/379/EEC) R36/38 Irritating to eyes and skin. S26 In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water, and seek for medical advice. Pag BEIA Mab Syphilis Screen Ed

22 SUMMARY OF PROTOCOL Prepare reagents Dispense: 100 L of Cut-off Calibrator in duplicate 100 L of Positive Control in duplicate 100 L of samples in single or duplicate Incubate 60 minutes at R.T. (18-25 C) Perform 4 washing cycles Dispense 100 L of Conjugate Incubate 30 minutes at R.T. (18-25 C) Perform 4 washing cycles Dispense 100 L of Substrate-TMB Incubate 15 minutes at R.T. (18-25 C) Dispense 100 L of Stop Solution Read the O.D. at 450/620nm A CC P5 B CC C PC D PC E P1.. F P2.. G P3.. H P4 Pag BEIA Mab Syphilis Screen Ed

23 REFERENCE - BIBLIOGRAFIA - L.Lewis et al: Evaluation of immunoglobulin M Western Blot analysis in the diagnosis of congenital syphilis. J. Clin. Mirobiolol. 28: 296 (1990). - G.Dettori, R.Grillo, et al.: Evaluation of western immuno-blotting technique in the serological diagnosis of human syphilitic infections. Eur. J. Epidemiol. 5 :22 (1989) - G.B. Wisdom: Enzyme-Immunoassay. Clin.Chem. 22:1243 (1976) - S.A. Lukehart: Identification and characterization of Treponema pallidum antigens by monoclonal antibodies. in: Monoclonal Antibodies, Academic Press 1986, p.1. - S.Norris, S. Sell Antigenic complexity of Treponema pa-lidum : antigenicity and surface location of major polipeptide. The Journ. of Immun. 133 : A.A. Codd, M.S. Sprott et al. Competitive enzyme-linked immunosorbent assay for Treponema pallidum antibodies. J. Med. Microbiol. 26:153 (1988). - P.A. Hanff, S.J. Norris et al. Purification of Treponema pallidum, Nichols strain, by Percoll density gradient centrifugation. Sexually Trasmitted Diseases 11:275 (1984). - J.D. Radolf, N.R. Chamberlain et al. Identification and localization of integral membrane proteins of virulent Treponema pallidum by phase partitioning with the nonionic detergent Triton X-114. Infect. Immunity 56:490 (1988). Pag BEIA Mab Syphilis Screen Ed

24 NOTE Pag BEIA Mab Syphilis Screen Ed