La Diagnostica Biomolecolare. Eugenio Benvenuto

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1 UTS BIOTECNOLOGIE, Sezione UTS BIOTECNOLOGIE, Sezione Genetica e Vegetale La Diagnostica Biomolecolare Eugenio Benvenuto Genetica e Genomica Genomica Vegetale

2 LA DIAGNOSTICA BIOMOLECOLARE Definizione : La diagnostica di biomolecole (principalmente acidi nucleici e proteine) utilizzando metodiche avanzate di biologia molecolare, biochimica ed immunologia.

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4 Metodi convenzionali per la diagnostica alimentare (di tipo microbiologico) Isolamento e conta di cellule batteriche vitali su specifici mezzi di coltura Saggi fisico-chimici (misura di cambi nel mezzo di coltura provocati dalla crescita o dal metabolismo batterico) : - Cambio della conduttivita in mezzo di coltura ( es. Bactometer biomérieux) - Bioluminescenza e fluorescenza Saggi biochimici miniaturizzati (es. Enterotube II -Becton Dickinson-, Enterobacteriace II -Becton Dickinson-, Micro-ID Listeria -Organon-)

5 Metodi convenzionali per la diagnostica alimentare BIOLOG identification system, Capacita di metabolizzare un panel di 95 differenti fonti di carbonio Saggi immunologici, basati sulla reazione antigeneanticorpo utilizzati per l identificazione e la subtipizzazione batterica - Saggi di Immunofluorescenza - Saggi ELISA Test basati sugli acidi nucleici - Sonde di DNA (Ibridazione) - Saggi di amplificazione PCR

6 Necessita di metodiche sempre piu rapide, precise e che abbraccino in maniera parallela piu analiti _ N di campioni, analiti e precisione + Tempo

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8 Viruses Archea Bacteria Yeasts [3] Schizosaccharomyces pombe, [16] Saccharomyces cerevisiae Nematoda [ 6] Caenorhabditis elegans Algae [ 3] Guillardia theta nucleomorph genome Plasmodia [14] Plasmodium falciparum Fungi [11] Encephalitozoon cuniculi genome Mammals [24] Homo sapiens, [21] Mus musculus, [12] Rattus norvegicus (rat) Insects [ 5] Anopheles gambiae, [ 5] Drosophila Plants COMPLETELY SEQUENCED GENOMES [x] Chromosome number melanogaster [ 5] Arabidopsis thaliana Fonte: NCBI, 2004

9 Le parole chiave della genomica che vanno incontro alle esigenze della diagnostica molecolare sono: Alta processivita (high throughput) Metodologie di analisi parallela su larga scala

10 Metodi innovativi per la diagnostica alimentare Basati su: amplificazione del DNA mediante PCR o Real- Time PCR anticorpi ricombinanti (Librerie di anticorpi sintetici in formato di single chain Fv ) tecnologie Microarray -DNA chips - Protein chips

11 Vantaggi della Polymerase chain reaction PCR Estremamente sensibile e precisa Estremamente rapida (poche ore) Puo essere utilizzata per rilevare microrganismi difficili da coltivare in laboratorio o estremamente pericolosi

12 Analisi quantitativa in REAL TIME Ciclo termico molto rapido Termostatazione ad aria Mantenimento uniforme della temperatura all interno dei capillari Tempi di esecuzione delle analisi molto rapidi (30-40 cicli di PCR vengono completati in minuti). LightCycler System

13 Fluorescence based probes for Real Time PCR FRET Taqman

14 Advantages of Microarrays technology Miniaturized and parallel assay system Large scale and highthroughput biological analysis Rapid

15 First molecular multi-detection test for food and feed analysis: FoodExpert ID Test, biomerieux -Affimetrix Genechip Technology Based on high density DNA chip which supports oligonucleotide DNA probes (17 nucleotides long) Synthesized on the surface of the chip by photolithography Probes complementary to specificregions of vertebrate Cytochrome b gene Can identify 3 classe of vertebrates, mammals fishes and birds and 33 species of animals, regardless of whether the food is raw or processed. Sensitivity: 0.01% of the total weight, validated at 5% w/w

16 FoodExpert ID Test, Test principle High density DNA chip, GeneChip Extraction of DNA and PCR Transcription and labeling Hybridization on the chip Scan Several examples: Absence of animal by-products in livestock feed Verification of absence of animal food for vegetarians..

17 Un sistema 'immunitario' sintetico per la produzione di reagenti specifici ad alta stabilità BIOTEC GEN

18 Anticorpi come reagenti Capacità di legare un antigene con alta affinità e specificità

19 APPLICAZIONI Identificazione di marcatori in vivo o in vitro Coniugazione con isotopi radioattivi o molecole citotossiche Cromatografia Immunoprecipitazione Cristallografia Immunolocalizzazione Immunomodulazione Proteomica

20 Tecnologia dell ibridoma Alti costi Infrastrutture appropriate Lunghi tempi di lavoro Problemi etici

21 Anticorpi ricombinanti Fd -S-S- Fab VL CL VH CH1 CH2 -S-S- -S-S- --S-S-- -S-S- CDRs scfv CH3 -S-S- -S-S- -S-S- F(ab )2

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23 Protein chip based technology Antibody chip Sera+Antibodies Antigen-Antibody Antigen chip Antibodies Antigen-Antibody Protein-Protein Protein-Liposome Protein Chip Protein-Drug

24 Antigen Chip-based allergy diagnosis

25 A multi-allergen test system based on microarrayed recombinant allergens for component-resolved allergy diagnosis. (A) A standard calibration curve of purified human IgE and recombinant tree pollen allergens (Bet v 1, Bet v 1m, Bet v 1a, Bet v 2, Aln g 1, and Cor a 1), recombinant food allergens (Dau c 1, Mal d 1, and Api g 1), recombinant grass pollen allergens (Phlp 1, Phlp 2, Phlp 5, Phlp 6, and Phl p 7), recombinant mould allergens (Alt a 1 and Alt a 2), and recombinant latex allergens (Hew b 3, Hev b 5, Hev b 6, Hev b 7, Hev b 8, Hev b 9, and Hev b 10) were spotted in triplicates on the allergen chip. GD: guideline dots for scanning. (B) Image of a pollenallergic patient with IgE reactivity to rbet v 1, r Aln g 1, rcor a 1, rphl p 2, and rphl p 5. (C) Image of a non-allergic individual (control).

26 Science (2002), Vol. 295

27 Prospettive Future Nanobiotecnologie, le tecnologie che si basano sulla manipolazione di biomateriali per costruire dispositivi diagnostici delle dimensioni di un miliardesimo di metro Previsione di dispositivi 1000 volte piu economici degli attuali 100 volte piu sensibili delle tecniche diagnostiche convenzionali Maggiore semplicita di analisi Non necessitano di alcuna reazione di amplificazione di PCR, riducendo ulteriormente tempi