BIOCHIMICA e BIOTECNOLOGIE degli ALIMENTI

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1 Seconda Università degli Studi di Napoli DiSTABiF Anno Accademico Corso di Laurea Magistrale in SCIENZE DEGLI ALIMENTI E DELLA NUTRIZIONE UMANA Insegnamento di BIOCHIMICA e BIOTECNOLOGIE degli ALIMENTI Prof. Augusto Parente Lezione

2 Riossidazione di NADH citoplasmatico - Spola malato-aspartato - Spola del glicerolfosfato Transamminazioni

3 L-

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5 Sintesi di NADPH (x biosintesi acidi grassi, riduzione di GSSG, ecc.)

6 1- Il citrato viene portato all esterno dei mitocondri e scisso in Acetil-CoA e ossalacetato. Quest ultimo viene trasformato in malato che, ad opera dell enzima malico da piruvato, CO 2 e NADPH+H + : Il L acetil S-CoA verrà utilizzato per la sintesi degli ACIDI GRASSI che utilizza appunto NADPH+H + come agente riducente 2- Via dei pentoso-fosfati

7 La sintesi di NADPH Enzima malico

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9 Le reazioni anaplerotiche o di riempimento Piruvato carbossilasi 1 Piruvato + HCO - 3 ATP Biotina ADP + Pi Ossalacetato 2 Fosfoenolpiruvato + HCO - 3 PEP carbossichinasi + GDP Ossalacetato + GTP 3 Fosfoenolpiruvato + HCO - 3 PEP carbossilasi Ossalacetato + Pi 4 Piruvato + HCO - 3 Enzima malico NAD(P)H NAD(P)+ Malato

10 Enzimi coinvolgenti amminoacidi - Glutammico deidrogenasi - Reazione di transamminazione

11 2 PEP carbossichinasi

12 3 Attivata da F-1,6-bisfosfato 1 4

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14 Ciclo del gliossilato Ciclo del gliossilato (nei semi oleosi)

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16 LA VIA DEI PENTOSO-FOSFATI SHUNT DELL ESOSOMONOFOSFATO

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18 EPIMERI 3 3 D-Ribulosio L-Ribulosio 3 3 D-Xilulosio L-Xilulosio

19 ADP+ P i ATP Prodotti biosintetici ridotti REAZIONI BIOSINTETICHE Precursori ossidati NADP + NADPH + H + Sostanze ridotte CATABOLISMO Prodotti ossidati NAD + NADH + H + H 2 O FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA O 2 ATP ADP+ P i

20 ADP+ P i ATP Prodotti biosintetici ridotti REAZIONI BIOSINTETICHE Precursori ossidati NADP + NADPH + H + Sostanze ridotte CATABOLISMO Prodotti ossidati NAD + NADH + H + H 2 O FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA O 2 ATP ADP+ P i

21 Catena di trasporto degli elettroni e fosforilazione ossidativa; Formazione di ROS

22 Provenienza dei coenzimi ridotti - Dalla glicolisi aerobica: trasferimento di NADH nei mitocondri mediante le spole malato-aspartato e glicerolfosfato (NADH/FADH 2 ) - Dalla piruvato deidrogenasi (NADH) - Dal ciclo di Krebs (NADH e FADH 2 ) - Dalla b-ossidazione degli acidi grassi (FADH 2 e NADH)

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24 Componenti proteici che fanno parte della catena di trasporto degli elettroni Complesso Subunità Massa (kda) Gruppo(i) prostetico(i) I NADH - ubichinone deidrogenasi II III Succinicoubichinone riduttasi Ubichinolocitocromo c riduttasi 43 (14)* 850 FMN, Fe-S (22-24 in 5-8 centri) FAD, Fe-S (8 in 3 centri) Eme (Citocromo b 560 ) Fe-S (2), altri citocromi Citocromo c 1 13 Eme IV Citocromo ossidasi 13 (3-4)* 160 Eme a 3, a Cu A, Cu B V Fo-F1 ATP sintasi (ATPasi) 9 > 500 (α, β, γ) 2, δ, ε macchina rotante *Fra parentesi i numeri di subunità dei complessi batterici

25 -Sintesi di ATP - Sintesi di H 2 O

26 Formazione di RADICALI LIBERI e catena di trasporto degli elettroni

27 Superossido La velocità di entrata degli elettroni nella catena respiratoria e la velocità di trasferimento degli elettroni lungo la stessa non sono uguali.

28 Specie Reattive dell Ossigeno (ROS) e radicali liberi Leuzzi et al. 274; Cozzani-Dainese, 255 La produzione biologica di radicali e ROS non è solo una conseguenza di incompleti trasferimenti di e - all O 2, ma anche di reazioni metaboliche che utilizzano tali specie chimiche per specifiche funzioni. R O S Ossigeno singoletto: 1 O 2 Radicale superossido: O - 2 cattura di un e - Radicale idrossile: OH Radicale alcossido: RO Radicali liberi Radicale perossido ROO Perossido d idrogeno: H 2 O 2 Perossidi lipidici: LOOH

29 FUNZIONE di RADICALI e ROS Le funzioni sono solo in parte chiarite PRODUZIONE di H 2 O 2 Vie metaboliche che portano ad acido URICO

30 Xantina ossidasi -flavoenzima - molibdeno - 4 centri Fe-S - l accettore di e - è O 2 molecolare

31 PRODUZIONE di H 2 O 2 nei perossisomi La b-ossidazione avviene anche nei perossisomi Perossisoma Cellule animali: mitocondri Cellule vegetali Nelle cellule vegetali il sito principale della b-ossidazione degli acidi grassi sono i perossisomi delle foglie e nei gliossisomi dei semi in germinazione. La differenza con la b-ossidazione che avviene nei mitocondri è a livello della prima tappa: nei perossisomi la flavoproteina deidrogenasi che genera il doppio legame trasferisce direttamente gli elettroni all ossigeno, formando perossido d idrogeno H 2 O 2.

32 Il perossido d idrogeno è un forte ossidante. Esso viene scisso in H 2 O e O 2 dall enzima catalasi (numero di turnover (kcat) = 4x10 7 )

33 UTILIZZAZIONE DI H 2 O 2 nella BIOSINTESI DEGLI ORMONI TIROIDEI Nella tiroide H 2 O 2 è utilizzato, attraverso una perossidasi, per la iodazione degli ormoni tiroidei.

34 H 2 O 2 e altri perossidi possono indurre l espressione di geni controllati dal fattore di trascrizione citoplasmatico NF-kB. Viene rimossa una subunità inibitoria ed il fattore attivato migra nel nucleo. Radicale superossido O 2 - Il radicale superossido è generato sia da meccanismi di riduzione univalente dell O 2, sia da ossidasi presenti in diverse sedi. Esso è capace di produrre radicali e ROS. CONCORRE a vitali funzioni biologiche come la difesa da agenti infettivi. Infatti, durante il processo di fagocitosi (cioè inglobamento e distruzione di microrganismi Infettivi e virus da parte di cellule ematiche della serie bianca), avviene una esplosione respiratoria), cioè la rapida generazione di alte concentrazioni di radicale superossido O 2 - che a sua volta produce altri radicali e ROS che inattivano rapidamente l agente infettivo. I fagociti attivati producono anche acido ipocloroso HOCL che reagendo con il radicale superossido genera il radicale idrossile. HOCl + O 2 - OH + Cl - + O 2.

35 Specie reattive dell AZOTO L ossido nitrico NO ha funzioni anche più importanti ed estese. 1- Effetto rilassante sulla muscolatura liscia dei vasi: vasodilatazione e conseguente ipotensione; controllo della pressione arteriosa; 2- Reazione di NO con. O 2 - riduce la concentrazione del radicale vasodilatatore e quindi potrebbe avere un ruolo patogenetico nell instaurarsi dell ipertensione arteriosa. 3- Un prodotto di reazione 2, il perossinitrito, (OONO - (NO 3 - ) potrebbe ossidare residui tiolici essenziali per l attività enzimatica e/o modificare attraverso idrossilazione/nitrazione amminoacidi aromatici coinvolti nei meccanismi molecolari di trasmissione del segnale.

36 DANNI DA RADICALI LIBERI In generale, gli effetti delle ROS sulle cellule sono spesso: - Danno al DNA - Perossidazione dei lipidi. Ossidazione di acidi grassi polinsaturi nei lipidi; - Ossidazione degli amminoacidi nelle proteine; - Inattivazione di specifici enzimi attraverso l ossidazione di cofattori. Il 2% circa dell ossigeno che respiriamo va a generare radicale superossido e altre ROS. Sono anche presenti eventi patologici (infezioni, reazioni infiammatorie, ecc.) Il radicale superossido O - 2 è di per sé poco tossico, ma può generare acqua ossigenata, radicale idrossile e perossinitrito. Acqua Ossigenata: fino alla [ µm ] ha scarse capacità ossidanti. Ma può attaccare alcuni enzimi quando raggiunge [50 µm ]. La pericolosità di O - 2 e H 2 O 2 è legata alla generazione di OH. Il radicale idrossile OH è prodotto anche dalle radiazioni ionizzanti, sia di origine naturale (radon, radiazioni cosmiche), sia artificiali (raggi X, radiazioni, ecc) che decompongono la molecola dell acqua (radiolisi) generando OH. Questo radicale è estremamente reattivo e pur avendo un raggio d azione molto breve, può innescare reazioni a catena, provocando gravi danni alle membrane biologiche (perossidazione dei lipidi), alle proteine e al DNA:

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38 Il radicale idrossile OH può essere generato anche a partire da H 2 O 2 in presenza di ioni Fe 2+ e Cu 2+ (reazione di Fenton) H 2 O 2 + Fe 2+ (o Cu + ) Fe 3+ (o Cu 2+ ) + OH + OH - Pertanto si ritiene che la concentrazione di questi ioni in forma libera rappresenti un fattore critico nel meccanismo di danno alle biomolecole e alle biostrutture da parte di OH.

39 Gli enzimi che in condizioni normali, difendono le cellule dal danno delle ROS: - Superossido dismutasi - Catalasi - Lattoperossidasi - Glutatione perossidasi - Perossiredossine Un ruolo importante come antiossidanti cellulari è svolto da molecole come: Vitamina C (acido ascorbico), - Frutta e verdura Vitamina E (tocoferoli e tocotrienoli), - Oli vegetali Antiossidanti polifenolici (resveratrolo, flavonoidi) - vino rosso, tè, caffè, soia, origano, frutta, olio d'oliva, cioccolato fondente con cacao amaro Carotenoidi (licopene, carotene) - Frutta e verdura Acido urico Glutatione

40 Glutatione ridotto GSH Glutatione ossidato: GSSG