Tassonomia. - Classificazione. - Nomenclatura. - identificazione

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1 Tassonomia - Classificazione - Nomenclatura - identificazione

2 Definizione di specie Criterio biologico: Gruppo di popolazioni naturali interfertili che sono incapaci di incrociarsi o riprodursi con successo con altre popolazioni NON APPLICABILE AI BATTERI Criterio morfologico: Il più piccolo insieme di popolazioni naturali permanentemente separato dagli altri da una ben distinta discontinuità di caratteri

3 In pratica, la specie è costituita da un gruppo di ceppi con un alto grado di somiglianza e con significative differenze rispetto ad altri gruppi CEPPO: popolazione che discende da un unico microrganismo isolato in coltura pura Può presentare delle differenze con altri ceppi appartenenti alla stessa specie

4 Colture e colture pure Coltura: insieme della popolazione cresciuta in una provetta, piastra, beuta o altro Coltura pura: la popolazione in coltura è costituita da un solo ceppo Si può ottenere da una popolazione mista se si trasferiscono in una nuova coltura i batteri di una colonia isolata (tecnica di isolamento su piastra)

5 isolamento su piastra

6 Somiglianza Il modo di rilevare la somiglianza è cambiato nel tempo: Si è passati dal confronto di caratteri fenotipici a quello della sequenza del DNA Le conoscenze ottenute con i nuovi metodi vengono incorporate nelle definizioni di specie preesistenti

7 Sistema fenetico: tipologia dei caratteri utilizzati Morfologia delle cellule forma presenza e localizzazione di spore e flagelli inclusioni colorazione di Gram Morfologia delle colonie colore dimensione forma e margini Fisiologia t e ph di crescita conc salina richiesta di O 2 Biochimica conservazione dell energia presenza ed attività di enzimi capacità di metabolizzare vari composti produzione di metaboliti particolari

8 Sistema fenetico caratteri utilizzati ed anche patogenicità caratteristiche antigeniche ecologia. altro

9 Carboidrati utilizzati come unica fonte di carbonio

10 Test di fermentazione Al terreno vengono aggiunti uno zucchero ed un indicatore di ph La fermentazione dello zucchero provoca la produzione di acido ed il cambiamento di colore dell indicatore

11 Valutazione dei test fenotipici: tassonomia numerica o adansoniana I microrganismi vengono classificati sulla base della somiglianza globale, dando, almeno inizialmente, a tutti i caratteri lo stesso peso Richiede molti calcoli, si è sviluppata dal in poi, grazie alla disponibilità di computer ed allo sviluppo di metodi di calcolo (Sneath e Sokal).

12 metodi della tassonomia numerica 1. Selezionare diversi ceppi (in coltura pura) 2. Selezionare ed eseguire i test ( test) 3. Codificare i risultati (+/-) 4. Analizzare la somiglianza (coefficienti di similitudine) 5. Raggruppare in cluster (formazione di un albero gerarchico tassonomico) 6. Definire le caratteristiche dei cluster

13 coefficienti di similitudine Se ne possono usare diversi: ad es. il coefficiente di Jaccard Coeff. di Jaccard a= concordanti b= discordanti

14 Costruzione del dendrogramma E difficile stabilire quale deve essere il livello di somiglianza degli appartenenti ad una specie >80% valore accettato Non è detto che il dendrogramma rispecchi la filogenesi

15 metodi della tassonomia numerica 1. Selezionare diversi ceppi (in coltura pura) 2. Selezionare ed eseguire i test ( test) 3. Codificare i risultati (+/-) 4. Analizzare la somiglianza (coefficienti di similitudine) 5. Raggruppare in cluster gli individui simili taxa. Il livello di somiglianza idoneo a definire una specie può essere variabile. Il valore medio accettato è 80% 6. Definire le caratteristiche dei cluster

16 Data-base con la percentuale di positività ai singoli test di alcune Enterobatteriacee

17 caratteri fenotipici corrispondono al 5-10% dell informazione contenuta nel DNA I test sono stati sviluppati per gli organismi che si conoscono meglio, ma non è detto che siano adeguati per tutti L espressione può variare I metodi più recenti sono basati sull analisi degli acidi nucleici

18 Metodi di classificazione basati sull analisi degli acidi nucleici Determinazione della composizione in basi nucleotidiche (% G+C) Ibridazione DNA/DNA Analisi della sequenza di geni conservati

19 G+C = x 100 A+T+G+C Percentuale G+C

20 Metodi per determinare la percentuale G+C Coefficiente di densità t di denaturazione Due ceppi possono avere percentuali G+C simili, ma sequenze completamente diverse: con questo metodo si individuano bene le diversità tra ceppi, ma non le somiglianze Ceppi appartenenti alla stessa specie: Δ t m < 5 C

21 ibridazione DNA/DNA Viene valutata l omologia del DNA genomico, attraverso la misura dell ibridazione del DNA totale estratto dai batteri Si considerano due ceppi per volta: un ceppo di riferimento ed uno in esame Esistono diversi metodi: - misura della Tm - ibridazione su filtro -

22 Ibridazione su filtro Ceppo in esame Ceppo di riferimento

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24 Gli appartenenti ad una specie hanno una % d ibridazione DNA/DNA > 70% L ibridazione DNA/DNA è il metodo di riferimento per stabilire se due ceppi appartengono alla stessa specie Questo metodo è utile a livello di specie e di genere, poi (famiglia e oltre) la somiglianza è troppo bassa

25 Metodi di classificazione basati sull analisi degli acidi nucleici Determinazione della composizione in basi nucleotidiche Ibridazione DNA/DNA Analisi della sequenza di geni conservati permette l analisi filogenetica

26 Analisi filogenetica La distanza evolutiva tra due specie può essere misurata valutando le differenze nella sequenza nucleotidica di geni omologhi. " Questi devono essere: Universalmente distribuiti Funzionalmente omologhi Allineabili Le variazioni devono avvenire con velocità adeguata a quella della distanza evolutiva che si vuole analizzare

27 Analisi della sequenza di geni conservati Esempi di geni utilizzati Determinanti genici di : rrna 16S RecA Citocromo c ATP sintetasi

28 Vantaggi del gene rrna 16S Universalmente distribuito Deve assumere una determinata struttura tridimensionale per assolvere alla sua funzione (importante), quindi ha un basso tasso di mutazione Dimensioni adeguate Ha regioni conservate che consentono l allineamento

29 Analisi filogenetica rrna 16S rrna 18S

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31 Sequenze tipizzanti (signature sequences)

32 Analisi filogenetica " " " " " "X "CGUAGACCUGAC" "X1 "CCUAGACCUGAC" "X2 "CCUAGACCUGGC" "X3 "CCUAGAGCUGGC" "XA "CGUAGTCCUGAC" Il n di differenze è proporzionale al n di mutazioni fissate

33 Distanza evolutiva e alberi filogenetici

34 Specie e sequenze rdna 16S Due isolati che appartengono alla stessa specie hanno generalmente un identità di sequenza dell rdna 16S 97% Questo metodo è meno sensibile dell ibridazione DNA/DNA

35 albero filogenetico universale

36 Tassonomia polifasica Integrazione tra i diversi tipi di dati (analisi genotipica, fenotipica e filogenetica) SPECIE: Insieme di isolati originati da un progenitore comune, Successivamente diversificati in cloni con differenti gradi di ricombinazione Caratterizzati da un certo grado di omogeneità fenotipica (valore indicativo: 80%) Con un significativo grado di ibridazione DNA/DNA (valore indicativo: 70%) e un Δ t m < 5 C Con un identità della sequenza rrna 16S > 97%

37 Classificazione gerarchica Escherichia coli Dominio Bacteria Phylum Proteobacteria Classe Gammaproteobacteria Ordine Enterobacteriales Famiglia Enterobacteriaceae Genere Escherichia Specie E. coli Posso indicare anche il ceppo: (es: E. coli O157:H7)

38 Nomenclatura Segue lo schema binomiale di Linneo Escherichia coli Nuove specie pubblicate su: International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (ex International Journal of Systematic Bacteriology)

39 Testo di riferimento Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (ora si sta preparando/pubblicando la seconda edizione)

40 Bergey s Manual

41 Ceppi di riferimento Ceppi depositati in collezioni, che servono da riferimento per chi lavora Ceppo Tipo: esempio permanente di che cosa s intende per una data specie. E il ceppo proprietario del nome, ma non necessariamente il più rappresentativo. Es: Acinetobacter baumannii ATCC T Collezioni: ATCC American Type Culture Collection (Manassas, Virginia) NCTC National Collection of Type Cultures (Londra) Molte altre in tutto il mondo

42 Conservazione a lungo termine dei ceppi batterici Congelamento In azoto liquido (-196 C) o in freezer meccanico a -80 C Con un agente crioprotettore (DMSO o glicerolo) Liofilizzazione

43 Identificazione Principi per l identificazione Partire da una cultura pura del ceppo Determinare le caratteristiche generali chemiotrofo/fototrofo aerobio/anaerobio morfologia, presenza di strutture particolari (spore, flagelli ecc) test fondamentali: Gram, catalasi, ossidasi, O/F Restringere progressivamente il campo ed applicare i test appropriati al sottogruppo individuato Confrontare con ceppi di riferimento

44 Identificazione Scelta di test discriminanti

45 Identificazione Test A Test B Test C Escherichia coli Serratia marcescens Isolato sconosciuto Probabilità per E. coli Probabilità per S. marcescens 0,99 0,44 0,80 0, ,10 0,75 0,99 0,07425 Probab. complessiva (prodotto delle prob. singole)

46 Identificazione Probabilità per E. coli Probabilità per S. marcescens Test A Test B Test C Complessiva 0,99 0,44 0,80 0, ,10 0,75 0,99 0,07425 Punteggio di identificazione (P) P= p 1 p 1 +p 2.+p n Punteggio di identificazione E. coli 82,4% S. marcescens 17,5%

47 Kit miniaturizzati multitest

48 Identificazione: metodi molecolari

49 Scarsa coltivabilità di microrganismi in natura

50 Uso di sonde molecolari a DNA FISH: Fluorescent in-situ hybridization Bacillus megaterium Saccharomyces cerevisiae Sonda universale Sonda per eucarioti

51 Analisi della struttura di una comunità microbica

52 Amplificazione degli acidi nucleici mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) Permette di produrre molte copie delle molecole di rdna16s presenti nel campione (in modo da poter ottenere le loro sequenze)

53 Esempio di risultato Spesso si amplifica DNA di specie non ancora descritte