La caratterizzazione molecolare. Licia Laurino UOC Anatomia Patologica TREVISO
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1 La caratterizzazione molecolare Licia Laurino UOC Anatomia Patologica TREVISO
2 I patologi SONO QUI (anonimi) Diagnostica di recidiva Diagnostica pre operatoria Diagnostica Post operatoria
3 Parametri prognostico predittivi utilizzati per la scelta terapeutica Predittivi PR ER ki67 HER2 Età dimensione stato linfonodale Grado LVI Prognosi 8 su 9 determinati dal patologo
4 Problematiche 1. Accutatezza e riproducibilità dei parametri grado, LVI, dimensioni, ER/PR, ki67, HER2 2. Limitata capacità di questi parametri nel predire l outcome e la risposta terapeutica per la singola paziente Tumori con caratteristiche simili possono avere comportamento clinico differente
5 Preanalitica Determinazione corretta di ER, PR, ki67, HER2 Segnalare tempo di ischemia fredda fissazione immediata in formalina tamponata 10% Invio immediato, preferibilmente a «fresco», del pezzo operatorio in AP < 30 min Analitica smascheramento Scelta piattaforme e clone Controlli di reazione Postanalitica Interpretazione dei risultati
6 Preanalitica Fissazione ideale : 6 72h 6 24 h core biopsy h pezzi operatori L iperfissazione si può correggere (con smascheramento antigenico adeguato) L ipofissazione non si corregge
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8 Analitica Piattaforme automatizzate: Ventana BenchMarck : 10 centri Leica BOND : 7 centri Dako Autostainer : 2 centri Anticorpi (cloni) legati alla piattaforma
9 Interpretazione Controllo interno di avvenuta reazione Ghiandole normali per ER PR Linfociti per ki67 Per fissazione Per seduta invalida ER
10 ER+ 90%
11 ER+ 90%
12 Come li valutiamo? Qualsiasi positività! anche 1%
13 Ki67: l incubo 1 problema: scelta dell anticorpo MIB1: clone storico, sul quale si sono basati i principali trial clinici fino ad ora Dowsett et al Altri cloni disponibili in commercio, legati alle diverse piattaforme (clone 30 9 Ventana; clone MM1 Leica Bond) che funzionano altrettanto bene ma che richiedono una validazione nel Laboratorio
14 Stesso tumore con Ab diversi per ki67 Clone 30 9 Piattaforma Ventana Clone MIB1 Piattaforma DAKO
15 Stesso tumore con Ab diversi per ki67 Clone 30 9 Piattaforma Ventana Clone MIB1 Piattaforma DAKO
16 Ki67: l incubo 2 problema: Interpretazione risultati % di cellule positive (indipendentemente dall intensità) alla periferia della neoplasia su almeno 3 campi non selezionati Includere hot spot Contare almeno 500 cellule neoplastiche Oneroso e forse poco riproducibile Utilizzo di sistemi di analisi di immagine per la conta
17 Interpretazione ki67
18 Interpretazione ki67
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21 GiPaM 2014, Consensus AIOM/SIAPEC 2014 (BICE) Ex 0 Ex 2+ Ex 1+
22 3+ 0
23 casi 2+ Ibridazione in situ (ISH) 2+ Ex 0 Ex 1 FISH IIC HER2 2+ CISH
24 FISH o CISH? Rilevazione della proteina in IIC condizionata da: Ischemia fredda Durata fissazione Tecniche di processazione Temperatura paraffina Il DNA dell HER2 è meno sensibile della proteina falsi negativi sono minori Rischio di falsi positivi, se valutata componente in situ CISH visione in chiaro, come un preparato di IIC
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27 Determinazione immunofenotipica Up front su core biopsy Scelta della CT neoadiuvante IORT: cosa andiamo a trattare? (pianificazione svuotamento del cavo in caso di micrometastasi al SLN sulla base della biologia del tumore) Su core biopsy sempre quando lo richiede il clinico Mandatoria su pezzo operatorio (se non precedentemente determinata su core) Mandatoria dopo neoadiuvante Mandatoria su ripresa di malattia Vantaggi core biopsy: fissazione controllata Svantaggi: sampling limitato
28 Determinazione immunofenotipica Se già effettuata su core biopsy, ripetere sempre anche su pezzo operatorio? Non necessariamente se frustoli rappresentativi (almeno 3 4 con ago 14 G) con buona qualità della reazione c è concordanza tra morfologia e profilo immunofenotipico concordanza tra morfologia della biopsia e del pezzo operatorio (non eterogeneità tumorale/ cloni diversi)
29 concordanza Ripetere R0 se negativi su bio Discordanze solo su IIC2+ e equivoci in FISH
30 Resta fuori il ki67 ripetiamo su pezzo operatorio? Pezzo operatorio permette di valutare meglio la distribuzione ki67 (omogenea o a hot spot) Se omogenea, la valutazione non dovrebbe discostarsi quella della core biopsy non necessariamente migliora la nostra capacità di valutazione
31 Momento autocelebrativo Controllo di Qualità dal 2009 confronto interistituzionale di immunoistochimica Gruppo regionale patologi dello screening della mammella
32 8.000 geni 65 casi di tumore Classificazione molecolare Perou et al, Nature 2000
33 Applicazioni potenziali di gene expression profiling Classificazione tumorale prognosi Risposta alla terapia endocrina Adiuvante Neoadiuvante Targeted therapy Assay molecolari stratificazione del rischio predire la prognosi risposta alla terapia costo
34 Luminal A: espressione di geni o proteine correlati alla regolazione ormonale (ER PR) e alla proliferazione/ciclo cellulare Luminal B: > espressione geni o proteine correlati alla proliferazione/ciclo cellulare < espressione di geni luminal come PR e FOXA1 20% geni correlati a HER2 HER2: espressione di geni correlati a HER2 espressione di geni correlati alla proliferazione espressione intermedia di geni luminali Basal type: Sottotipi intrinseci espressione di geni correlati alla proliferazione Espressione di cheratine basali di alto peso (5 14)
35 Luminal A: espressione di geni o proteine correlati alla regolazione ormonale (ER PR) e alla proliferazione/ciclo cellulare Luminal B: > espressione geni o proteine correlati alla proliferazione/ciclo cellulare < espressione di geni luminal come PR e FOXA1 20% geni correlati a HER2 HER2: espressione di geni correlati a HER2 espressione di geni correlati alla proliferazione espressione intermedia di geni luminali Basal type: Sottotipi intrinseci espressione di geni correlati alla proliferazione Espressione di cheratine basali di alto peso (5 14)
36 ER, PgR, ki67 e HER2 = surrogato dei sottotipi intrinseci
37 PgR <20% Ki67>14 Ki % Ki67>20% Il tentativo di surrogare la distinzione tra luminal A e B, anche cambiando i cut off, è risultata poco attendibile nonostante lo sforzo di perfezionare i criteri
38 St Gallen 2015 biomarcatori hanno una scarsa capacità di surrogate i sottotipi luminal A e luminal B: ovvero Identificare il subset di pz ER+, HER2, N0/N1a per le quali non è necessaria la chemioterapia
39 Parametri prognostici/predittivi classici Therapy response PGR ki67 ER Grado 10 parametro prognostico predittivo HER2 Assay molecolare Età dimensione stato linfonodale LVI Prognosis
40 In conclusione i parametri clinico patologici convenzionali (ER,PR,KI67 e HER2) costituiscono attualmente la baseline per la scelta della terapia Consentono di selezione dei casi elegibili agli assays molecolari nell ottica di un trattamento tailored Le fasi preanalitica, analitica e di interpretazione vanno correttamente condotte Importanza dei QC interlaboratorio I assay molecolari sembrano essere in grado di identificare meglio il sottotipo, la stratificazione del rischio, la risposta alla terapia e la prognosi (aspettiamo risultati definitivi dei trial clinici MINDACT e TAILOx)
41 Rossi Maria
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