Valutazione dell incertezza di misura in ambito microbiologico

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1 Valutazione dell incertezza di misura in ambito microbiologico Angela Maiello Dino Spolaor Associazione Italiana Allevatori 6 MEETING LABORATORI SETTORE LATTIERO CASEARIO Montegrotto Terme, 1- dicembre 005

2 DOCUMENTI di RIFERIMENTO UNI CEI EN ISO/IEC 1705:000 Requisiti generali per la competenza dei laboratori di prova e di taratura UNI CEI ENV 13005:000 - Guida all espressione dell incertezza di misura MIKES - Centre for metrology and accreditation, Publication J4/003, Uncertainty of quantitative determinations derived by cultivation of microorganisms, Seppo I. Niemela ISO 718:1996/Amd. 1:001 - Microbiology of food and animal feeding stuffs General rules for microbiological examination UNI ENV ISO 13843:003 Qualità dell acqua Guida per la validazione di metodi microbiologici

3 ISO 718:1996 (1) CALCOLO DEL CONTEGGIO (n piastre di più diluizioni) Caso generale N C = V(n 0,1n 1 + )d V = volume (ml) dell inoculo distribuito in ciascuna capsula n 1 = numero di capsule della prima diluizione considerata n = numero di capsule della seconda diluizione considerata d = diluizione (capsula n 1 ) 3

4 DATI CONTE (test di valutazione preliminare) Prima diluizione (10-3 ) Piastra 1 n. colonie 50 Piastra n. colonie - Seconda diluizione (10-4 ) Piastra 1 n. colonie 5 Piastra n. colonie

5 RISULTATI Partecipante Conteggio 1 Conteggio Conteggio 3 Conteggio 4 Conteggio 5 Conteggio 6 ERRORI A,5 x 10 5,5 x 10 5,5 x 10 5,5 x 10 5,5 x 10 5,5 x 10 5 OK B,5 x ,15 x 10 5,05 x ,6 x ,37 x 10 5,5 x 10 5 calcolo arrotond. C 75 x x x x x x 10-3 calcolo arrotond D,5 x 10 6,4 x 10 6,5 x 10 6,4 x 10 6,5 x 10 6,5 x 10 6 esponente arrotond. E,5 x 10 6,4 x 10 6,5 x 10 6,4 x 10 6,5 x 10 6,5 x 10 6 esponente arrotond. F arrotond. G arrotond. H OK I calcolo L,5 x 10 5,5 x 10 5,5 x 10 5,5 x 10 5,5 x 10 5,5 x 10 5 OK M,5 e+5,45 e+5,5 e+5,45 e+5,45 e+5,5 e+5 arrotond. N 50 x x x x x 10 3 calcolo arrotond. O,5 x 10 5,5 x 10 6,5 x 10 6,5 x 10 6,5 x 10 6,5 x 10 6 esponente P Q calcolo arrotond. calcolo arrotond. 5

6 DISTRIBUZIONE DEI DATI VALORE CORRETTO: VALORI NON CONFORMI: 68% MINIMO: MASSIMO: ( ) Intervallo di fiducia:

7 INTERVALLO DI FIDUCIA Intervallo di fiducia: intervallo di valori entro il quale con un definito livello di fiducia si trova il valore vero di un dato parametro di una popolazione Livello di fiducia: valore della probabilità associata ad un intervallo di fiducia o ad un intervallo statistico di copertura limite superiore: valore estremo superiore dell intervallo di fiducia limite inferiore: valore estremo inferiore dell intervallo di fiducia 7

8 ISO 718:1996 INTERVALLO DI FIDUCIA δ = B C + 1,9 B ± 1,96 B C 1 d dove ( ) B = V n + 0,1n 1 8

9 MODULO PER L'INSERIMENTO DEI DATI ANALITICI Analista Codice prova Codice campione Prima diluizione utile 1 a diluizione Piastra 1 1 a diluizione Piastra a diluizione Piastra 1 a diluizione Piastra Conferma colonie P = piastra C = campione UFC/g-ml Limite inferiore UFC/g-ml ISO 718 Limite superiore UFC/g-ml ISO 718 Elisa ,4E+03 1,0E+03,0E+03 Elisa / ,0E+05 8,6E+04 1,3E+05 Elisa / ,9E+04 1,E+04,9E+04 Elisa ,E+04 6,E+04 8,5E+04 Elisa P 1,1E+04 9,7E+03 1,3E+04 Elisa ,4E+04,E+04,6E+04 Elisa 7 653/ ,8E+0 1,E+0,8E+0 Elisa 7 653/ ,1E+0,3E+0 4,E+0 Elisa 7 653/ ,8E+0,9E+0 5,1E+0 Elisa / ,1E+03 9,1E+0 1,3E+03 Elisa / ,0E+0,E+0 4,E+0 Elisa /6 1 -,1E+03 1,4E+03 3,E+03 Elisa / ,0E+0 1,3E+0 3,0E+0 Elisa / ,8E+0,0E+0 4,0E+0 Elisa ,1E+04 9,7E+03 1,E+04 Elisa ,4E+04 1,E+04 1,5E+04 Elisa ,7E+03 4,8E+03 6,8E+03 Elisa 7 654/ ,4E+04 1,E+04 1,5E+04 Elisa 7 654/ ,5E+03 1,0E+03,0E+03 Elisa 7 654/ ,5E+0 9,7E+01,4E+0 Elisa / ,E+04 4,9E+04 7,8E+04 Elisa / ,9E+0,1E+0 4,1E+0 Elisa / ,5E+03 7,9E+03 1,E+04 Elisa ,0E+08 6,0E+08 8,E+08 Elisa ,5E+08,8E+08 4,4E+08 Elisa ,3E+08 4,4E+08 6,3E+08 Elisa ,7E+08 7,5E+08 1,0E+09 Elisa ,3E+08,1E+08,5E+08 Elisa ,0E+07 6,0E+07 8,E+07 Elisa ,7E+08 3,9E+08 5,7E+08 9

10 INCERTEZZA DI CATEGORIA B COME IN ISO Con riferimento agli American Standard Methods con conte superiori a 0 UFC/g - ml Calcolo dell intervallo di fiducia Limite superiore = C + C Limite inferiore = C C 10

11 UNI Caso di conta su una sola piastra C 1 = 67 Calcolo risultato conteggio e intervallo di fiducia c i ± C i C = 67 ± 67 = 67 ± 16 11

12 Stima dell Intervallo di fiducia UNI (caso di piastre) Conte comprese tra 15 e 300 ufc per piastra I.F. = ± k p C n m n = numero di piastre (prove) C m = media delle n conte K p = fattore di copertura per p = 95% 1,96 arrotondato a,0 Limite inferiore: C m Cm -,0 c 14, m C m Limite superiore: Cm C m +0, c + 14, m C m 1

13 UNI Valutazione dei risultati di prove in parallelo C 1 = 0 C = 9 C m = 5 c 1 c 1 + c c k p = 9 7 = 13, Calcolo valore medio e intervallo di fiducia c ± 14, m C m C = 5 ± 1, 4 5 = 5 ± 7 13

14 Approcci di calcolo diversi Confronto con i laboratori di chimica - Gap in relazione all approccio metrologico tra i laboratori di chimica e quelli di microbiologia - Tendenza dei tecnici di microbiologia a trasferire nel proprio ambito esperienze e applicazioni adottate dai laboratori chimici 14

15 Problemi di applicabilità delle metodologie chimiche In chimica: i dati di misura sono variabili casuali continue che seguono il modello di distribuzione di probabilità normale In microbiologia: si opera su variabili casuali discrete (dati di conteggio) che seguono prevalentemente il modello di distribuzione di probabilità di Poisson 15

16 UNI ENV ISO 13843:003 p.to 5.3 La variazione casuale dovuta alla distribuzione non uniforme delle particelle tra campioni paralleli, persino nelle sospensioni perfettamente miscelate, è una caratteristica dei metodi microbiologici. La variazione casuale di base è inevitabile e non ha niente a che fare con le competenze tecniche o l apparecchiatura. Essa segue una legge matematica nota, la distribuzione di Poisson. Le imperfezioni tecniche e molte altre cause sono responsabili della variazione addizionale. ( ) denominata sovradispersione. 16

17 UNI ENV ISO 13843:003 p.to Le enunciazioni di precisione basate sulla distribuzione di Poisson sono molto comuni nelle norme microbiologiche. il modello di Poisson ha il vantaggio distintivo che una singola stima può essere collegata a ogni determinazione 17

18 Tendenza diffusa BASARE LA STIMA DELL INCERTEZZA DI MISURA SU DATI DI RIPETIBILITÀ E RIPRODUCIBILITÀ Problemi per le prove microbiologiche (indipendenti dall operatore) - instabilità della matrice (alimento / acqua) - variabilità dei sottocampioni (tra essi prima che nella prova) - distribuzione dei microrganismi (σ µ) 18

19 UNI ENV ISO 13843:003 p.to 4..8 Le prove collaborative sono state sviluppate in uno strumento ampiamente applicato per le prove delle caratteristiche di precisione dei metodi chimici. Sembra tuttavia prematuro raccomandare lo stesso in microbiologia. ( ) L esperienza presente è che gli esperimenti collaborativi destinati alle prove delle prestazioni dei metodi tendono a trasformarsi in prove di perizia del laboratorio ed esercizi di formazione 19

20 Valutazione delle incertezze di Categoria A (3) Per una stima attendibile di tale incertezza è opportuno disporre di un elevato numero di risultati paralleli Procedimento meno adeguato in microbiologia rispetto alle prove di chimica a causa dell instabilità dei campioni. Miglior approccio in microbiologia: stimare le singole componenti dell incertezza incertezza tipo composta 0

21 UNI ENV ISO 13843:003 p.to 9.5. Stime della precisione di tipo A Tali stime non hanno ancora fatto la loro comparsa nelle norme microbiologiche la precisione delle determinazioni microbiologiche non è costante persino in scala logaritmica, ma dipende dal numero delle colonie 1

22 MICROBIOLOGIA PRINCIPALI COMPONENTI DELL INCERTEZZA Distribuzione casuale delle cellule microbiche Volume di inoculo Diluizioni Lettura del risultato

23 Approccio per Singole Componenti Valutazioni preliminari Calcolo sperimentale della ripetibilità di dosaggio delle pipette Calcolo sperimentale della ripetibilità di dosaggio del diluente Calcolo sperimentale della ripetibilità di conteggio degli operatori 3

24 CALCOLO DELLO SCARTO TIPO DEL VOLUME DI INOCULO ANALISTA Media laboratorio Scarto tipo laboratorio Incertezza tipo relativa CV n. valori 1,00 0,016 0,017,17% ,00 0,046 0,045,45% 0 0 1,00 0,0185 0,0185 1,85% 0 0 #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! 0 0 #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! 0 0 #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! 0 0 #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! 0 0 #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! 0 0 #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! 0 Ripetizione 1 Ripetizione Ripetizione 3 Ripetizione 4 Scarto tipo DATA 00/01/1900 Pipetta 1 1,00 1,04 1,01 0,98 0,050 Analista 0 Pipetta 0,99 1,00 0,97 0,98 0,019 Media Scarto tipo Pipetta 3 1,00 1,01 1,04 1,03 0,0183 1,00 0,046 Pipetta 4 0,99 0,98 0,98 0,96 0,016 Incertezza tipo relativa CV Pipetta 5 1,00 1,05 1,0 1,00 0,036 0,045,45% Ripetizione 1 Ripetizione Ripetizione 3 Ripetizione 4 Scarto tipo DATA 00/01/1900 Pipetta 1 1,00 0,99 0,98 0,99 0,008 Analista 0 Pipetta 1,00 0,99 0,98 1,00 0,0096 Media Scarto tipo Pipetta 3 1,04 0,98 0,99 0,99 0,071 1,00 0,0185 Pipetta 4 1,03 1,00 1,00 0,98 0,006 Incertezza tipo relativa CV Pipetta 5 1,0 0,99 1,01 0,96 0,065 0,0185 1,85% 4

25 CALCOLO DELLO SCARTO TIPO DEL VOLUME DEL DILUENTE TABELLA N. 1 DATA 00/01/1900 ANALISTA 0 Autoclave 0 Bilancia cod. 0 TEMPERATURA INIZIO CICLO: 0 ORA INIZIO CICLO: 0.00 TEMPERATURA FINE CICLO: 0 ORA FINE CICLO: 0.00 TEMPERATURA LETTURA: 0 Impostazione dosatore 0 ml N. Provetta vuota con tappo Provetta con diluente prima della sterilizzazione Peso netto diluente PRE-sterilizzazione Provetta con diluente dopo sterilizzazione in autoclave Peso netto diluente POST-sterilizzazione Calo % causato dalla sterilizzazione Differenza % volume rispetto ai ml richiesti (Tolleranza +/-%) 1 16,95 6,01 9,06 5,84 8,89 1,9-1, OK 16,93 6,09 9,16 6,05 9,1 0,4 1,33 OK 3 19,7 8,87 9,15 8,63 8,91,6-1,00 OK 4 0,18 9,34 9,16 9,1 8,94,4-0,67 OK 5 18,49 7,64 9,15 7,4 8,93,4-0,78 OK 6 4,8 33,99 9,17 33,74 8,9,7-0,89 OK 7 18,93 8,09 9,16 7,80 8,87 3, -1,44 OK 8 18,19 7,36 9,17 7,13 8,94,5-0,67 OK 9 0,0 9,19 9,17 8,95 8,93,6-0,78 OK 10 3,90 33,08 9,18 3,95 9,05 1,4 0,56 OK 11 19,74 8,91 9,17 8,67 8,93,6-0,78 OK 1 0,1 9,33 9,1 9,17 8,96 1,8-0,44 OK 13 19,15 8,35 9,0 8,13 8,98,4-0, OK 14 19,54 8,74 9,0 8,54 9,00, 0,00 OK 15 17,14 6,4 9,10 6,08 8,94 1,8-0,67 OK 16 18,86 8,01 9,15 7,75 8,89,8-1, OK 17 18,51 7,64 9,13 7,41 8,90,5-1,11 OK 18 0,49 9,6 9,13 9,48 8,99 1,5-0,11 OK 19 4,3 33,48 9,16 33,33 9,01 1,6 0,11 OK 0 16,7 5,89 9,17 5,70 8,98,1-0, OK 1 16,69 5,88 9,19 5,73 9,04 1,6 0,44 OK 0,05 9,3 9,18 9,07 9,0 1,7 0, OK 3 17,17 6,4 9,5 6,17 9,00,7 0,00 OK 4 17,73 6,9 9,19 6,73 9,00,1 0,00 OK 5 0,36 9,64 9,8 9,37 9,01,9 0,11 OK 6 4,9 33,54 9,5 33,30 9,01,6 0,11 OK 7 19,91 9,10 9,19 8,99 9,08 1, 0,89 OK 8 16,37 5,64 9,7 5,36 8,99 3,0-0,11 OK 9 19,35 8,57 9, 8,38 9,03,1 0,33 OK 30 19,88 9,10 9, 9,05 9,17 0,5 1,89 OK MEDIA 9,18 MEDIA 8,98,13-0,1 OK SCARTO TIPO 0,05 SCARTO TIPO 0,0691 0,68 C.V. 0,5 C.V. 0,77 31,69 Giudizio 5

26 CALCOLO DELLE COMPONENTI D INCERTEZZA Incertezza dovuta alla Distribuzione di Poisson Incertezza di lettura delle piastre 6

27 Incertezza del conteggio dovuta alla distribuzione di Poisson Conta di colonie da una singola capsula Petri [ u ( z )/z ] 1 = z Conta di colonie da più capsule Petri [ u ( Z )/Z ] 1 = z i = 1 Z 7

28 Incertezza di conteggio dovuta alla lettura delle capsule Incertezza media di conteggio di capsule in singolo Rilettura in ordine casuale delle capsule Breve lasso di tempo tra le due letture Almeno una trentina di capsule Incertezza di conteggio nei risultati MPN Distinzione tubi positivi e negativi. Problema trascurabile. Mancanza di dati di letteratura 8

29 Incertezza di lettura delle capsule () - Caso di capsule in singolo sottoposte ad una seconda lettura dopo un breve intervallo di tempo Calcolo della varianza relativa Primo metodo (valori trasformati in ln): [ u ( )/ ] lett lett = n 1 (lnz 1 lnz n ) 9

30 Incertezza di lettura delle piastre (1) I N C E R T E Z Z A D I L E T T U R A A N A L I S T A C a l c o l o m e d i a n t e l a t r a s f o r m a z i o n e d e l l e c o n t e i n l o g a r i t m i n a t u r a l i N. P I A S T R A C O N T A 1 C O N T A ( l n c o n t a 1 - l n c o n t a ) , , , , , , , , , , n. d. n. d. n. d. 1 n. d. n. d. n. d. 1 3 n. d. n. d. n. d. 1 4 n. d. n. d. n. d. 1 5 n. d. n. d. n. d. 1 6 n. d. n. d. n. d. 1 7 n. d. n. d. n. d. 1 8 n. d. n. d. n. d. 1 9 n. d. n. d. n. d. 0 n. d. n. d. n. d. 1 n. d. n. d. n. d. n. d. n. d. n. d. 3 n. d. n. d. n. d. 4 n. d. n. d. n. d. 5 n. d. n. d. n. d. 6 n. d. n. d. n. d. 7 n. d. n. d. n. d. 8 n. d. n. d. n. d. 9 n. d. n. d. n. d. 3 0 n. d. n. d. n. d. T O T A L E 0, V a r i a n z a r e l a t i v a d i l e t t u r a d e l l ' a n a l i s t a 0, I n c e r t e z z a t ip o r e l a t i v a d i l e t t u r a d e ll'a n a l is t a 0,

31 CALCOLO DELLE COMPONENTI D INCERTEZZA Incertezza dovuta al dosaggio degli inoculi 31

32 Incertezza del volume totale inoculato (con diluizioni) Incertezza relativa del volume totale inoculato ( V ) u /V = u V ( V ) u Varianza del volume totale inoculato (V) 1 = n u (inoc) + f { [ ( ) ] [ ( ) ] } n u inoc /inoc + k u f /f 3

33 CALCOLO DELLE COMPONENTI D INCERTEZZA Incertezza dovuta al fattore di diluizione 33

34 Varianza relativa del Fattore di diluizione totale (k step) Caso di fattori di diluizione costanti [ u ( F )/F ] = k [ u ( f ) /f ] k = n di step di diluizione Caso di fattori di diluizione diversi nei singoli step [ ( ) ] u F /F = u( f ) [ ] [ ( ) ] [ ( ) ] /f + u f /f + u f /f + L

35 CALCOLO DELLE COMPONENTI D INCERTEZZA Eventuale Incertezza di conferma delle colonie 35

36 Prove di conferma (3) Applicazione di un coefficiente di conferma al numero di colonie presunte positive pˆ x = k n z pˆ = k n k = numero di colonie confermate n = numero di colonie presunte positive sottoposte a conferma z = numero di colonie presunte positive 36

37 Varianza relativa della distribuzione di Poisson (caso della conta confermata) [ u( x) /x] = z k n 37

38 Varianza relativa della somma delle conte confermate [ u( X )/X ] = 1 z i + 1 k i 1 n i che può anche essere scritto come [ u( X )/X ] Z = somma delle colonie presunte positive K = somma delle colonie confermate N = somma delle colonie presunte positive sottoposte a conferma = 1 Z + 1 K 1 N 38

39 Componenti dell incertezza Componenti incertezza Distribuzione di Poisson u(z)/z Volume totale inoculato u(v)/v Fattore di diluizione u(f)/f Lettura piastre u(l)/l Conferma colonie u(p)/p Quando contribuiscono all incertezza? Comune a tutti i conteggi (di facile calcolo, è inversamente proporzionale al numero di colonie contate) Comune a tutti i conteggi è legata alla ripetibilità di dosaggio degli inoculi. E richiesta una valutazione sperimentale della ripetibilità del dosaggio con le pipette. In presenza di diluizioni (è legata alla numerosità delle diluizioni allestite e alla ripetibilità di dosaggio dei volumi del diluente) E richiesta una valutazione sperimentale della ripetibilità del dosaggio del diluente. Comune a tutti i conteggi, richiede una preliminare valutazione della ripetibilità dei conteggi da parte degli operatori. Solo se richiesta la conferma delle colonie. In tale caso comprende e quindi sostituisce u(z)/z (distribuzione di Poisson) 39

40 Rapporto di calcolo delle componenti dell incertezza Incertezza relativa del risultato della prova Prove che non prevedono la conferma [ u(z)/z] + [ u(v)/v] + [ u(f)/f] [ u(l)/l ] u(y)/y = + RISULTATO FINALE Contenuto microbico del campione (risultato) N u(y)/y Incertezza relativa = Incertezza di misura = N * Incertezza relativa 40

41 Applicazione di calcolo ad un metodo normato Carica microbica mesofila in latte crudo (su mezzo di coltura Plate Count Agar) Diluizione 10-5 Diluizione 10-6 Conta colonie per piastra CALCOLO DELLE COMPONENTI DI INCERTEZZA Incertezza tipo relativa u Peso % 1. Fattore di diluizione 0,0 18,8 %. Volume totale inoculato 0,005 4,3 % 3. Distribuzione di Poisson delle cellule microbiche 0,049 36,6 % 4. Ripetibilità di lettura delle capsule 0,047 40,3 % INCERTEZZA TIPO RELATIVA COMPOSTA (u(y)/y) 0,0676 6,8 % Incertezza tipo composta della misura (u C ) Incertezza estesa U Risultato della prova,5 x ,17 x 10 7 ± 0,34 x

42 INCERTEZZA TIPO RELATIVA DELLE SINGOLE COMPONENTI PESO % DELLE SINGOLE COMPONENTI STIMATE Fattore di diluizione Volumi di inoculo Distribuzione di Poisson Lettura piastre Conferma colonie Fattore di diluizione % Volumi inoculo % Distribuzione di Poisson % Lettura Piastre % Conferma colonie % 0,09 0,0140 0,1796 0,0465 0, % 5% 67% 17% 0% 0,0358 0,017 0,0981 0,074 0, % 10% 43% 3% 0% 0,0358 0,017 0,94 0,074 0, % 6% 64% 0% 0% 0,0358 0,0146 0,0811 0,0489 0,0000 0% 8% 45% 7% 0% 0,09 0,0140 0,0000 0,0496 0, % 7% 0% 5% 53% 0,09 0,0140 0,0436 0,0468 0,0000 % 10% 33% 35% 0% 0,007 0,0181 0,13 0,0660 0,0000 7% 6% 67% 1% 0% 0,007 0,0181 0,1644 0,0599 0,0000 8% 7% 6% 3% 0% 0,007 0,0181 0,1474 0,0606 0,0000 8% 7% 60% 5% 0% 0,007 0,0198 0,0913 0,0655 0, % 10% 46% 33% 0% 0,007 0,0198 0,1741 0,0661 0,0000 7% 7% 6% 4% 0% 0,09 0,017 0,18 0,074 0,0000 9% 6% 64% 1% 0% 0,007 0,0198 0,13 0,0661 0,0000 6% 6% 67% 1% 0% 0,007 0,0198 0,1796 0,074 0,0000 7% 7% 61% 5% 0% 0,09 0,0140 0,0643 0,046 0, % 9% 4% 30% 0% 0,09 0,0140 0,0574 0,0469 0,0000 0% 9% 39% 3% 0% 0,09 0,0140 0,0894 0,0471 0, % 8% 50% 6% 0% 0,09 0,0140 0,0580 0,0469 0,0000 0% 9% 39% 3% 0% 0,09 0,0140 0,1768 0,0485 0, % 5% 66% 18% 0% 0,007 0,0181 0,357 0,0685 0,0000 6% 5% 69% 0% 0% 0,0358 0,0198 0,113 0,066 0, % 8% 51% 6% 0% 0,007 0,0198 0,1768 0,0659 0,0000 7% 7% 6% 3% 0% 0,09 0,0198 0,0976 0,0665 0, % 9% 46% 31% 0% 0,0547 0,0140 0,0806 0,0444 0,0000 8% 7% 4% 3% 0% 0,0547 0,0140 0,113 0,0469 0,0000 4% 6% 49% 1% 0% 0,0547 0,0140 0,098 0,0477 0,0000 6% 7% 44% 3% 0% 0,0547 0,0140 0,074 0,045 0,0000 9% 8% 39% 4% 0% 0,0506 0,0140 0,0449 0,0470 0,0000 3% 9% 9% 30% 0% 0,0506 0,0140 0,0806 0,0459 0,0000 6% 7% 4% 4% 0% 0,0547 0,0140 0,0985 0,0480 0,0000 5% 6% 46% % 0% 4

43 Metodo semplificato Basato sul calcolo del parametro G Metodo che non richiede il calcolo delle singole componenti di incertezza, ma che tiene conto delle componenti date da - distribuzione di Poisson - incertezza dei volumi di inoculo - incertezza di lettura delle piastre G n 1 n = i = 1 z i ln z v i i Z ln Z V 43

44 G - SIGNIFICATO (1) Il valore assunto da G permette di valutare se l operatore abbia lavorato in maniera accettabile e se i conteggi ottenuti alle distinte diluizioni siano da considerarsi congruenti tra loro Tale condizione si ottiene se G χ p = 0,95, n-1 44

45 G - SIGNIFICATO () - Valore atteso nella classica distribuzione di Poisson G /n-1 1,0 - Presenza di variabilità non imputabile alla sola distribuzione di Poisson G /n-1 > 1,0 - Presenza di problemi analitici G /n-1 > 5,0 In questo caso i dati dovrebbero essere riesaminati 45

46 Calcolo dell'indice X Calcolo dell'indice del logaritmo del rapporto di verosimiglianza G Indice di dispersione di Poisson ACCETTABILITA' CONTE IN DOPPIO OMOGENEITA' CONTE Valutazione di proporzionalità generale ACCETTABILITA' CONTE X della 1 a diluizione Giudizio X della a diluizione Giudizio G Giudizio omogeneità G /(n-1) Giudizio variabilità Omogeneità 1 a diluizione Giudizio 1 a dil Omogeneità a diluizione Giudizio a dil Proporzionalità Tra diluizioni Giudizio Tra diluizioni 1,815 OK 0,000 OK,3 OK 0,77 OK 1,84 OK 0,00 OK 0,49 OK n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. NC n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. NC n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 0,007 OK n.d. n.d. 0,0 OK 0,01 OK 0,01 OK n.d. n.d. 0,01 OK 6,4 Critico 0,091 OK 13,73 NC 4,58 Critico 6,5 Critico 0,09 OK 7,39 NC 0,075 OK 1,043 OK 1,13 OK 0,38 OK 0,08 OK 1,05 OK 0,01 OK n.d. n.d. 0,000 OK 1,06 OK 0,53 OK n.d. n.d. 0,00 OK 1,06 OK n.d. n.d. 3,571 OK 4,09 OK,05 Critico n.d. n.d. 3,96 Critico 0,13 OK n.d. n.d.,000 OK,11 OK 1,06 Critico n.d. n.d.,09 OK 0,0 OK n.d. n.d. n.d. n.d. 0,1 OK 0,1 OK n.d. n.d. n.d. n.d. 0,1 OK n.d. n.d. n.d. n.d. 0,00 OK 0,00 OK n.d. n.d. n.d. n.d. 0,00 OK n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 0,00 OK 0,00 OK n.d. n.d. n.d. n.d. 0,00 OK n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. #DIV/0! #DIV/0! 0,115 OK 3,40 OK 3,86 OK 1,9 Critico 0,1 OK 3,31 OK 0,43 OK 0,81 OK 0,333 OK 1,16 OK 0,39 OK 0,81 OK 0,33 OK 0,0 OK 0,877 OK 0,091 OK 0,98 OK 0,33 OK 0,88 OK 0,09 OK 0,01 OK 0,948 OK 6,59 Critico 7,48 OK,49 Critico 0,95 OK 6,53 Critico 0,00 OK 0,533 OK 0,000 OK 0,88 OK 0,9 OK 0,53 OK 0,00 OK 0,35 OK n.d. n.d. 1,000 OK 0,31 OK 0,31 OK n.d. n.d. n.d. n.d. 0,31 OK n.d. n.d. n.d. n.d., OK, Critico n.d. n.d. n.d. n.d., OK n.d. n.d. n.d. n.d. 0,00 OK 0,00 OK n.d. n.d. n.d. n.d. 0,00 OK n.d. n.d. n.d. n.d. 0,03 OK 0,03 OK n.d. n.d. n.d. n.d. 0,03 OK 0,94 OK 1,087 OK 7,45 OK,48 Critico 0,9 OK 1,10 OK 5,43 Critico 0,35 OK 0,143 OK 0,50 OK 0,17 OK 0,35 OK 0,14 OK 0,00 OK 1,579 OK 1,000 OK,86 OK 0,95 OK 1,58 OK 1,0 OK 0,6 OK 0,150 OK 0,167 OK,84 OK 0,95 OK 0,15 OK 0,17 OK,5 OK 5,556 Critico 4,61 Critico 9,9 Critico 3,31 Critico 5,57 Critico 4,33 Critico 0,0 OK 0,007 OK,88 OK 3,64 OK 1,1 Critico 0,01 OK,97 OK 0,67 OK,368 OK 0,000 OK,61 OK 0,87 OK,38 OK 0,00 OK 0,3 OK 46

47 Metodo semplificato [ ] u(x)/ x [ u(f)/f] u(y)/y = + In cui G n 1 1 u = n 1 Z [ ( x ) / x ] Il metodo semplificato permette di valutare l incertezza relativa che include tutte le componenti casuali che influenzano le conte in un sistema rivelatore multiplo 47

48 Confronto tra metodi di calcolo Tabella 8c Confronto degli intervalli dell incertezza ottenuti applicando i diversi approcci di calcolo Risultato,5 x 10 7 UFC Incertezza tipo composta Incertezza estesa (k = ) Limite inferiore Limite superiore Metodo metrologico 0,17 x 10 7 ± 0,34 x 10 7, x 10 7,8 x 10 7 Metodo semplificato 0,16 x 10 7 ± 0,3 x 10 7, x 10 7,8 x 10 7 ISO 718 / /,3 x 10 7,7 x

49 Diverse combinazioni di conta di colonie Medesimo conteggio microbico per unità di campione Diversa ampiezza dell incertezza di misura Diluizioni Risultato (UFC) G n 1 Incertezza estesa U Limite inferiore Limite superiore n ,5 x ,05 ± ,4 x 10 7,6 x ,5 x ,99 ± ,3 x 10 7,7 x ,5 x ,86 ± ,0 x ,0 x ,5 x ,57 ± ,8 x , x 10 7 Intervallo di fiducia (ISO 718): lim.inf.,3 x 10 7 lim.sup..7 x

50 Efficacia del metodo semplificato Il metodo semplificato di calcolo dell incertezza a differenza della ISO 718, esprime valori di incertezza con ampiezza che è funzione della qualità della prestazione analitica che ha prodotto il risultato 50

51 In c e r te z z a E S T E S A (s e c o n d o M ik e s J 4 / ) ± Inc.spec.lettura In c e r te z z a e s te s a (m e to d o s e m p lific a to M ik e s J 4 / ) ± O m o g e n e ità 1 a d ilu iz io n e O m o g e n e ità a d ilu iz io n e P r o p o r z io n a lità T r a d ilu iz io n i O m o g e n e ità T O T A L E 5,3 E + 0 4,5 E + 0 O K O K O K O K,7 E n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 9,3 E n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 1,5 E ,3 E O K n.d. O K O K,7 E ,1 E C ritic o O K N C N C 3,4 E ,9 E O K O K O K O K 8, E ,7 E n.d. O K O K O K 1,1 E + 0 1,5 E + 0 n.d. C ritic o O K O K 1, E + 0 1, E + 0 n.d. O K O K O K,5 E + 0 8, E n.d. n.d. O K O K 1,1 E + 0 1, E n.d. n.d. O K O K 9,8 E + 0 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 9,0 E ,3 E n.d. n.d. O K O K 1,1 E + 0 n.d. n.d. n.d. # D IV /0! n.d. 1,9 E ,7 E O K O K O K O K, E ,3 E O K O K O K O K 1, E ,7 E + 0 O K O K O K O K, E + 0 3,6 E O K C ritic o O K O K 5,4 E + 0,9 E + 0 O K O K O K O K 7,4 E ,0 E n.d. n.d. O K O K 1,8 E + 0 4,3 E n.d. n.d. O K O K 1,1 E + 0 1,3 E n.d. n.d. O K O K,4 E ,6 E + 0 n.d. n.d. O K O K 1,5 E ,9 E O K O K C ritic o O K 9,6 E ,1 E O K O K O K O K 1,3 E ,1 E O K O K O K O K 1,8 E ,5 E O K O K O K O K 3,8 E ,3 E C ritic o C ritic o O K C ritic o 1,5 E ,4 E O K O K O K O K 1, E ,0 E O K O K O K O K 51

52 Valutazione dell incertezza di misura in ambito microbiologico Grazie per l attenzione Dino Spolaor dino.spolaor@venetoagricoltura.org 5

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